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摘 要 为筛选菠萝蜜实时荧光定量PCR研究用的内参基因，以菠萝蜜不同发育阶段的果实、叶和花序为材料，分析GAPDH、18S rRNA、UBQ、ɑ-tubulin和β-tubulin 5个内参基因的表达情况，并对其表达稳定性进行分析。结果表明，在各组织不同发育阶段中，5个内参基因的表达丰度变化存在差异；geNorm、NormFinder和BestKeeper 3种方法得出的结论有所不同，经RefFinder综合评价后，果实中最稳定的3个内参基因是UBQ、GAPDH、18S rRNA；叶片中最稳定的3个内参基因是UBQ、GAPDH、β-tubulin；花序中最稳定的3个内参基因是UBQ、GAPDH、ɑ-tubulin。
关键词 菠萝蜜；实时定量PCR；内参基因；表达稳定性
中图分类号 S431.191 文献标识码 A
Abstract To select appropriate reference genes for real time fluorescence quantitative experiment in jackfruit， samples of different developmental stages from the fruit， leaf and inflorescence were used to investigate the expression abundance and its expression stability of five reference genes， e.g.， GAPDH， 18S rRNA， UBQ， ɑ-tubulin and β-tubulin. Results showed that， at different developmental stages of jackfruit tissues， differences existed in the expression abundance of these five reference genes； Different conclusion in the stability of gene expression were obtained using geNorm， NormFinder and BestKeeper， and the comprehensive ranking by RefFinder indicated that， the three most stable reference genes in fruit were UBQ， GAPDH， 18S rRNA， while the three most stable reference genes were UBQ， GAPDH and β-tubulin in leaf and UBQ， GAPDH and ɑ-tubulin in inflorescence.
Key words Jackfruit（Artocarpus heterophyllus Lam.）；Real time quantitative PCR；Reference gene；Expression stability
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.07.021
实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR，RT-qPCR）是一种利用在PCR反应体系中添加特定荧光基团，对整个PCR反应过程中的产物变化进行实时监测，从而对核酸样品或者目标基因的表达进行定性或者定量分析的方法[1]，具有重复性好、灵敏度高、定量准确、速度快等优点，已广泛用于农业及医学等生命科学领域。由于RT-qPCR的结果会受到各种因素的影响，如RNA提取、逆转录、cDNA合成及PCR扩增效率等，容易导致分析结果与目标基因真实表达值间存在差异[2]；在实际应用中，为获得真实可靠的实验结果，常利用表达稳定的内参基因进行校正和标准化[3]，以减少样品之间和样品内部的误差。
理想的内参基因应是在各种实验环境和影响因子下、在不同的组织和细胞中都能恒定或相对稳定地表达。然而，近年来的研究表明，并没有绝对稳定表达的内参基因，任何一种管家基因都只能在特定的环境或一定类型的组织和细胞中恒定表达[4]。随着定量要求的不断提高，为了得到更真实可靠的实验结果，研究人员趋向于使用多个内参基因的几何平均值用于靶基因的标准化校正[5]。因而，选择哪些基因以及选择多少基因用作内参基因，已成为实时定量PCR实验中需要着重考虑的关键性问题。
菠萝蜜（Artocarpus heterophyllus Lam.）是桑科（Moraceae）木菠萝属（Artocarpus）植物，又称木菠萝、树菠萝，其果大肉甜，香气浓郁，是中国热带、南亚热带重要的优稀水果，在广东、海南、广西和云南等地均有分布和栽培[6]。随着国内外对菠萝蜜研究的不断深入，基因表达分析逐渐成为一项重要的实验内容。内参基因在基因表达分析中起着至关重要的作用，然而到目前为止，国内外还未见有关菠萝蜜内参基因选择和利用的报道。本研究利用RT-qPCR技术，并借助多种分析工具，分析5个内参基因在不同菠萝蜜组织样品中的表达稳定性，旨在研究此5个内参基因在菠萝蜜果实、叶和花组织中的表达特点，建立内参基因的选择方法，筛选出适宜的内参基因。
1 材料与方法
1.1 材料
菠萝蜜：以广东海洋大学农学院种质圃内的GHsj13hh01菠萝蜜种质为材料，取不同发育阶段的果实（幼果、小果、大果、七成熟果、成熟果）、叶片（成熟叶、幼叶）和雌花序（未开放、盛花）、雄花序（未开放、盛花）等11种材料，每种材料各取8份，液氮下研磨成粉末，保存于-80 ℃备用。 仪器和试剂：实时荧光定量PCR仪为LightCyclerR2.0 PCR仪（Roche公司），使用Roche原装的PCR毛细管。T/A克隆试剂盒pMDTM19-T、RNA提取试剂盒RNAiso-mate for Plant Tissue和RNAiso Plus、cDNA第一链合成试剂盒PrimeScriptRRT reagent Kit With gDNA Eraser（Perfect Real Time）以及荧光定量PCR试剂盒SYBRRPremix Ex TapTM（Tli RNase H Plus）购自宝生物工程（大连）有限公司。PCR产物回收试剂盒E.Z.N.A.RGel Extraction Kit购自OMEGA公司。各内参基因的扩增引物由上海生工合成。
1.2 方法
1.2.1 RNA提取 按照RNA提取试剂盒的说明书提取样品的总RNA，用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的浓度和质量。
1.2.2 cDNA第一链的合成 取1 μg总RNA，参照试剂盒说明合成cDNA第一链，并于-20 ℃保存备用。
1.2.3 PCR引物设计和验证 利用Primer Premier 6.0软件，根据同源基因的保守区域分别设计GAPDH、18S rRNA、UBQ、α-tubulin和β-tubulin 5个内参基因的荧光定量用PCR引物。用常规PCR对上述5个基因进行扩增：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，利用PCR产物回收试剂盒对其进行回收、纯化，与pMDTM19-T载体连接后转化大肠杆菌（DH5α），经蓝白斑筛选阳性克隆后送上海生工测序。
1.2.4 内参基因的RT-qPCR分析 参照SYBRRPremix Ex TapTM（Tli RNase H Plus）试剂盒说明书进行内参基因的RT-qPCR分析。反应体系为SYBRRPremix Ex TapTM（2×）10.0 μL，PCR Forward Primer（10 μmol/L）0.4 μL，PCR Reverse Primer（10 μmol/L）0.4 μL，cDNA第一链（稀释10倍）2.0 μL，dd H2O补足到20 μL，每样品重复3次。PCR扩增条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40个循环。熔解曲线分析：95 ℃ 0 s，65 ℃ 15 s（20 ℃/s），95 ℃ 0 s（0.1 ℃/s）。
1.3 数据分析
用geNorm[4]、NormFinder[7]和BestKeeper[2]对5个内参基因的表达稳定性进行统计学分析，最后再使用基于web的分析工具RefFinder[8]对各内参基因进行了综合评价。在使用geNorm和NormFinder分析前，用比较Ct法转换原始数据，即设定样本中Ct值（循环阀值，Cycle threshold）最小者的表达量为1，根据2-△Ct法计算其他样本的相对表达量，其中△Ct=各样本Ct值-最小Ct值。
2 结果与分析
2.1 总RNA的提取
提取的总RNA经1%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测后，菠萝蜜各样品总RNA电泳图谱带型清晰，28S rRNA的亮度约是18S rRNA亮度的1.5～2.0倍，表明RNA样品无明显降解，完整性较好，可用于后续试验。
2.2 内参基因引物的扩增产物分析
以RNA经反转录合成的cDNA为模板，所设计的各内参基因引物均能扩增出特异的条带（图1）。扩增片段经回收测序后，大小在80～115 bp之间（表1）。序列经Blast分析后表明，各引物扩增出的片段均为目标基因片段。
2.3 内参基因荧光定量PCR分析
以菠萝蜜不同组织的cDNA第一链为模板，进行实时荧光定量PCR分析（图2）。从图2可以看出，5对内参基因引物在各个材料中的扩增产物的熔解曲线都只有单一峰，说明其扩增是特异性的，不存在引物二聚体。各样品重复扩增间的差异很小，重复孔间的Ct值差异<0.5，说明所使用的实时荧光定量PCR方法重复性高，结果准确可信。
基因的表达丰度越高，其Ct值越小，反之，Ct值越大。5个内参基因在所研菠萝蜜材料中的表达丰度存在差异（图3）。18S rRNA的表达丰度最高，Ct值为13.73～17.48，平均为15.81；GAPDH的表达丰度最低，Ct值为24.62～29.46，平均为27.00；其余3个内参基因的表达丰度较为接近，平均值为21.42～24.04。
在菠萝蜜不同组织以及同一组织不同发育阶段的材料中，5个内参基因的Ct值也存在差异。ɑ-tubulin和β-tubulin 2个基因的Ct值变化较大，在果实中，均随着果实的发育和成熟，Ct值增加；在成熟叶和嫩叶中也存在较大变化，嫩叶中的Ct值低于老叶；在花序组织中的差异较小，其中，β-tubulin基本无变化，ɑ-tubulin的Ct值在未开放花序中略低。18S rRNA在七成熟果及未开放雌、雄花序中的有较小的Ct值，在其他材料中的Ct值较为接近。UBQ基因在果实中的Ct值没有太大变化，成熟叶中的Ct值要大于老叶，盛开花序中的Ct值大于未开放的花序。除七成熟果中的Ct值较低外，GAPDH在果实和叶片中的Ct值较为接近，开放花序中的Ct值要高于未开放花序中的Ct值。
2.4 内参基因的选择
2.4.1 GeNorm分析 经GeNorm方法分析后，获得的各内参基因的表达稳定性见表2。从表2可以看出，在菠萝蜜的不同组织中，内参基因的表达稳定性存在差异。把所有的组织材料用于分析时，GAPDH和18S rRNA基因的表达最为稳定，其次是UBQ，ɑ-tubulin和β-tubulin；在果实中，GAPDH和18S rRNA的表达最为稳定，其次是UBQ，ɑ-tubulin和β-tubulin；在叶片中，ɑ-tubulin和β-tubulin的表达最稳定，其次是UBQ，GAPDH和18S rRNA；在花序中，GAPDH和UBQ的表达最稳定，其次是ɑ-tubulin，18S rRNA和β-tubulin。 经GeNorm方法分析后，不同菠萝蜜组织中，分别使用3、4、5个内参基因来计算归一因子（Normalization factor，NF）后，得出的归一因子间的差异情况见图4。从图4可看出，除叶组织外，各样品集中，随着归一因子计算用内参基因数的增加，得出的归一因子之间的差异也在不断增加，果实组织中的增加最为明显。在叶组织中，用5个内参基因计算出的归一因子与用4个内参基因计算出的归一因子间的差异表现出下降的趋势，但远未达到该方法所推荐的0.15的水平。
由于归一因子的配对差异分析无法得出最优的内参基因数，可采取直接选择3个最稳定表达的内参基因用于计算归一因子。说明选择适用于所有组织的内参基因是不切实际的。因此，在菠萝蜜果实中，可使用GAPDH、18S rRNA和UBQ基因作为共同内参；叶片中，可使用ɑ-tubulin、β-tubulin和UBQ基因作为共同内参；花序中，可使用GAPDH、UBQ和ɑ-tubulin基因作为共同内参。
2.4.2 NormFinder分析 NormFinder方法的分析结果见表3。基因表达的稳定性用稳定值来表示，稳定值越小，基因的表达就越稳定。把所有的组织材料用于分析时，表达稳定性最高的内参基因是UBQ（0.466），表达稳定性最低的是β-tubulin（1.111）基因；最宜用作内参的基因是UBQ，最佳的2个基因组合是18S rRNA和ɑ-tubulin，组合后的稳定值为0.399。在果实中，UBQ（0.372）是表达最稳定的内参基因，β-tubulin基因的表达稳定性最低（1.540）；最宜用作内参的基因是UBQ，而最佳的2个基因组合是GAPDH和ɑ-tubulin，组合后的稳定值为0.323。在叶片中，UBQ（0.156）是表达最稳定的内参基因，18S rRNA基因的表达稳定性最低（1.240）；最宜用作内参的基因是UBQ，而最佳的2个基因组合是GAPDH和ɑ-tubulin，组合后的稳定值为0.164。在花序中，GAPDH（0.304）是表达最稳定的内参基因，β-tubulin基因的表达稳定性最低（0.818）；最宜用作内参的基因是GAPDH，而最佳的2个基因组合是GAPDH和ɑ-tubulin，组合后的稳定值为0.239。
2.4.3 BestKeeper 分析 BestKeeper方法的分析结果见表4和表5。当把所有的材料作为一个样品集时，5个内参基因Ct值的标准差均>1；按照BestKeeper的选择标准，这些内参基因的表达都是不稳定的，因而都不宜用于计算BestKeeper index。
在果实中，β-tubulin和ɑ-tubulin 2个内参基因Ct值的标准差>1（见表4）；相关分析结果也表明，GAPDH与β-tubulin和ɑ-tubulin、18S rRNA与β-tubulin和ɑ-tubulin间的相关关系均未达到显著水平。将这2个内参基因剔除后，计算出的BestKeeper index值与3个内参基因之间的相关性均达到极显著水平，相关系数为0.709～0.982（见表5）。因而适宜的内参基因是GAPDH、UBQ和18S rRNA。
在叶片中，UBQ、β-tubulin和ɑ-tubulin 3个内参基因Ct值的标准差均大于1（见表4），但仅GAPDH与18S rRNA间的相关性不显著，其他内参基因之间的相关性均达到显著或极显著水平；将这3个基因剔除后，计算出的BestKeeper index值与2个内参基因之间的相关性均达到显著或极显著水平，相关系数为0.856～0.959（见表5）。因而，适宜的内参基因为GAPDH与18S rRNA。
在花序中，GAPDH、UBQ和18S rRNA 3个内参基因Ct值的标准差均>1（见表4），但仅18S rRNA和ɑ-tubulin间的相关性未达到显著水平，其他内参基因之间的相关性均达到显著或极显著水平；将这3个基因剔除后，计算出来的BestKeeper index值与这2个内参基因之间的相关性较低，仅ɑ-tubulin与BestKeeper index值的相关性达到极显著水平。然而，当把β-tubulin和ɑ-tubulin 2个基因剔除后，计算出来的BestKeeper index值与3个内参基因之间的相关性均达到极显著水平，相关系数为0.937～0.968（见表5）。因此适宜的内参基因为GAPDH、UBQ和18S rRNA。
2.4.4 RefFinder 分析 RefFinder的分析结果见表6。基因表达的稳定性越小，其表达就越稳定。当把所有的材料作为一个样品集时，最稳定的3个内参基因是UBQ、GAPDH、18S rRNA；在果实中，最稳定的3个内参基因是UBQ、GAPDH、18S rRNA；叶片中，最稳定的3个内参基因是UBQ、GAPDH、β-tubulin；花序中最稳定的3个内参基因是UBQ、GAPDH、ɑ-tubulin。
3 讨论与结论
在qRT-PCR分析中，稳定表达的内参基因是基因表达分析的重要前提[9]。不同物种或同一物种的不同组织，适用的内参基因可能存在差异，如杨树根发育的不同时期中Eflɑ和18Sr RNA表达稳定[10]，不同柑橘品种中则是ACTB，18Sr RNA和rpII表达稳定[11]，UBQ在苹果[12]和白桦[13]中表达稳定，茶树[5]不同组织和不同成熟度的叶片中稳定表达的分别是β-actin和GAPDH；琯溪蜜柚果实发育不同时期和不同组织中表达较为稳定的是β-tubulin，而actin1和EF1-a则分别适用于琯溪蜜柚果实发育不同时期和不同组织[14]。除了传统的看家基因外，一些稳定表达的基因也可用作内参基因[15]。
一些经典的内参基因在不同的实验条件下，其表达水平会发生变化[16]。本研究结果表明，5个基因（GAPDH、18SrRNA、UBQ、ɑ-tubulin和β-tubulin）的表达水平在所研材料间存在明显差异，变化趋势也不相同；GeNorm分析结果表明，全部材料、果实、叶片和花序中最稳定的2个基因分别是GAPDH-18S rRNA、GAPDH-18S rRNA、ɑ-tubulin-β-tubulin和GAPDH-UBQ，但未能根据0.15的推荐值得出最佳的基因数。NormFinder分析结果表明，全部材料、果实、叶片和花序中最稳定的2个基因分别是18S rRNA-ɑ-tubulin、GAPDH-ɑ-tubulin、GAPDH-ɑ-tubulin和GAPDH-ɑ-tubulin。BestKeeper分析结果表明，果实、叶片和花序中最稳定的基因分别为GAPDH-UBQ-18S rRNA、GAPDH-18S rRNA、GAPDH-UBQ-18S rRNA。因此，在所有的菠萝蜜组织中使用同样的内参基因是不适宜的，而且不同分析方法得出的结论也存在差异。 虽然有研究表明不同分析方法可以得出相同的结果[5，17]，但也有例外[7，18-19]，主要是由于不同分析方法判断基因表达稳定性的依据不同[2，4，7]。考虑到不同分析方法所得结果的差异，RefFinder[8]将4种分析方法（geNorm，Normfinder，BestKeeper和比较△Ct法）的排序结果赋予相应的权重后，得出一个基于几何平均值的综合排序结果，并被证明是可行的[20-21]。对于内参基因的数量，Vandesompele[4]建议可不理会软件对最适内参基因数的分析结果，直接选择最稳定的3个内参基因。Fu等[22]也建议使用3个最稳定的基因用作内参基因。根据上述方法，本研究建议在菠萝蜜的果实中使用UBQ、GAPDH、18S rRNA作为内参基因，在叶片中使用UBQ、GAPDH、β-tubulin作为内参基因，在花序中使用UBQ、GAPDH、ɑ-tubulin作为内参基因。但随着菠萝蜜基因发掘和表达研究的深入，不排除会出现更稳定的内参基因。
参考文献
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关键词 菠萝蜜；实时定量PCR；内参基因；表达稳定性
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Abstract To select appropriate reference genes for real time fluorescence quantitative experiment in jackfruit， samples of different developmental stages from the fruit， leaf and inflorescence were used to investigate the expression abundance and its expression stability of five reference genes， e.g.， GAPDH， 18S rRNA， UBQ， ɑ-tubulin and β-tubulin. Results showed that， at different developmental stages of jackfruit tissues， differences existed in the expression abundance of these five reference genes； Different conclusion in the stability of gene expression were obtained using geNorm， NormFinder and BestKeeper， and the comprehensive ranking by RefFinder indicated that， the three most stable reference genes in fruit were UBQ， GAPDH， 18S rRNA， while the three most stable reference genes were UBQ， GAPDH and β-tubulin in leaf and UBQ， GAPDH and ɑ-tubulin in inflorescence.
Key words Jackfruit（Artocarpus heterophyllus Lam.）；Real time quantitative PCR；Reference gene；Expression stability
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.07.021
实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR，RT-qPCR）是一种利用在PCR反应体系中添加特定荧光基团，对整个PCR反应过程中的产物变化进行实时监测，从而对核酸样品或者目标基因的表达进行定性或者定量分析的方法[1]，具有重复性好、灵敏度高、定量准确、速度快等优点，已广泛用于农业及医学等生命科学领域。由于RT-qPCR的结果会受到各种因素的影响，如RNA提取、逆转录、cDNA合成及PCR扩增效率等，容易导致分析结果与目标基因真实表达值间存在差异[2]；在实际应用中，为获得真实可靠的实验结果，常利用表达稳定的内参基因进行校正和标准化[3]，以减少样品之间和样品内部的误差。
理想的内参基因应是在各种实验环境和影响因子下、在不同的组织和细胞中都能恒定或相对稳定地表达。然而，近年来的研究表明，并没有绝对稳定表达的内参基因，任何一种管家基因都只能在特定的环境或一定类型的组织和细胞中恒定表达[4]。随着定量要求的不断提高，为了得到更真实可靠的实验结果，研究人员趋向于使用多个内参基因的几何平均值用于靶基因的标准化校正[5]。因而，选择哪些基因以及选择多少基因用作内参基因，已成为实时定量PCR实验中需要着重考虑的关键性问题。
菠萝蜜（Artocarpus heterophyllus Lam.）是桑科（Moraceae）木菠萝属（Artocarpus）植物，又称木菠萝、树菠萝，其果大肉甜，香气浓郁，是中国热带、南亚热带重要的优稀水果，在广东、海南、广西和云南等地均有分布和栽培[6]。随着国内外对菠萝蜜研究的不断深入，基因表达分析逐渐成为一项重要的实验内容。内参基因在基因表达分析中起着至关重要的作用，然而到目前为止，国内外还未见有关菠萝蜜内参基因选择和利用的报道。本研究利用RT-qPCR技术，并借助多种分析工具，分析5个内参基因在不同菠萝蜜组织样品中的表达稳定性，旨在研究此5个内参基因在菠萝蜜果实、叶和花组织中的表达特点，建立内参基因的选择方法，筛选出适宜的内参基因。
1 材料与方法
1.1 材料
菠萝蜜：以广东海洋大学农学院种质圃内的GHsj13hh01菠萝蜜种质为材料，取不同发育阶段的果实（幼果、小果、大果、七成熟果、成熟果）、叶片（成熟叶、幼叶）和雌花序（未开放、盛花）、雄花序（未开放、盛花）等11种材料，每种材料各取8份，液氮下研磨成粉末，保存于-80 ℃备用。 仪器和试剂：实时荧光定量PCR仪为LightCyclerR2.0 PCR仪（Roche公司），使用Roche原装的PCR毛细管。T/A克隆试剂盒pMDTM19-T、RNA提取试剂盒RNAiso-mate for Plant Tissue和RNAiso Plus、cDNA第一链合成试剂盒PrimeScriptRRT reagent Kit With gDNA Eraser（Perfect Real Time）以及荧光定量PCR试剂盒SYBRRPremix Ex TapTM（Tli RNase H Plus）购自宝生物工程（大连）有限公司。PCR产物回收试剂盒E.Z.N.A.RGel Extraction Kit购自OMEGA公司。各内参基因的扩增引物由上海生工合成。
1.2 方法
1.2.1 RNA提取 按照RNA提取试剂盒的说明书提取样品的总RNA，用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的浓度和质量。
1.2.2 cDNA第一链的合成 取1 μg总RNA，参照试剂盒说明合成cDNA第一链，并于-20 ℃保存备用。
1.2.3 PCR引物设计和验证 利用Primer Premier 6.0软件，根据同源基因的保守区域分别设计GAPDH、18S rRNA、UBQ、α-tubulin和β-tubulin 5个内参基因的荧光定量用PCR引物。用常规PCR对上述5个基因进行扩增：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，利用PCR产物回收试剂盒对其进行回收、纯化，与pMDTM19-T载体连接后转化大肠杆菌（DH5α），经蓝白斑筛选阳性克隆后送上海生工测序。
1.2.4 内参基因的RT-qPCR分析 参照SYBRRPremix Ex TapTM（Tli RNase H Plus）试剂盒说明书进行内参基因的RT-qPCR分析。反应体系为SYBRRPremix Ex TapTM（2×）10.0 μL，PCR Forward Primer（10 μmol/L）0.4 μL，PCR Reverse Primer（10 μmol/L）0.4 μL，cDNA第一链（稀释10倍）2.0 μL，dd H2O补足到20 μL，每样品重复3次。PCR扩增条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40个循环。熔解曲线分析：95 ℃ 0 s，65 ℃ 15 s（20 ℃/s），95 ℃ 0 s（0.1 ℃/s）。
1.3 数据分析
用geNorm[4]、NormFinder[7]和BestKeeper[2]对5个内参基因的表达稳定性进行统计学分析，最后再使用基于web的分析工具RefFinder[8]对各内参基因进行了综合评价。在使用geNorm和NormFinder分析前，用比较Ct法转换原始数据，即设定样本中Ct值（循环阀值，Cycle threshold）最小者的表达量为1，根据2-△Ct法计算其他样本的相对表达量，其中△Ct=各样本Ct值-最小Ct值。
2 结果与分析
2.1 总RNA的提取
提取的总RNA经1%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测后，菠萝蜜各样品总RNA电泳图谱带型清晰，28S rRNA的亮度约是18S rRNA亮度的1.5～2.0倍，表明RNA样品无明显降解，完整性较好，可用于后续试验。
2.2 内参基因引物的扩增产物分析
以RNA经反转录合成的cDNA为模板，所设计的各内参基因引物均能扩增出特异的条带（图1）。扩增片段经回收测序后，大小在80～115 bp之间（表1）。序列经Blast分析后表明，各引物扩增出的片段均为目标基因片段。
2.3 内参基因荧光定量PCR分析
以菠萝蜜不同组织的cDNA第一链为模板，进行实时荧光定量PCR分析（图2）。从图2可以看出，5对内参基因引物在各个材料中的扩增产物的熔解曲线都只有单一峰，说明其扩增是特异性的，不存在引物二聚体。各样品重复扩增间的差异很小，重复孔间的Ct值差异<0.5，说明所使用的实时荧光定量PCR方法重复性高，结果准确可信。
基因的表达丰度越高，其Ct值越小，反之，Ct值越大。5个内参基因在所研菠萝蜜材料中的表达丰度存在差异（图3）。18S rRNA的表达丰度最高，Ct值为13.73～17.48，平均为15.81；GAPDH的表达丰度最低，Ct值为24.62～29.46，平均为27.00；其余3个内参基因的表达丰度较为接近，平均值为21.42～24.04。
在菠萝蜜不同组织以及同一组织不同发育阶段的材料中，5个内参基因的Ct值也存在差异。ɑ-tubulin和β-tubulin 2个基因的Ct值变化较大，在果实中，均随着果实的发育和成熟，Ct值增加；在成熟叶和嫩叶中也存在较大变化，嫩叶中的Ct值低于老叶；在花序组织中的差异较小，其中，β-tubulin基本无变化，ɑ-tubulin的Ct值在未开放花序中略低。18S rRNA在七成熟果及未开放雌、雄花序中的有较小的Ct值，在其他材料中的Ct值较为接近。UBQ基因在果实中的Ct值没有太大变化，成熟叶中的Ct值要大于老叶，盛开花序中的Ct值大于未开放的花序。除七成熟果中的Ct值较低外，GAPDH在果实和叶片中的Ct值较为接近，开放花序中的Ct值要高于未开放花序中的Ct值。
2.4 内参基因的选择
2.4.1 GeNorm分析 经GeNorm方法分析后，获得的各内参基因的表达稳定性见表2。从表2可以看出，在菠萝蜜的不同组织中，内参基因的表达稳定性存在差异。把所有的组织材料用于分析时，GAPDH和18S rRNA基因的表达最为稳定，其次是UBQ，ɑ-tubulin和β-tubulin；在果实中，GAPDH和18S rRNA的表达最为稳定，其次是UBQ，ɑ-tubulin和β-tubulin；在叶片中，ɑ-tubulin和β-tubulin的表达最稳定，其次是UBQ，GAPDH和18S rRNA；在花序中，GAPDH和UBQ的表达最稳定，其次是ɑ-tubulin，18S rRNA和β-tubulin。 经GeNorm方法分析后，不同菠萝蜜组织中，分别使用3、4、5个内参基因来计算归一因子（Normalization factor，NF）后，得出的归一因子间的差异情况见图4。从图4可看出，除叶组织外，各样品集中，随着归一因子计算用内参基因数的增加，得出的归一因子之间的差异也在不断增加，果实组织中的增加最为明显。在叶组织中，用5个内参基因计算出的归一因子与用4个内参基因计算出的归一因子间的差异表现出下降的趋势，但远未达到该方法所推荐的0.15的水平。
由于归一因子的配对差异分析无法得出最优的内参基因数，可采取直接选择3个最稳定表达的内参基因用于计算归一因子。说明选择适用于所有组织的内参基因是不切实际的。因此，在菠萝蜜果实中，可使用GAPDH、18S rRNA和UBQ基因作为共同内参；叶片中，可使用ɑ-tubulin、β-tubulin和UBQ基因作为共同内参；花序中，可使用GAPDH、UBQ和ɑ-tubulin基因作为共同内参。
2.4.2 NormFinder分析 NormFinder方法的分析结果见表3。基因表达的稳定性用稳定值来表示，稳定值越小，基因的表达就越稳定。把所有的组织材料用于分析时，表达稳定性最高的内参基因是UBQ（0.466），表达稳定性最低的是β-tubulin（1.111）基因；最宜用作内参的基因是UBQ，最佳的2个基因组合是18S rRNA和ɑ-tubulin，组合后的稳定值为0.399。在果实中，UBQ（0.372）是表达最稳定的内参基因，β-tubulin基因的表达稳定性最低（1.540）；最宜用作内参的基因是UBQ，而最佳的2个基因组合是GAPDH和ɑ-tubulin，组合后的稳定值为0.323。在叶片中，UBQ（0.156）是表达最稳定的内参基因，18S rRNA基因的表达稳定性最低（1.240）；最宜用作内参的基因是UBQ，而最佳的2个基因组合是GAPDH和ɑ-tubulin，组合后的稳定值为0.164。在花序中，GAPDH（0.304）是表达最稳定的内参基因，β-tubulin基因的表达稳定性最低（0.818）；最宜用作内参的基因是GAPDH，而最佳的2个基因组合是GAPDH和ɑ-tubulin，组合后的稳定值为0.239。
2.4.3 BestKeeper 分析 BestKeeper方法的分析结果见表4和表5。当把所有的材料作为一个样品集时，5个内参基因Ct值的标准差均>1；按照BestKeeper的选择标准，这些内参基因的表达都是不稳定的，因而都不宜用于计算BestKeeper index。
在果实中，β-tubulin和ɑ-tubulin 2个内参基因Ct值的标准差>1（见表4）；相关分析结果也表明，GAPDH与β-tubulin和ɑ-tubulin、18S rRNA与β-tubulin和ɑ-tubulin间的相关关系均未达到显著水平。将这2个内参基因剔除后，计算出的BestKeeper index值与3个内参基因之间的相关性均达到极显著水平，相关系数为0.709～0.982（见表5）。因而适宜的内参基因是GAPDH、UBQ和18S rRNA。
在叶片中，UBQ、β-tubulin和ɑ-tubulin 3个内参基因Ct值的标准差均大于1（见表4），但仅GAPDH与18S rRNA间的相关性不显著，其他内参基因之间的相关性均达到显著或极显著水平；将这3个基因剔除后，计算出的BestKeeper index值与2个内参基因之间的相关性均达到显著或极显著水平，相关系数为0.856～0.959（见表5）。因而，适宜的内参基因为GAPDH与18S rRNA。
在花序中，GAPDH、UBQ和18S rRNA 3个内参基因Ct值的标准差均>1（见表4），但仅18S rRNA和ɑ-tubulin间的相关性未达到显著水平，其他内参基因之间的相关性均达到显著或极显著水平；将这3个基因剔除后，计算出来的BestKeeper index值与这2个内参基因之间的相关性较低，仅ɑ-tubulin与BestKeeper index值的相关性达到极显著水平。然而，当把β-tubulin和ɑ-tubulin 2个基因剔除后，计算出来的BestKeeper index值与3个内参基因之间的相关性均达到极显著水平，相关系数为0.937～0.968（见表5）。因此适宜的内参基因为GAPDH、UBQ和18S rRNA。
2.4.4 RefFinder 分析 RefFinder的分析结果见表6。基因表达的稳定性越小，其表达就越稳定。当把所有的材料作为一个样品集时，最稳定的3个内参基因是UBQ、GAPDH、18S rRNA；在果实中，最稳定的3个内参基因是UBQ、GAPDH、18S rRNA；叶片中，最稳定的3个内参基因是UBQ、GAPDH、β-tubulin；花序中最稳定的3个内参基因是UBQ、GAPDH、ɑ-tubulin。
3 讨论与结论
在qRT-PCR分析中，稳定表达的内参基因是基因表达分析的重要前提[9]。不同物种或同一物种的不同组织，适用的内参基因可能存在差异，如杨树根发育的不同时期中Eflɑ和18Sr RNA表达稳定[10]，不同柑橘品种中则是ACTB，18Sr RNA和rpII表达稳定[11]，UBQ在苹果[12]和白桦[13]中表达稳定，茶树[5]不同组织和不同成熟度的叶片中稳定表达的分别是β-actin和GAPDH；琯溪蜜柚果实发育不同时期和不同组织中表达较为稳定的是β-tubulin，而actin1和EF1-a则分别适用于琯溪蜜柚果实发育不同时期和不同组织[14]。除了传统的看家基因外，一些稳定表达的基因也可用作内参基因[15]。
一些经典的内参基因在不同的实验条件下，其表达水平会发生变化[16]。本研究结果表明，5个基因（GAPDH、18SrRNA、UBQ、ɑ-tubulin和β-tubulin）的表达水平在所研材料间存在明显差异，变化趋势也不相同；GeNorm分析结果表明，全部材料、果实、叶片和花序中最稳定的2个基因分别是GAPDH-18S rRNA、GAPDH-18S rRNA、ɑ-tubulin-β-tubulin和GAPDH-UBQ，但未能根据0.15的推荐值得出最佳的基因数。NormFinder分析结果表明，全部材料、果实、叶片和花序中最稳定的2个基因分别是18S rRNA-ɑ-tubulin、GAPDH-ɑ-tubulin、GAPDH-ɑ-tubulin和GAPDH-ɑ-tubulin。BestKeeper分析结果表明，果实、叶片和花序中最稳定的基因分别为GAPDH-UBQ-18S rRNA、GAPDH-18S rRNA、GAPDH-UBQ-18S rRNA。因此，在所有的菠萝蜜组织中使用同样的内参基因是不适宜的，而且不同分析方法得出的结论也存在差异。 虽然有研究表明不同分析方法可以得出相同的结果[5，17]，但也有例外[7，18-19]，主要是由于不同分析方法判断基因表达稳定性的依据不同[2，4，7]。考虑到不同分析方法所得结果的差异，RefFinder[8]将4种分析方法（geNorm，Normfinder，BestKeeper和比较△Ct法）的排序结果赋予相应的权重后，得出一个基于几何平均值的综合排序结果，并被证明是可行的[20-21]。对于内参基因的数量，Vandesompele[4]建议可不理会软件对最适内参基因数的分析结果，直接选择最稳定的3个内参基因。Fu等[22]也建议使用3个最稳定的基因用作内参基因。根据上述方法，本研究建议在菠萝蜜的果实中使用UBQ、GAPDH、18S rRNA作为内参基因，在叶片中使用UBQ、GAPDH、β-tubulin作为内参基因，在花序中使用UBQ、GAPDH、ɑ-tubulin作为内参基因。但随着菠萝蜜基因发掘和表达研究的深入，不排除会出现更稳定的内参基因。
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