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摘 要 WRKY基因家族编码是植物特有的转录因子，根据WRKY的保守结构域和进化关系可分为GroupⅠ、Ⅱ和 Ⅲ，其中GroupⅡ进一步分为Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd、Ⅱe。Group IIa基因之间具有很高的同源性，基因功能多样，关系复杂。对GroupⅡa基因的结构和在植物抗病性与环境胁迫中的作用，以及主要调控机制等方面研究进行综述，为GroupⅡa基因的后续研究提供参考。
关键词 WRKY转录因子；基因进化；胁迫；调控机制
中图分类号 S432. 2 文献标识码 A
Abstract WRKY gene family encodes plant-specific transcription factors. According to the conservative domain and the evolutionary relationship， the WRKY family can be divided into GroupⅠ， Ⅱ and Ⅲ， GroupⅡ can be further divided into Ⅱa，Ⅱb，Ⅱc，Ⅱd and Ⅱe. There are very high sequence homolog， diverse gene functions and complicated relationship among GroupⅡa genes. In these paper， we review recent progress in the genes structure， the functions in plant disease resistance and environmental stress， and the regulation mechanisms of GroupⅡa WRKY.
Key words WRKY transcription factors； Gene structure； Stress； Regulation mechanisms.
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.03.031
转录因子（transcription factor），又称反式作用因子（transacting factor），是指能够结合在靶基因上游（启动子区）顺式作用元件上的蛋白质，这些蛋白质能调控靶基因的转录。转录因子可以调控核糖核酸聚合酶（RNA聚合酶，或叫RNA合成酶）与DNA模板的结合，即典型的转录因子具有DNA结合域和核定位信号等功能域。植物常见转录因子包括WRKY[Trp（W）-Arg（R）-Lys（K）-Tyr（Y），色氨酸-精氨酸-赖氨酸-酪氨酸]、ABI3/VP1、AP2/EREBP、MADS、MYB、NAC（又名NAM，ATAF，CUC2）等约70个家族，约占植物基因总数的10%[1-2]。其中植物特有的转录因子家族有WRKY、NAC（CUP-SHAPED COTYLEDON 2）、ERF[（APETALA 2（AP2）/ethylene-responsive element binding factor）]、NAM（NO APICAL MERISTEM）、NAC、ABI3（ABSCISIC
ACID INSENSITIVE 3）/VP1（VIVIPAROUS1）、ARF （auxin response factor）、SBP（SQUAMOSA-promoter binding protein）[3]。拟南芥中WRKY氨基酸的长度从109（AtWRKY43）到1 895（AtWRKY19）个，序列长度相差最大可达10余倍，其中保守结构域约含有60个氨基酸序列，包括N端的WRKY到C端的Cx4-5Cx22-23HxH或Cx7Cx23HxC保守序列。WRKY的保守结构域也是转录因子的DNA结合域，WRKY的名字也源自WRKY这一保守序列[4-5]。在少数的WRKY蛋白中，WRKY序列被WRRY、WRSY、WKRY、WVKY取代[6]。WRKY的C端是一个保守的锌指结构，其锌指结构为Cx4-5Cx22-23HxH或Cx7Cx23HxC。根据蛋白结构域的数量可将WRKY分为GroupⅠ、Ⅱ和 Ⅲ，GroupⅠ具有2个WRKY结构域，GroupⅡ和GroupⅢ只有1个WRKY结构域；GroupⅠ、Ⅱ的锌指结构为Cx4-5Cx22-23HxH，而GroupⅢ锌指结构为Cx7Cx23HxC。GroupⅡ基因根据氨基酸的一级结构可再进一步分为 Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd、Ⅱe[7-8]。不同的物种中，WRKY的数量不一样，低等植物种类较少，从几个到几十个不等；高等植物WRKY数量比较多，有几十到上百个不等[9-10]。WRKY在植物抗病、抗逆等方面的调控作用取得了很多的研究成果，并且已有一些研究综述，但这一大家族中的GroupⅡa基因成员之间同源性高，关系紧密而复杂，对这一细分基因类型的结构、功能进行总结可为后期研究提供参考。
1 GroupⅡa WRKY转录因子结构
WRKY转录因子的发现可追溯到20年前，Ishiguro等[11]第一次发现WRKY蛋白具有结合DNA的特性，并命名为SPF1（SWEET POTATO FACTOR1），第2个报道的WRKY是在发芽过程中调控基因表达的DNA结合蛋白ABF1和ABF2[12]。第3个报道的是从欧芹（Petroselinum crispum）中鉴定的WRKY1、WRKY2、WRKY3，并首次创造了“WRKY”转录因子一词[4]。
据Yamasaki等[3]的研究，WRKY可能从简单的微生物归位内切酶C2H2 ZnF 或ββα-metal开始进化，到了单细胞真核生物就形成最原始的WRKY，再进化形成绿藻的WRKY，最后进化形成高等植物的WRKY。Zhang等[7]分析认为GroupⅠ WRKY属于比较原始的类型，GroupⅡ由GroupⅠ进化而来，GroupⅢ由GroupⅡd和GroupⅡe进化而来（图1）。比较原始的贾第鞭毛虫Giadia lamblia只具有GroupⅠ类型基因，到了绿藻则具备了GroupⅠ和GroupⅢ类型的WRKY，到藓类（Physcomitrella patens）就具备了GroupⅠ、GroupⅡ、GroupⅢ类型的WRKY，但GroupⅡ类型还不完全，还缺少其中的GroupⅡa和GroupⅡe，被子植物则具备了种类齐全的WRKY（表1）。 GroupⅡa WRKY蛋白保守结构域包括LZ、WRKYGQK和Cx5Cx23HNH，它们都能影响WRKY的结合能力（图2）。LZ（Leu zipper）结构域中亮氨酸（Leu）数量的多寡直接影响到蛋白的结合能力，这一现象在被削弱LZ结构域之后的AtWRKY18酵母双杂实验中已经得到印证，而AtWRKY60的LZ结构域中Leu在2个位置上被其它蛋白所取代则可能是导致其蛋白结合能力较AtWRKY40和AtWRKY18低的原因[17]。2005年，Yamasaki等首次报道了WRKY结构域的溶液构象结构，由4个β-折叠（β-sheet）和Cys/His锌指构成一个锌结合口袋（zinc-binding pocket）。WRKYGQK一般位于N端的β-折叠，构成蛋白的突出面，伸入DNA大沟并与DNA接触，并结合到W-box上[18-20]。野燕麦（Avena fatua）GroupⅡa WRKY转录因子ABF2结合蛋白可识别并结合到W-box（TTGACC/T），但是在加入二价金属失活剂1，10-O-菲咯啉螯合物（1，10-O-phenanthroline）可使结合不能进行，支持了锌指结构的存在[12]。
2 GroupⅡa WRKY转录因子功能
2.1 GroupⅡa WRKY转录因子与植物的抗病性
目前对GroupⅡa WRKY转录因子在调控植物抗病功能方面的研究主要通过抗病调控网络分析、病原菌或病原激发子诱导内源基因的表达分析、过量表达目的基因、突变目的基因（gene knockout）以及干涉目的基因（Gene knockdown）等几种方式。GroupⅡa WRKY通过调控重要的抗病调控网络中的关键基因或蛋白来调控植物的抗病性。对Group Ⅱa WRKY调控植物抗病性的认识最初得益于拟南芥NPR1（NON EXPRESSOR OF PATHOGENESIS-RELATED GENES1）基因的研究，对NPR1启动子分析发现它具有WRKY结合的W-box，凝胶迁移滞后实验（electrophoretic mobility shift assays，EMSA）证明了AtWRKY18可结合到NPR1的W-box上[21]，NPR1通过调控下游PR1（pathogenesis-related）广泛调控植株的抗病性[22-24]，因而AtWRKY18可能通过NPR1来调控植物抗病性[25]。EDS1（ENHANCED DISEASE SUSCEPTIBILITY 1）是拟南芥中另一个调控植株对活体营养型和半活体营养型病害抗性的网络[26]，EDS1的启动子区亦具有W-box，ChIP（chromatin
immunoprecipitation）实验也证明了AtWRKY40可结合到EDS1的W-box上[27]。除了通过结合到W-box上调控目的基因外，GroupⅡa WRKY转录因子还与一些调控网络中重要的抗病蛋白互作，大麦HvWRKY1、HvWRKY2与拟南芥AtWRKY18、AtWRKY40同源，其编码的蛋白则通过与MLA（mildew-resistance locus A）互作来调控白粉病抗性[28]。
研究GroupⅡa WRKY在抗病调控网络中的角色十分有助于学者对基因功能的了解，但是目前的研究还不能完全诠释基因的表达现象。在病源诱导内源基因表达方面，很多病原菌都能诱导GroupⅡa WRKY基因的表达，但在不同病原菌或不同诱导条件下基因的表达特点不一样，一方面不同病源菌诱导相同基因表达量最高的时间点不一样，另一方面同一病原菌诱导不同的基因表达强度和时间点也不一样。拟南芥3个GroupⅡa WRKY基因受细菌性叶斑菌（Pseudomonas syringae pv. Tomato DC3000）和灰霉菌（Botrytis cinerea）诱导表达特点明显不同，AtWRKY18同时受到细菌性叶斑菌和灰霉菌诱导上调表达明显，而AtWRKY40仅受灰霉菌诱导，AtWRKY60仅受细菌性叶斑菌诱导，但后两者诱导强度均不及AtWRKY18。在接种不同的病原菌试验中，AtWRKY18表达量最高的时间点出现在接种细菌性叶斑菌后4～8 h，而灰霉菌在接种后的24～72 h[17]。水稻中，GroupⅡa基因有4个成员OsWRKY28、OsWRKY62、OsWRKY71和OsWRKY76，它们都受稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）和几丁质激发子（chitin elicitor）的诱导上调表达，OsWRKY28、OsWRKY71受几丁质诱导表达在2 h内达到最高，而OsWRKY62、OsWRKY76则在4～8 h内[29]，并且诱导强度明显较前者高[30]。结合调控网络分析和大量的内源基因表达分析，可增进了解上下游基因之间、不同信号通路之间关系，GroupⅡa WRKY基因在病原菌诱导表达中表现出来的复杂现象，可能与不同病菌对植物为害所依赖的信号通路不一样，而不同的Group Ⅱa WRKY基因在相同或不同的网络中所扮演的角色也不一样。
过量表达目的基因可放大基因的功能，便于学者观察基因功能及下游基因受调控的情况。在基因过量表达试验中，AtWRKY18正调控细菌性叶斑病的抗性，AtWRKY40和AtWRKY60则起到负调控的作用。过量表达AtWRKY18增强成熟拟南芥植株（5～6周）抗细菌性叶斑病，并提高了抗病相关基因PR1、PR2、PR5的表达，但幼龄期转基因植株即不抗DC3000，也不提高前述抗病相关基因的表达[17，31]。单独过量表达AtWRKY40或AtWRKY60的植株对DC3000抗性没有影响，同时过量表达AtWRKY18AtWRKY40或AtWRKY18AtWRKY60两个基因植株反而更感DC3000，但是同时过表达AtWRKY40AtWRKY60则没有影响。在表型上过量表达AtWRKY40和过量表达AtWRKY18的表型相似，即出现较多锯齿状叶，而过表达AtWRKY60则没有了出现表型上的明显变化[17]。过量表达OsWRKY71增强水稻植株抗白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae，简称Xoo），并提高抗病相关OsPR1、OsNPR1的表达[32]。过量表达试验进一步说明了NPR1信号通路是GroupⅡa WRKY对植物抗病性的调控重要途径之一，一些过量表达GroupⅡa WRKY基因试验中能观察到NRP1的下游基因PR1明显上上调表达。而一部分试验并没有观察PR基因的明显变化，其中原因包括不同的GroupⅡa WRKY基因成员功能不同，所依赖信号通路也不一样；部分GroupⅡa WRKY基因成员表达具有时空的特点，基因功能只能在特定的时间和空间发生。 通过突变或干涉目的基因验证基因功能是最有效的手段。在突变体中，拟南芥GroupⅡa WRKY基因调控细菌性叶斑病抗性的作用和基因成员之间相互影响的关系得到进一步证实，AtWRKY40或AtWRKY60突变（即失去负调控作用）后提高细菌性叶斑病的抗性，但只有在WRKY18也被突变（即失去正调控作用）的情况下发生。目前，拟南芥GroupⅡa WRKY基因的单突变体、双突变、三突变均已获得，AtWRKY18、AtWRKY40、AtWRKY60中任何一个基因突变对细菌性叶斑菌和灰霉菌的抗性影响不明显，但是双突变体wrky18wrky40、wrky18wrky60或三突变体wrky18wrky40wrky60表现出抗细菌性叶斑菌，而感灰霉菌[17]。双突变体wrky18wrky40还表现出抗白粉病，而AtWRKY18、AtWRKY40单突变体和野生型拟南芥均不抗白粉病[27]。对水稻GroupⅡa WRKY基因进行干涉后，植株表现抗白叶枯病菌Xoo[33]。
GroupⅡa WRKY基因除了通过参与某些植物抗病信号通路来调控植物抗病性外，还直接调控了植物抗性物质植保素的合成过程。在植物植保素合成调控方面，棉花GaWRKY1可结合到杜松烯合成酶CAD[（+）-δ-cadinene synthase]基因启动了的W-box上，调控倍半萜类（Sesquiterpene）植保素的合成，GaWRKY1受病原菌Verticillium dahliae诱导上调表达[34]。拟南芥无论接种还是未接种白粉菌，wrky18 wrky40中的camalexin（一种植保素）也极显著高于野生型。接种白粉菌后，EDS1信号通路相关基因EDS1、PAD4、CYP71A13上调表达，尤其是wrky18 wrky40中明显高于野生型。说明camalexin合成与EDS1通路在拟南芥白粉菌侵入前的抗病作用十分重要[27]。
2.2 GroupⅡa WRKY基因与植物环境胁迫
GroupⅡa WRKY基因参与植物的非生物胁迫包括了温度、水分等的胁迫，其作用方式主要通过调控胁迫相关的信号通路或调控胁迫相关的一些关健基因。脱落酸ABA信号途径参与了干旱、冷、盐等植物非生物胁迫反应[35]，GroupⅡa WRKY转录因子在调控拟南芥的非生物胁迫及ABA信号通路中作用已经有了较为深入的认识，AtWRKY40受到外源ABA处理及盐、干旱、冷胁迫诱导上调表达[36]。目前，AtWRKY40或其同源基因在非生物胁迫中调控机制包括以下几方面，一是它直接与ABA受体蛋白ABAR互作或直接结合到ABA信号通路关键基因的W-box元件上[10，37-39]；二是结合到胁迫应答基因的W-box上；三是结合到胁迫代谢途径相关基因的W-box上。编码线粒体重要蛋白的3个关键基因AOX1a（alternative oxidase 1a）、NDB2 （NADH dehydrogenase B2）和BCS1（AAA ATPases）的启动子区都具有W-box元件，这3个基因与线粒体反向调控介导（mitochondrial retrograde regulation）胁迫反应密切相关，AtWRKY40蛋白结合在这3个基因的W-box上，调控了这些基因的表达[40]。烟草和大豆的GroupⅡa WRKY基因也参与了胁迫应答[41]。HvWRKY38与AtWRKY40、OsWRKY71、ABF2同源性很高，低温处理和干旱明显诱导该基因的表达[42]。低温诱导OsWRKY28和OsWRKY62下调表达，盐胁迫诱导OsWRKY28上调表达[43]。牛耳草（Boea hygrometrica）BhWRKY1属于GroupⅡa WRKY基因（与AtWRKY60、OsWRKY71同源），干旱处理和ABA处理均诱导该基因上调表达，ChIP等的实验表明，BhWRKY1特异地结合在肌醇半乳糖苷合成酶GolS（galactinol synthase）基因启动子W-box上，GolS是催化棉子糖家族寡糖RFOs（raffinose family oligosaccharides）生物合成的第一个步骤，而RFOs是重要的渗透调节物质，在植物干旱、低温等非生物胁迫中起十分关键的作用[44]。蒺藜科Larrea tridentata植物是沙漠中极耐干旱的常绿灌木，LtWRKY21与AtWRKY40同源，它调控ABA诱导基因HVA22及ABA信号通路重要基因VP1、ABI5的表达[45]。
2.3 GroupⅡa WRKY基因与植物生长调节剂的关系
目前研究显示，GroupⅡa WRKY基因与大部分的植物生长调节剂都有直接或间接的联系。NPR1[46-47]和EDS1[26]对植物抗病性的调控都常依赖于水杨酸SA（salicylic acid）信号通路，SA诱导AtWRKY40[17]和AtWRKY18上调表达，但过量表达AtWRKY18并没有提高植株的SA含量[31]。同属于GroupⅡa的水稻OsWRKY62[30，48]、OsWRKY71[32]、OsWRKY76[48]、葡萄VvWRKY3[49]亦受SA或SA信号通路激活药剂BTH（Benzothiadiazole）处理诱导上调表达。NPR1还是联系SA和茉莉酸JA（jasmonic acid）/乙烯ET（ethylene）信号通路之间的重要节点[50]，因此很多参与这信号通路的基因同时受到SA和JA的诱导表达，例如OsWRKY71还受茉莉酸甲酯MeJA和1-氨基环丙烷-1-羧酸ACC（ET的前体）处理诱导上调表达[32]；棉花GroupⅡa WRKY基因GaWRKY1受MeJA和SA诱导表达[34]。JA信号通路中一些重要的基因如LOX2， AOS， JAZ7， JAZ8和 JAZ10等的启动子区都具W-box，实验也证实了AtWRKY40可结合到JAZ8的W-box上[27]。MeJA处理野生型拟南芥均能诱导AtWRKY18、AtWRKY40、AtMYC2上调表达，在JA信号通路被阻断的coi1突变体中则不能被诱导表达[51]，而AtMYC2、COI1是JA信号通路中的重要基因[52]，进一步说明了GroupⅡa WRKY基因与JA信号通路之间的密切联系。拟南芥GroupⅡa WRKY基因与ABA信号通路的联系体现蛋白和基因两个层面，在ABA刺激下，应用酵母双杂交（yeast two-hybrid）、CoIP（coimmunoprecipitation）、BiFC（bimolecular uorescence complementation）和生物化学（biochemical approaches）技术在体外或体内都证实了AtWRKY40蛋白与ABA受体蛋白AtABAR（ABA receptor）的C端互作，AtWRKY18、AtWRKY60亦与AtABAR互作，但是强度不及AtWRKY40，而无ABA刺激或无效浓度的ABA则没有互作的现象发生。AtWRKY40蛋白还可结合到ABI4和ABI5启动子区的W-box上，并抑制这2个基因的表达[38]，而ABAR、ABI4和ABI5等都是ABA信号通路中的重要基因[53]。不同GroupⅡa WRKY基因成员或不同的物种上的同源基因受植物生长调节剂的诱导或调控又有所不同，在ABA、IAA、GA3、MeJA、SA处理中，水稻4个GroupⅡa WRKY基因只有OsWRKY71受ABA诱导表达，在ABA、IAA、GA3、MeJA、SA处理中，水稻OsWRKY28、OsWRKY62和OsWRKY76均不受ABA诱导表达，OsWRKY28仅受SA诱导上调表达；OsWRKY62受IAA、GA3、SA诱导上调表达；OsWRKY76受IAA、GA3、MeJA诱导上调表达[43]。虽然OsWRKY71只受到ABA的诱导表达，但是OsWRKY71却是联系ABA和GA信号通路的重要桥梁[54]。大麦GroupⅡa WRKY基因HvWRKY38则是联系ABA、SA与GA信号通路的重要桥梁[55]。从目前已取得的研究成果看，GroupⅡa WRKY基因与植物生长调节剂的关系可能远超目前研究的认识。种子发芽试验中也说明了GroupⅡa WRKY基因与ABA之间的关系，两者具有类似的作用。ABA抑制种子的发芽，拟南芥GroupⅡa WRKY基因表现负调控种子发芽的作用。MS培养基添加ABA发芽试验中，单基因过量表达植株AtWRKY18-OE和AtWRKY60-OE发芽率都降低，尤其AtWRKY18-OE极显著降低，对ABA也特别敏感；wrky18、wrky60提高种子发芽率，wrky40降低种子发芽率[39]。 2.4 GroupⅡa WRKY基因之间的关系
生命是一个复杂的有机体，尽管植物GroupⅡa WRKY基因成员只有几个，但是成员之间的关系比较紧密而复杂。首先GroupⅡa WRKY蛋白结合能力不同，决定了它们在某些功能上有主次之分；其次，在一定条件下，某些GroupⅡa WRKY基因功能的实现有赖于其它成员的表达情况，即由GroupⅡa WRKY基因主导某些植物性状取决于不同成员基因产物的平衡关系。通过WRKY结构域结合到靶基因的W-box上调控基因表达是多数WRKY转录因子的主要调控方式[7-8]，这一方式也在GroupⅡa中得到充分体现，当WRKY结构域缺失或被替代，即失去结合的能力。它们的蛋白不但可以单独结到靶基因的W-box上，而且还可以形成蛋白复合体的形式增强其结合到靶基因上的能力。酵母双杂交实验证明（yeast two-hybrid assays）GroupⅡa WRKY蛋白之间可以形成同源（homocomplexes）或异源（heterocomplexes）的蛋白复合体，复合体与W-box结合能力取决于蛋白的组合，即结合能力从强到弱依次为AtWRKY40、AtWRKY18、AtWRKY60[17]。值得关注的是，GroupⅡa WRKY与ABA受体蛋白AtABAR的结合能力与W-box有相似的次序[38]，但目前还缺少GroupⅡa WRKY蛋白复合体与AtABAR的结合能力的研究报道。与W-box的结合能力除了与GroupⅡa WRKY蛋白种类和构成有关外，还与W-box的两侧序列有关，因为靶基因的启动子区上往往存在多个W-box，因此在某些实验条件下甚至观察不到AtWRKY60结合W-box的情况[56]。在基因之间关系上，无论在过量表达还是在突变体的GroupⅡa WRKY基因实验中，AtWRKY40和AtWRKY60对拟南芥的细菌性叶斑病DC3000抗性负调控作用都受到AtWRKY18的影响，即当AtWRKY40和AtWRKY60过量表达或突变时，AtWRKY18必需同步过量表达或突变才能实现负调控的作用[17]。在拟南芥白粉病抗性调控上， AtWRKY18与AtWRKY40同样表现出紧密的联系，2个基因必需同步突变的植株才抗白粉病[27]。此外，GroupⅡa WRKY还可与其它的WRKY组成蛋白复合体，如OsWRKY51与OsWRKY71结合后可以增强OsWRKY71结合到Amy32b启动子W-box上的能力[54]。虽然已经有一些涉及GroupⅡa WRKY基因成员之间关系的研究事例，但要了解他们之间的作用位点、作用机制等还有待更多、更深入的研究。
3 展望
GroupⅡa WRKY基因之间无论在不同的植物上还是在同一植物不同成员之间的序列和空间结构都具有很高的相似性，尤其是WRKYGQK和Cx5Cx23HNH保守结构域部分，但是它们的功能和调控机制却比较复杂。首先，成员之间功能差异很大，同一种植物内不同GroupⅡa WRKY基因之间功能和W-box结合特性不同。其次，不同种植物上同源基因之间的功能和调控机制可能也存在较大的差异，例如同一个属内的湖北海棠（抗白粉病）和富士苹果（感白粉病）之间的GroupⅡa WRKY同源基因在白粉病侵染过程中表达特点有比较大的差异[57-58]。最后，不同物种的GroupⅡa WRKY基因成员在数量上差异上也很大，例如拟南芥只有3个，而玉米多达7个，数量上的差异与功能上的异同有何关系，其上、下游基因有哪些？目前对这方面的了解还十分有限。而LZ结构域变化相对较大，不但在亮氨酸数量上有变化，而且在亮氨酸两侧序列变化也十分丰富，除了亮氨酸数量对蛋白结合能力有影响外，亮氨酸两侧序列和其他非保守结构域对蛋白结合能力的影响还有待于更多深入的研究。W-box两侧序列对WRKY选择性结合或识别具有十分重要的作用，目前已测序的被子植物基因数量都在2万个以上，很多基因都具有多个W-box元件，数量庞大的W-box两侧序列对GroupⅡa WRKY的识别是否有规律可循值得深知，对这些问题的深入研究将助于了解GroupⅡa WRKY转录因子如何有序地结合到不同靶基因的W-box上并实现其功能。
植物生存常常面临复杂变化的环境和各种各样的胁迫，不同GroupⅡa WRKY对各种抗性的调控是一个动态的过程，目前对这一过程的研究也才刚刚开始。GroupⅡa WRKY基因所调控的很多抗性之间或信号通路也存在着错综复杂的关系，以及调控过程中所依赖的不同植物激素之间都可能存在一定的平衡关系。活体营养型病害（如白粉病）和死体营养型病害（如灰霉病）所寄生的寄主细胞命运是截然不同的，前者不会杀死寄主细胞，后者必须杀死寄主细胞。不仅如此，植物对活体营养型病害的抗性主要依赖于SA及相应的信号通路，死体营养型病害则依赖于JA/ET及相应的信号通路，而SA与JA/ET之间常常表现出拮抗作用[59-62]。然而现有研究结果表明，GroupⅡa WRKY基因都参与调控2种病害的抗性，而当植物同时受到2种类型病害侵染或者受到不同类型病原菌交互侵染时，GroupⅡa WRKY基因如何实现其调控功能，还有待进一步研究。
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关键词 WRKY转录因子；基因进化；胁迫；调控机制
中图分类号 S432. 2 文献标识码 A
Abstract WRKY gene family encodes plant-specific transcription factors. According to the conservative domain and the evolutionary relationship， the WRKY family can be divided into GroupⅠ， Ⅱ and Ⅲ， GroupⅡ can be further divided into Ⅱa，Ⅱb，Ⅱc，Ⅱd and Ⅱe. There are very high sequence homolog， diverse gene functions and complicated relationship among GroupⅡa genes. In these paper， we review recent progress in the genes structure， the functions in plant disease resistance and environmental stress， and the regulation mechanisms of GroupⅡa WRKY.
Key words WRKY transcription factors； Gene structure； Stress； Regulation mechanisms.
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.03.031
转录因子（transcription factor），又称反式作用因子（transacting factor），是指能够结合在靶基因上游（启动子区）顺式作用元件上的蛋白质，这些蛋白质能调控靶基因的转录。转录因子可以调控核糖核酸聚合酶（RNA聚合酶，或叫RNA合成酶）与DNA模板的结合，即典型的转录因子具有DNA结合域和核定位信号等功能域。植物常见转录因子包括WRKY[Trp（W）-Arg（R）-Lys（K）-Tyr（Y），色氨酸-精氨酸-赖氨酸-酪氨酸]、ABI3/VP1、AP2/EREBP、MADS、MYB、NAC（又名NAM，ATAF，CUC2）等约70个家族，约占植物基因总数的10%[1-2]。其中植物特有的转录因子家族有WRKY、NAC（CUP-SHAPED COTYLEDON 2）、ERF[（APETALA 2（AP2）/ethylene-responsive element binding factor）]、NAM（NO APICAL MERISTEM）、NAC、ABI3（ABSCISIC
ACID INSENSITIVE 3）/VP1（VIVIPAROUS1）、ARF （auxin response factor）、SBP（SQUAMOSA-promoter binding protein）[3]。拟南芥中WRKY氨基酸的长度从109（AtWRKY43）到1 895（AtWRKY19）个，序列长度相差最大可达10余倍，其中保守结构域约含有60个氨基酸序列，包括N端的WRKY到C端的Cx4-5Cx22-23HxH或Cx7Cx23HxC保守序列。WRKY的保守结构域也是转录因子的DNA结合域，WRKY的名字也源自WRKY这一保守序列[4-5]。在少数的WRKY蛋白中，WRKY序列被WRRY、WRSY、WKRY、WVKY取代[6]。WRKY的C端是一个保守的锌指结构，其锌指结构为Cx4-5Cx22-23HxH或Cx7Cx23HxC。根据蛋白结构域的数量可将WRKY分为GroupⅠ、Ⅱ和 Ⅲ，GroupⅠ具有2个WRKY结构域，GroupⅡ和GroupⅢ只有1个WRKY结构域；GroupⅠ、Ⅱ的锌指结构为Cx4-5Cx22-23HxH，而GroupⅢ锌指结构为Cx7Cx23HxC。GroupⅡ基因根据氨基酸的一级结构可再进一步分为 Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd、Ⅱe[7-8]。不同的物种中，WRKY的数量不一样，低等植物种类较少，从几个到几十个不等；高等植物WRKY数量比较多，有几十到上百个不等[9-10]。WRKY在植物抗病、抗逆等方面的调控作用取得了很多的研究成果，并且已有一些研究综述，但这一大家族中的GroupⅡa基因成员之间同源性高，关系紧密而复杂，对这一细分基因类型的结构、功能进行总结可为后期研究提供参考。
1 GroupⅡa WRKY转录因子结构
WRKY转录因子的发现可追溯到20年前，Ishiguro等[11]第一次发现WRKY蛋白具有结合DNA的特性，并命名为SPF1（SWEET POTATO FACTOR1），第2个报道的WRKY是在发芽过程中调控基因表达的DNA结合蛋白ABF1和ABF2[12]。第3个报道的是从欧芹（Petroselinum crispum）中鉴定的WRKY1、WRKY2、WRKY3，并首次创造了“WRKY”转录因子一词[4]。
据Yamasaki等[3]的研究，WRKY可能从简单的微生物归位内切酶C2H2 ZnF 或ββα-metal开始进化，到了单细胞真核生物就形成最原始的WRKY，再进化形成绿藻的WRKY，最后进化形成高等植物的WRKY。Zhang等[7]分析认为GroupⅠ WRKY属于比较原始的类型，GroupⅡ由GroupⅠ进化而来，GroupⅢ由GroupⅡd和GroupⅡe进化而来（图1）。比较原始的贾第鞭毛虫Giadia lamblia只具有GroupⅠ类型基因，到了绿藻则具备了GroupⅠ和GroupⅢ类型的WRKY，到藓类（Physcomitrella patens）就具备了GroupⅠ、GroupⅡ、GroupⅢ类型的WRKY，但GroupⅡ类型还不完全，还缺少其中的GroupⅡa和GroupⅡe，被子植物则具备了种类齐全的WRKY（表1）。 GroupⅡa WRKY蛋白保守结构域包括LZ、WRKYGQK和Cx5Cx23HNH，它们都能影响WRKY的结合能力（图2）。LZ（Leu zipper）结构域中亮氨酸（Leu）数量的多寡直接影响到蛋白的结合能力，这一现象在被削弱LZ结构域之后的AtWRKY18酵母双杂实验中已经得到印证，而AtWRKY60的LZ结构域中Leu在2个位置上被其它蛋白所取代则可能是导致其蛋白结合能力较AtWRKY40和AtWRKY18低的原因[17]。2005年，Yamasaki等首次报道了WRKY结构域的溶液构象结构，由4个β-折叠（β-sheet）和Cys/His锌指构成一个锌结合口袋（zinc-binding pocket）。WRKYGQK一般位于N端的β-折叠，构成蛋白的突出面，伸入DNA大沟并与DNA接触，并结合到W-box上[18-20]。野燕麦（Avena fatua）GroupⅡa WRKY转录因子ABF2结合蛋白可识别并结合到W-box（TTGACC/T），但是在加入二价金属失活剂1，10-O-菲咯啉螯合物（1，10-O-phenanthroline）可使结合不能进行，支持了锌指结构的存在[12]。
2 GroupⅡa WRKY转录因子功能
2.1 GroupⅡa WRKY转录因子与植物的抗病性
目前对GroupⅡa WRKY转录因子在调控植物抗病功能方面的研究主要通过抗病调控网络分析、病原菌或病原激发子诱导内源基因的表达分析、过量表达目的基因、突变目的基因（gene knockout）以及干涉目的基因（Gene knockdown）等几种方式。GroupⅡa WRKY通过调控重要的抗病调控网络中的关键基因或蛋白来调控植物的抗病性。对Group Ⅱa WRKY调控植物抗病性的认识最初得益于拟南芥NPR1（NON EXPRESSOR OF PATHOGENESIS-RELATED GENES1）基因的研究，对NPR1启动子分析发现它具有WRKY结合的W-box，凝胶迁移滞后实验（electrophoretic mobility shift assays，EMSA）证明了AtWRKY18可结合到NPR1的W-box上[21]，NPR1通过调控下游PR1（pathogenesis-related）广泛调控植株的抗病性[22-24]，因而AtWRKY18可能通过NPR1来调控植物抗病性[25]。EDS1（ENHANCED DISEASE SUSCEPTIBILITY 1）是拟南芥中另一个调控植株对活体营养型和半活体营养型病害抗性的网络[26]，EDS1的启动子区亦具有W-box，ChIP（chromatin
immunoprecipitation）实验也证明了AtWRKY40可结合到EDS1的W-box上[27]。除了通过结合到W-box上调控目的基因外，GroupⅡa WRKY转录因子还与一些调控网络中重要的抗病蛋白互作，大麦HvWRKY1、HvWRKY2与拟南芥AtWRKY18、AtWRKY40同源，其编码的蛋白则通过与MLA（mildew-resistance locus A）互作来调控白粉病抗性[28]。
研究GroupⅡa WRKY在抗病调控网络中的角色十分有助于学者对基因功能的了解，但是目前的研究还不能完全诠释基因的表达现象。在病源诱导内源基因表达方面，很多病原菌都能诱导GroupⅡa WRKY基因的表达，但在不同病原菌或不同诱导条件下基因的表达特点不一样，一方面不同病源菌诱导相同基因表达量最高的时间点不一样，另一方面同一病原菌诱导不同的基因表达强度和时间点也不一样。拟南芥3个GroupⅡa WRKY基因受细菌性叶斑菌（Pseudomonas syringae pv. Tomato DC3000）和灰霉菌（Botrytis cinerea）诱导表达特点明显不同，AtWRKY18同时受到细菌性叶斑菌和灰霉菌诱导上调表达明显，而AtWRKY40仅受灰霉菌诱导，AtWRKY60仅受细菌性叶斑菌诱导，但后两者诱导强度均不及AtWRKY18。在接种不同的病原菌试验中，AtWRKY18表达量最高的时间点出现在接种细菌性叶斑菌后4～8 h，而灰霉菌在接种后的24～72 h[17]。水稻中，GroupⅡa基因有4个成员OsWRKY28、OsWRKY62、OsWRKY71和OsWRKY76，它们都受稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）和几丁质激发子（chitin elicitor）的诱导上调表达，OsWRKY28、OsWRKY71受几丁质诱导表达在2 h内达到最高，而OsWRKY62、OsWRKY76则在4～8 h内[29]，并且诱导强度明显较前者高[30]。结合调控网络分析和大量的内源基因表达分析，可增进了解上下游基因之间、不同信号通路之间关系，GroupⅡa WRKY基因在病原菌诱导表达中表现出来的复杂现象，可能与不同病菌对植物为害所依赖的信号通路不一样，而不同的Group Ⅱa WRKY基因在相同或不同的网络中所扮演的角色也不一样。
过量表达目的基因可放大基因的功能，便于学者观察基因功能及下游基因受调控的情况。在基因过量表达试验中，AtWRKY18正调控细菌性叶斑病的抗性，AtWRKY40和AtWRKY60则起到负调控的作用。过量表达AtWRKY18增强成熟拟南芥植株（5～6周）抗细菌性叶斑病，并提高了抗病相关基因PR1、PR2、PR5的表达，但幼龄期转基因植株即不抗DC3000，也不提高前述抗病相关基因的表达[17，31]。单独过量表达AtWRKY40或AtWRKY60的植株对DC3000抗性没有影响，同时过量表达AtWRKY18AtWRKY40或AtWRKY18AtWRKY60两个基因植株反而更感DC3000，但是同时过表达AtWRKY40AtWRKY60则没有影响。在表型上过量表达AtWRKY40和过量表达AtWRKY18的表型相似，即出现较多锯齿状叶，而过表达AtWRKY60则没有了出现表型上的明显变化[17]。过量表达OsWRKY71增强水稻植株抗白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae，简称Xoo），并提高抗病相关OsPR1、OsNPR1的表达[32]。过量表达试验进一步说明了NPR1信号通路是GroupⅡa WRKY对植物抗病性的调控重要途径之一，一些过量表达GroupⅡa WRKY基因试验中能观察到NRP1的下游基因PR1明显上上调表达。而一部分试验并没有观察PR基因的明显变化，其中原因包括不同的GroupⅡa WRKY基因成员功能不同，所依赖信号通路也不一样；部分GroupⅡa WRKY基因成员表达具有时空的特点，基因功能只能在特定的时间和空间发生。 通过突变或干涉目的基因验证基因功能是最有效的手段。在突变体中，拟南芥GroupⅡa WRKY基因调控细菌性叶斑病抗性的作用和基因成员之间相互影响的关系得到进一步证实，AtWRKY40或AtWRKY60突变（即失去负调控作用）后提高细菌性叶斑病的抗性，但只有在WRKY18也被突变（即失去正调控作用）的情况下发生。目前，拟南芥GroupⅡa WRKY基因的单突变体、双突变、三突变均已获得，AtWRKY18、AtWRKY40、AtWRKY60中任何一个基因突变对细菌性叶斑菌和灰霉菌的抗性影响不明显，但是双突变体wrky18wrky40、wrky18wrky60或三突变体wrky18wrky40wrky60表现出抗细菌性叶斑菌，而感灰霉菌[17]。双突变体wrky18wrky40还表现出抗白粉病，而AtWRKY18、AtWRKY40单突变体和野生型拟南芥均不抗白粉病[27]。对水稻GroupⅡa WRKY基因进行干涉后，植株表现抗白叶枯病菌Xoo[33]。
GroupⅡa WRKY基因除了通过参与某些植物抗病信号通路来调控植物抗病性外，还直接调控了植物抗性物质植保素的合成过程。在植物植保素合成调控方面，棉花GaWRKY1可结合到杜松烯合成酶CAD[（+）-δ-cadinene synthase]基因启动了的W-box上，调控倍半萜类（Sesquiterpene）植保素的合成，GaWRKY1受病原菌Verticillium dahliae诱导上调表达[34]。拟南芥无论接种还是未接种白粉菌，wrky18 wrky40中的camalexin（一种植保素）也极显著高于野生型。接种白粉菌后，EDS1信号通路相关基因EDS1、PAD4、CYP71A13上调表达，尤其是wrky18 wrky40中明显高于野生型。说明camalexin合成与EDS1通路在拟南芥白粉菌侵入前的抗病作用十分重要[27]。
2.2 GroupⅡa WRKY基因与植物环境胁迫
GroupⅡa WRKY基因参与植物的非生物胁迫包括了温度、水分等的胁迫，其作用方式主要通过调控胁迫相关的信号通路或调控胁迫相关的一些关健基因。脱落酸ABA信号途径参与了干旱、冷、盐等植物非生物胁迫反应[35]，GroupⅡa WRKY转录因子在调控拟南芥的非生物胁迫及ABA信号通路中作用已经有了较为深入的认识，AtWRKY40受到外源ABA处理及盐、干旱、冷胁迫诱导上调表达[36]。目前，AtWRKY40或其同源基因在非生物胁迫中调控机制包括以下几方面，一是它直接与ABA受体蛋白ABAR互作或直接结合到ABA信号通路关键基因的W-box元件上[10，37-39]；二是结合到胁迫应答基因的W-box上；三是结合到胁迫代谢途径相关基因的W-box上。编码线粒体重要蛋白的3个关键基因AOX1a（alternative oxidase 1a）、NDB2 （NADH dehydrogenase B2）和BCS1（AAA ATPases）的启动子区都具有W-box元件，这3个基因与线粒体反向调控介导（mitochondrial retrograde regulation）胁迫反应密切相关，AtWRKY40蛋白结合在这3个基因的W-box上，调控了这些基因的表达[40]。烟草和大豆的GroupⅡa WRKY基因也参与了胁迫应答[41]。HvWRKY38与AtWRKY40、OsWRKY71、ABF2同源性很高，低温处理和干旱明显诱导该基因的表达[42]。低温诱导OsWRKY28和OsWRKY62下调表达，盐胁迫诱导OsWRKY28上调表达[43]。牛耳草（Boea hygrometrica）BhWRKY1属于GroupⅡa WRKY基因（与AtWRKY60、OsWRKY71同源），干旱处理和ABA处理均诱导该基因上调表达，ChIP等的实验表明，BhWRKY1特异地结合在肌醇半乳糖苷合成酶GolS（galactinol synthase）基因启动子W-box上，GolS是催化棉子糖家族寡糖RFOs（raffinose family oligosaccharides）生物合成的第一个步骤，而RFOs是重要的渗透调节物质，在植物干旱、低温等非生物胁迫中起十分关键的作用[44]。蒺藜科Larrea tridentata植物是沙漠中极耐干旱的常绿灌木，LtWRKY21与AtWRKY40同源，它调控ABA诱导基因HVA22及ABA信号通路重要基因VP1、ABI5的表达[45]。
2.3 GroupⅡa WRKY基因与植物生长调节剂的关系
目前研究显示，GroupⅡa WRKY基因与大部分的植物生长调节剂都有直接或间接的联系。NPR1[46-47]和EDS1[26]对植物抗病性的调控都常依赖于水杨酸SA（salicylic acid）信号通路，SA诱导AtWRKY40[17]和AtWRKY18上调表达，但过量表达AtWRKY18并没有提高植株的SA含量[31]。同属于GroupⅡa的水稻OsWRKY62[30，48]、OsWRKY71[32]、OsWRKY76[48]、葡萄VvWRKY3[49]亦受SA或SA信号通路激活药剂BTH（Benzothiadiazole）处理诱导上调表达。NPR1还是联系SA和茉莉酸JA（jasmonic acid）/乙烯ET（ethylene）信号通路之间的重要节点[50]，因此很多参与这信号通路的基因同时受到SA和JA的诱导表达，例如OsWRKY71还受茉莉酸甲酯MeJA和1-氨基环丙烷-1-羧酸ACC（ET的前体）处理诱导上调表达[32]；棉花GroupⅡa WRKY基因GaWRKY1受MeJA和SA诱导表达[34]。JA信号通路中一些重要的基因如LOX2， AOS， JAZ7， JAZ8和 JAZ10等的启动子区都具W-box，实验也证实了AtWRKY40可结合到JAZ8的W-box上[27]。MeJA处理野生型拟南芥均能诱导AtWRKY18、AtWRKY40、AtMYC2上调表达，在JA信号通路被阻断的coi1突变体中则不能被诱导表达[51]，而AtMYC2、COI1是JA信号通路中的重要基因[52]，进一步说明了GroupⅡa WRKY基因与JA信号通路之间的密切联系。拟南芥GroupⅡa WRKY基因与ABA信号通路的联系体现蛋白和基因两个层面，在ABA刺激下，应用酵母双杂交（yeast two-hybrid）、CoIP（coimmunoprecipitation）、BiFC（bimolecular uorescence complementation）和生物化学（biochemical approaches）技术在体外或体内都证实了AtWRKY40蛋白与ABA受体蛋白AtABAR（ABA receptor）的C端互作，AtWRKY18、AtWRKY60亦与AtABAR互作，但是强度不及AtWRKY40，而无ABA刺激或无效浓度的ABA则没有互作的现象发生。AtWRKY40蛋白还可结合到ABI4和ABI5启动子区的W-box上，并抑制这2个基因的表达[38]，而ABAR、ABI4和ABI5等都是ABA信号通路中的重要基因[53]。不同GroupⅡa WRKY基因成员或不同的物种上的同源基因受植物生长调节剂的诱导或调控又有所不同，在ABA、IAA、GA3、MeJA、SA处理中，水稻4个GroupⅡa WRKY基因只有OsWRKY71受ABA诱导表达，在ABA、IAA、GA3、MeJA、SA处理中，水稻OsWRKY28、OsWRKY62和OsWRKY76均不受ABA诱导表达，OsWRKY28仅受SA诱导上调表达；OsWRKY62受IAA、GA3、SA诱导上调表达；OsWRKY76受IAA、GA3、MeJA诱导上调表达[43]。虽然OsWRKY71只受到ABA的诱导表达，但是OsWRKY71却是联系ABA和GA信号通路的重要桥梁[54]。大麦GroupⅡa WRKY基因HvWRKY38则是联系ABA、SA与GA信号通路的重要桥梁[55]。从目前已取得的研究成果看，GroupⅡa WRKY基因与植物生长调节剂的关系可能远超目前研究的认识。种子发芽试验中也说明了GroupⅡa WRKY基因与ABA之间的关系，两者具有类似的作用。ABA抑制种子的发芽，拟南芥GroupⅡa WRKY基因表现负调控种子发芽的作用。MS培养基添加ABA发芽试验中，单基因过量表达植株AtWRKY18-OE和AtWRKY60-OE发芽率都降低，尤其AtWRKY18-OE极显著降低，对ABA也特别敏感；wrky18、wrky60提高种子发芽率，wrky40降低种子发芽率[39]。 2.4 GroupⅡa WRKY基因之间的关系
生命是一个复杂的有机体，尽管植物GroupⅡa WRKY基因成员只有几个，但是成员之间的关系比较紧密而复杂。首先GroupⅡa WRKY蛋白结合能力不同，决定了它们在某些功能上有主次之分；其次，在一定条件下，某些GroupⅡa WRKY基因功能的实现有赖于其它成员的表达情况，即由GroupⅡa WRKY基因主导某些植物性状取决于不同成员基因产物的平衡关系。通过WRKY结构域结合到靶基因的W-box上调控基因表达是多数WRKY转录因子的主要调控方式[7-8]，这一方式也在GroupⅡa中得到充分体现，当WRKY结构域缺失或被替代，即失去结合的能力。它们的蛋白不但可以单独结到靶基因的W-box上，而且还可以形成蛋白复合体的形式增强其结合到靶基因上的能力。酵母双杂交实验证明（yeast two-hybrid assays）GroupⅡa WRKY蛋白之间可以形成同源（homocomplexes）或异源（heterocomplexes）的蛋白复合体，复合体与W-box结合能力取决于蛋白的组合，即结合能力从强到弱依次为AtWRKY40、AtWRKY18、AtWRKY60[17]。值得关注的是，GroupⅡa WRKY与ABA受体蛋白AtABAR的结合能力与W-box有相似的次序[38]，但目前还缺少GroupⅡa WRKY蛋白复合体与AtABAR的结合能力的研究报道。与W-box的结合能力除了与GroupⅡa WRKY蛋白种类和构成有关外，还与W-box的两侧序列有关，因为靶基因的启动子区上往往存在多个W-box，因此在某些实验条件下甚至观察不到AtWRKY60结合W-box的情况[56]。在基因之间关系上，无论在过量表达还是在突变体的GroupⅡa WRKY基因实验中，AtWRKY40和AtWRKY60对拟南芥的细菌性叶斑病DC3000抗性负调控作用都受到AtWRKY18的影响，即当AtWRKY40和AtWRKY60过量表达或突变时，AtWRKY18必需同步过量表达或突变才能实现负调控的作用[17]。在拟南芥白粉病抗性调控上， AtWRKY18与AtWRKY40同样表现出紧密的联系，2个基因必需同步突变的植株才抗白粉病[27]。此外，GroupⅡa WRKY还可与其它的WRKY组成蛋白复合体，如OsWRKY51与OsWRKY71结合后可以增强OsWRKY71结合到Amy32b启动子W-box上的能力[54]。虽然已经有一些涉及GroupⅡa WRKY基因成员之间关系的研究事例，但要了解他们之间的作用位点、作用机制等还有待更多、更深入的研究。
3 展望
GroupⅡa WRKY基因之间无论在不同的植物上还是在同一植物不同成员之间的序列和空间结构都具有很高的相似性，尤其是WRKYGQK和Cx5Cx23HNH保守结构域部分，但是它们的功能和调控机制却比较复杂。首先，成员之间功能差异很大，同一种植物内不同GroupⅡa WRKY基因之间功能和W-box结合特性不同。其次，不同种植物上同源基因之间的功能和调控机制可能也存在较大的差异，例如同一个属内的湖北海棠（抗白粉病）和富士苹果（感白粉病）之间的GroupⅡa WRKY同源基因在白粉病侵染过程中表达特点有比较大的差异[57-58]。最后，不同物种的GroupⅡa WRKY基因成员在数量上差异上也很大，例如拟南芥只有3个，而玉米多达7个，数量上的差异与功能上的异同有何关系，其上、下游基因有哪些？目前对这方面的了解还十分有限。而LZ结构域变化相对较大，不但在亮氨酸数量上有变化，而且在亮氨酸两侧序列变化也十分丰富，除了亮氨酸数量对蛋白结合能力有影响外，亮氨酸两侧序列和其他非保守结构域对蛋白结合能力的影响还有待于更多深入的研究。W-box两侧序列对WRKY选择性结合或识别具有十分重要的作用，目前已测序的被子植物基因数量都在2万个以上，很多基因都具有多个W-box元件，数量庞大的W-box两侧序列对GroupⅡa WRKY的识别是否有规律可循值得深知，对这些问题的深入研究将助于了解GroupⅡa WRKY转录因子如何有序地结合到不同靶基因的W-box上并实现其功能。
植物生存常常面临复杂变化的环境和各种各样的胁迫，不同GroupⅡa WRKY对各种抗性的调控是一个动态的过程，目前对这一过程的研究也才刚刚开始。GroupⅡa WRKY基因所调控的很多抗性之间或信号通路也存在着错综复杂的关系，以及调控过程中所依赖的不同植物激素之间都可能存在一定的平衡关系。活体营养型病害（如白粉病）和死体营养型病害（如灰霉病）所寄生的寄主细胞命运是截然不同的，前者不会杀死寄主细胞，后者必须杀死寄主细胞。不仅如此，植物对活体营养型病害的抗性主要依赖于SA及相应的信号通路，死体营养型病害则依赖于JA/ET及相应的信号通路，而SA与JA/ET之间常常表现出拮抗作用[59-62]。然而现有研究结果表明，GroupⅡa WRKY基因都参与调控2种病害的抗性，而当植物同时受到2种类型病害侵染或者受到不同类型病原菌交互侵染时，GroupⅡa WRKY基因如何实现其调控功能，还有待进一步研究。
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