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摘 要：本研究利用PCR方法从水貂阿留申病毒相关病料中扩增出VP2蛋白部分基因，并进行原核表达，成功获得VP2重组蛋白；利用纯化的VP2重组蛋白免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合，成功获得3株杂交瘤细胞：1F4F7D9、3E9G3D4和4B8B3F8；分别接种小鼠，间接ELISA检测结果表明，3组实验小鼠腹水的单克隆抗体效价均在106以上。
关键词：水貂阿留申病毒；VP2重组蛋白；单克隆抗体
水貂阿留申病（Aleutian mink disease， AD）是一种由阿留申病毒（Aleutian mink disease parvovirus， ADV）引起的水貂自身免疫系统紊乱性疾病，目前在全国范围内广泛流行，是当今阻碍养貂业发展的主要传染病，其主要临床表现为母貂流产、新生子貂急性肺炎、成年水貂慢性免疫复合物介导的肾小球肾炎等[1]。病毒粒子中的蛋白分为结构和非结构蛋白两类，其中VP2是ADV的主要免疫原性抗原，是抗原决定簇的载体，与致病性密切相关，是目前研究最多的蛋白，VP2基因也已成为研究ADV毒力、致病性、抗原性和建立检测方法的首选基因[2～5]。本研究利用重组表达的水貂阿留申病毒VP2蛋白制备出单克隆抗体，为阿留申病毒的鉴定、检测等研究奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
水貂阿留申病毒相关病料、阳性血清由青岛农业大学特种经济动物教研室提供；骨髓瘤细胞Ag8.653、BALB/c小鼠由北京青元盛康生物医药科技有限公司提供。
病毒DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；胶回收试剂盒、IPTG、Ex Taq酶、限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DNA Marker、蛋白质预染Marker及非预染Marker购自宝生物工程（大连）有限公司；兔抗水貂IgG（HRP标记）购自美国Sigma-ldrich公司；DAB （3，3二氨基联苯胺）显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；其他试剂均为国产分析纯。
1.2 引物设计
根据GenBank收录的ADV全长序列（JN040434.1），选取VP2基因901～1 560 nt区域设计并合成引物。上游引物5′端引入BamHⅠ酶切位点，下游引物5′端引入XhoⅠ酶切位点。引物序列为：
1.3 VP2基因扩增
按照病毒DNA提取试剂盒说明提取病毒DNA，加入灭菌去离子水溶解。PCR反应体系：DNA模板2 μl，10×PCR buffer 5 μl，25 mmol/L MgCl2 2 μl，2.5 mmol/L dNTP 2 μl，20 μmol/L 上下游引物各1 μl，Ex Taq 0.5 μl，加灭菌去离子水至50 μl。反应条件：95℃预变性 3 min；94℃变性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸40 s，30个循环； 72℃延伸10 min。取5 μl反应产物1%琼脂糖凝胶电泳检验。
1.4 表达载体的构建
将扩增出的VP2基因片段回收并克隆至pMD18-T载体中，用BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切，鉴定为阳性的克隆质粒命名为pMD18-VP2。用BamHⅠ和XhoⅠ分别双酶切重组克隆质粒pMD18-VP2和pET-28a（+）载体，回收目的片段，16℃连接过夜，转化DH5α感受态细胞，提取质粒，用BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切，鉴定为阳性的质粒命名为pET28a-VP2。将阳性质粒pET28a-VP2转化BL21感受态细胞，提取质粒，BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定为阳性的质粒送上海博尚生物工程有限公司测序。
1.5 重组表达质粒诱导表达、纯化及Western blotting分析
挑取阳性菌于37℃培养待OD600值达到0.4～0.6时，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，37℃继续培养5 h。取诱导的菌体，用1×PBS缓冲液悬浮，利用超声波破碎菌体，离心，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳，确定目的蛋白表达情况。设置pET-28a（+）空载体转化株作为对照。
取100 ml经IPTG诱导表达的VP2蛋白菌液，按照Ni-NTA SefinoseTM Resin Kit说明书进行纯化，然后根据Sambrook等[6]方法进行Western blotting分析，最后加入DAB底物液显色并拍照。
1.6 单克隆抗体的制备
1.6.1 重组VP2蛋白的准备 诱导表达的VP2蛋白经Ni柱纯化后，定量，备用。
1.6.2 免疫小鼠 取健康8周龄BALB/c小鼠5只，足掌注射VP2蛋白免疫，共五次，剂量均为100 μg，首免与等体积弗氏完全佐剂乳化，二免与等体积弗氏不完全佐剂乳化，三、四、五次免疫不用佐剂。首免与二免间隔20 d，二免与三免间隔10 d，第三、四、五次免疫间隔3～7 d不等。五次免疫3 d后尾静脉采血，利用以表达的VP2蛋白作为包被抗原建立的ELISA方法测定静脉血中的抗体效价，选效价高的小鼠进行细胞融合试验。
1.6.3 杂交瘤细胞株的建立 分离免疫小鼠的脾脏并匀浆制备免疫脾细胞，按常规方法将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合；融合后7～10 d补加1%的HT培养液，用倒置显微镜观测细胞生长情况及有无杂交瘤形成，并作记录；待集落长到培养孔的1/4～1/3时进行抗体检测，检测到阳性孔（即能在其上清液中检测到特异性抗体）时，作克隆化培养；当阳性孔中的细胞集落很大时，吸出，移入已加有饲养细胞的24孔细胞培养板中继续培养（阳性克隆的筛选采用以表达的VP2蛋白作为包被抗原建立的ELISA方法；阳性孔的克隆化培养采用有限稀释法）。
1.6.4 小鼠腹水型单克隆抗体的生产 选取8～10周龄健康纯系雌性BALB/c小鼠12只，设3个杂交瘤细胞组和1个对照组，每组3只，于接种细胞前10 d注射无菌液体石蜡，每只0.5 ml；将杂交瘤细胞从培养瓶上吹下，培养物移入50 ml离心管中，室温800×g离心5 min，弃上清；用40 ml无菌PBS重悬细胞，离心，弃上清；重悬细胞于5 ml无菌PBS，进行细胞计数，并用台盼蓝拒染试验检测细胞活力是否接近100%；加入无菌PBS调整细胞浓度为5×106个/ml，向小鼠腹腔内注射0.5 ml细胞悬液，5 d后开始采集腹水；腹水于室温下1 500×g离心10 min，收集上清转移至高速离心管，4℃下15 000×g离心10 min，收集上清，标记好单抗名称和采集日期，-80℃保存。 腹水效价的测定：腹水从1∶200开始倍比稀释，利用以表达的VP2蛋白作为包被抗原建立的ELISA方法测定抗体效价。
2 结果与分析
2.1 VP2基因扩增
提取水貂阿留申病毒DNA，以此为模板进行PCR，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，获得一条大小为660 bp左右的片段（图1），与预期大小相符。
2.4 重组菌的诱导表达及Western blotting分析
重组菌经IPTG诱导后，获得高效表达，在沉淀中出现30.2 ku左右的目的蛋白条带（图4），大小与预期结果相符。纯化蛋白经Western blotting分析（图5），与水貂阿留申病毒阳性血清呈特异性反应，证明表达产物具有良好的抗原性。
2.5 单克隆抗体的制备
细胞融合后，通过ELISA方法筛选到3株能稳定传代并分泌抗阿留申病毒VP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，分别为1F4F7D9、3E9G3D4、4B8B3F8。将这3株杂交瘤细胞分别注入小鼠腹腔制备腹水，经ELISA检测，3组实验小鼠腹水的单克隆抗体间接ELISA效价均在106以上。
3 讨论
由于ADV分离十分困难，笔者尝试过多次病毒分离，但一直未能分离到病毒。因此，采用直接从ADV阳性病料扩增VP2基因的方法，成功扩增出VP2部分基因，并将其克隆至表达载体pET-28a（+）中进行表达，成功获得重组VP2蛋白，经Western-blotting证明该重组蛋白具有良好的反应原性。
目前，阿留申病毒病作为危害世界养貂业的三大病毒性传染病之一，在我国许多地区都有不同程度的流行，给我国的养貂业带来了很大的损失[7]，因此建立敏感、特异、低成本、高通量的血清学检测方法，用来筛选淘汰发病水貂，建立非感染貂群显得尤为重要。对流免疫电泳（CIEP）是世界公认的、应用最广泛的AD检测方法，但CIEP中的抗原多是脏器抗原、细胞抗原等病毒抗原，病毒的浓缩和纯化成本较高，且存在散毒的风险，在应用中有一定的局限性[8]。本研究利用纯化的VP2重组蛋白免疫BALB/c小鼠，筛选到3株杂交瘤细胞，并获得3组单克隆抗体ELISA效价均在106以上的实验小鼠的腹水，为以单克隆抗体为基础建立高效的ELISA检测阿留申病毒的方法奠定了基础。
参 考 文 献：
[1] 郑 全， 王树志， 王全凯. 水貂阿留申病研究进展[J]. 经济动物学报， 2002， 6（4）：49-52.
[2] 梁冬莹， 华育平， 曾祥伟. 水貂阿留申病毒VP2基因主要抗原表位区的原核表达[J]. 东北林业大学学报， 2007， 35（6）：39-41.
[3] McKenna R， Olson N H， Chipman P R， et al. Three-dimensional structure of Aleutian mink disease parvovirus： implications for disease pathogencity[J]. J. Virol.， 1999， 73（8）：6882-6891.
[4] Bloom M E， Alexandersen S， Garon C F. Nucleotide sequence of the 5′-terminal palindrome of Aleutian mink disease parvovirus and construction of an infectious molecular clone [J]. J. Virol.， 1990， 64（7）：3551-3556.
[5] Wu W H， Bloom M E， Berry B D， et al. Expression of Aleutian mink disease parvovirus capsid proteins in abaculovirus expression system for potential diagnostic use[J]. J. Vet. Diagn. Invest.， 1994， 6（1）：23-29.
[6] Sambrook J， Fritsch E F， Maniatis T， 著. 金冬雁， 黎孟枫， 侯云德， 等译. 分子克隆实验指南（第二版）[M]. 北京：科学出版社， 1998， 862-897.
[7] 殷 震，刘景华. 动物病毒学（第二版）[M]. 北京：科学出版社，1997，1162-1165.
[8] 闫喜军，籍玉林. 我国水貂阿留申病流行现状、特点及防治技术[J]. 特种经济动植物，2004， 5：44.
关键词：水貂阿留申病毒；VP2重组蛋白；单克隆抗体
水貂阿留申病（Aleutian mink disease， AD）是一种由阿留申病毒（Aleutian mink disease parvovirus， ADV）引起的水貂自身免疫系统紊乱性疾病，目前在全国范围内广泛流行，是当今阻碍养貂业发展的主要传染病，其主要临床表现为母貂流产、新生子貂急性肺炎、成年水貂慢性免疫复合物介导的肾小球肾炎等[1]。病毒粒子中的蛋白分为结构和非结构蛋白两类，其中VP2是ADV的主要免疫原性抗原，是抗原决定簇的载体，与致病性密切相关，是目前研究最多的蛋白，VP2基因也已成为研究ADV毒力、致病性、抗原性和建立检测方法的首选基因[2～5]。本研究利用重组表达的水貂阿留申病毒VP2蛋白制备出单克隆抗体，为阿留申病毒的鉴定、检测等研究奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
水貂阿留申病毒相关病料、阳性血清由青岛农业大学特种经济动物教研室提供；骨髓瘤细胞Ag8.653、BALB/c小鼠由北京青元盛康生物医药科技有限公司提供。
病毒DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；胶回收试剂盒、IPTG、Ex Taq酶、限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DNA Marker、蛋白质预染Marker及非预染Marker购自宝生物工程（大连）有限公司；兔抗水貂IgG（HRP标记）购自美国Sigma-ldrich公司；DAB （3，3二氨基联苯胺）显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；其他试剂均为国产分析纯。
1.2 引物设计
根据GenBank收录的ADV全长序列（JN040434.1），选取VP2基因901～1 560 nt区域设计并合成引物。上游引物5′端引入BamHⅠ酶切位点，下游引物5′端引入XhoⅠ酶切位点。引物序列为：
1.3 VP2基因扩增
按照病毒DNA提取试剂盒说明提取病毒DNA，加入灭菌去离子水溶解。PCR反应体系：DNA模板2 μl，10×PCR buffer 5 μl，25 mmol/L MgCl2 2 μl，2.5 mmol/L dNTP 2 μl，20 μmol/L 上下游引物各1 μl，Ex Taq 0.5 μl，加灭菌去离子水至50 μl。反应条件：95℃预变性 3 min；94℃变性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸40 s，30个循环； 72℃延伸10 min。取5 μl反应产物1%琼脂糖凝胶电泳检验。
1.4 表达载体的构建
将扩增出的VP2基因片段回收并克隆至pMD18-T载体中，用BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切，鉴定为阳性的克隆质粒命名为pMD18-VP2。用BamHⅠ和XhoⅠ分别双酶切重组克隆质粒pMD18-VP2和pET-28a（+）载体，回收目的片段，16℃连接过夜，转化DH5α感受态细胞，提取质粒，用BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切，鉴定为阳性的质粒命名为pET28a-VP2。将阳性质粒pET28a-VP2转化BL21感受态细胞，提取质粒，BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定为阳性的质粒送上海博尚生物工程有限公司测序。
1.5 重组表达质粒诱导表达、纯化及Western blotting分析
挑取阳性菌于37℃培养待OD600值达到0.4～0.6时，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，37℃继续培养5 h。取诱导的菌体，用1×PBS缓冲液悬浮，利用超声波破碎菌体，离心，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳，确定目的蛋白表达情况。设置pET-28a（+）空载体转化株作为对照。
取100 ml经IPTG诱导表达的VP2蛋白菌液，按照Ni-NTA SefinoseTM Resin Kit说明书进行纯化，然后根据Sambrook等[6]方法进行Western blotting分析，最后加入DAB底物液显色并拍照。
1.6 单克隆抗体的制备
1.6.1 重组VP2蛋白的准备 诱导表达的VP2蛋白经Ni柱纯化后，定量，备用。
1.6.2 免疫小鼠 取健康8周龄BALB/c小鼠5只，足掌注射VP2蛋白免疫，共五次，剂量均为100 μg，首免与等体积弗氏完全佐剂乳化，二免与等体积弗氏不完全佐剂乳化，三、四、五次免疫不用佐剂。首免与二免间隔20 d，二免与三免间隔10 d，第三、四、五次免疫间隔3～7 d不等。五次免疫3 d后尾静脉采血，利用以表达的VP2蛋白作为包被抗原建立的ELISA方法测定静脉血中的抗体效价，选效价高的小鼠进行细胞融合试验。
1.6.3 杂交瘤细胞株的建立 分离免疫小鼠的脾脏并匀浆制备免疫脾细胞，按常规方法将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合；融合后7～10 d补加1%的HT培养液，用倒置显微镜观测细胞生长情况及有无杂交瘤形成，并作记录；待集落长到培养孔的1/4～1/3时进行抗体检测，检测到阳性孔（即能在其上清液中检测到特异性抗体）时，作克隆化培养；当阳性孔中的细胞集落很大时，吸出，移入已加有饲养细胞的24孔细胞培养板中继续培养（阳性克隆的筛选采用以表达的VP2蛋白作为包被抗原建立的ELISA方法；阳性孔的克隆化培养采用有限稀释法）。
1.6.4 小鼠腹水型单克隆抗体的生产 选取8～10周龄健康纯系雌性BALB/c小鼠12只，设3个杂交瘤细胞组和1个对照组，每组3只，于接种细胞前10 d注射无菌液体石蜡，每只0.5 ml；将杂交瘤细胞从培养瓶上吹下，培养物移入50 ml离心管中，室温800×g离心5 min，弃上清；用40 ml无菌PBS重悬细胞，离心，弃上清；重悬细胞于5 ml无菌PBS，进行细胞计数，并用台盼蓝拒染试验检测细胞活力是否接近100%；加入无菌PBS调整细胞浓度为5×106个/ml，向小鼠腹腔内注射0.5 ml细胞悬液，5 d后开始采集腹水；腹水于室温下1 500×g离心10 min，收集上清转移至高速离心管，4℃下15 000×g离心10 min，收集上清，标记好单抗名称和采集日期，-80℃保存。 腹水效价的测定：腹水从1∶200开始倍比稀释，利用以表达的VP2蛋白作为包被抗原建立的ELISA方法测定抗体效价。
2 结果与分析
2.1 VP2基因扩增
提取水貂阿留申病毒DNA，以此为模板进行PCR，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，获得一条大小为660 bp左右的片段（图1），与预期大小相符。
2.4 重组菌的诱导表达及Western blotting分析
重组菌经IPTG诱导后，获得高效表达，在沉淀中出现30.2 ku左右的目的蛋白条带（图4），大小与预期结果相符。纯化蛋白经Western blotting分析（图5），与水貂阿留申病毒阳性血清呈特异性反应，证明表达产物具有良好的抗原性。
2.5 单克隆抗体的制备
细胞融合后，通过ELISA方法筛选到3株能稳定传代并分泌抗阿留申病毒VP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，分别为1F4F7D9、3E9G3D4、4B8B3F8。将这3株杂交瘤细胞分别注入小鼠腹腔制备腹水，经ELISA检测，3组实验小鼠腹水的单克隆抗体间接ELISA效价均在106以上。
3 讨论
由于ADV分离十分困难，笔者尝试过多次病毒分离，但一直未能分离到病毒。因此，采用直接从ADV阳性病料扩增VP2基因的方法，成功扩增出VP2部分基因，并将其克隆至表达载体pET-28a（+）中进行表达，成功获得重组VP2蛋白，经Western-blotting证明该重组蛋白具有良好的反应原性。
目前，阿留申病毒病作为危害世界养貂业的三大病毒性传染病之一，在我国许多地区都有不同程度的流行，给我国的养貂业带来了很大的损失[7]，因此建立敏感、特异、低成本、高通量的血清学检测方法，用来筛选淘汰发病水貂，建立非感染貂群显得尤为重要。对流免疫电泳（CIEP）是世界公认的、应用最广泛的AD检测方法，但CIEP中的抗原多是脏器抗原、细胞抗原等病毒抗原，病毒的浓缩和纯化成本较高，且存在散毒的风险，在应用中有一定的局限性[8]。本研究利用纯化的VP2重组蛋白免疫BALB/c小鼠，筛选到3株杂交瘤细胞，并获得3组单克隆抗体ELISA效价均在106以上的实验小鼠的腹水，为以单克隆抗体为基础建立高效的ELISA检测阿留申病毒的方法奠定了基础。
参 考 文 献：
[1] 郑 全， 王树志， 王全凯. 水貂阿留申病研究进展[J]. 经济动物学报， 2002， 6（4）：49-52.
[2] 梁冬莹， 华育平， 曾祥伟. 水貂阿留申病毒VP2基因主要抗原表位区的原核表达[J]. 东北林业大学学报， 2007， 35（6）：39-41.
[3] McKenna R， Olson N H， Chipman P R， et al. Three-dimensional structure of Aleutian mink disease parvovirus： implications for disease pathogencity[J]. J. Virol.， 1999， 73（8）：6882-6891.
[4] Bloom M E， Alexandersen S， Garon C F. Nucleotide sequence of the 5′-terminal palindrome of Aleutian mink disease parvovirus and construction of an infectious molecular clone [J]. J. Virol.， 1990， 64（7）：3551-3556.
[5] Wu W H， Bloom M E， Berry B D， et al. Expression of Aleutian mink disease parvovirus capsid proteins in abaculovirus expression system for potential diagnostic use[J]. J. Vet. Diagn. Invest.， 1994， 6（1）：23-29.
[6] Sambrook J， Fritsch E F， Maniatis T， 著. 金冬雁， 黎孟枫， 侯云德， 等译. 分子克隆实验指南（第二版）[M]. 北京：科学出版社， 1998， 862-897.
[7] 殷 震，刘景华. 动物病毒学（第二版）[M]. 北京：科学出版社，1997，1162-1165.
[8] 闫喜军，籍玉林. 我国水貂阿留申病流行现状、特点及防治技术[J]. 特种经济动植物，2004， 5：44.