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摘要：目的：建立老鹳草凝胶的质量控制方法。方法：采用薄层色谱法(TCL)鉴别老鹳草凝胶中槲皮素、没食子酸；采用高效液相色谱(HPLC)测定槲皮素的含量。结果：色谱图斑点清晰、阴性对照无干扰。槲皮素进样量在0.002μg～2.544μg(r=0.99998)范围内与峰面积呈良好的线性关系，平均回收率为98.43％，RSD＝1.65％(n＝9)。结论：本方法简便、快速、准确，可作为该制剂质量控制的方法。
关键词：老鹳草凝胶；薄层鉴别；高效液相色谱法；没食子酸；槲皮素；含量测定
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1007-2349(2010)05-0064-02
老鹳草凝胶是在老鹳草软膏(《中国药典》一部，2005年)的基础上改剂型新药，该药具有除湿解毒，收敛生肌的功效，在临床上用于治疗湿毒蕴结所致的湿疹、痈、疔、疮及小面积水、火烫伤。
有关老鹳草化学成分的深入研究报道不多，大多文献报道的都是其化学成分的定性研究内容，定量研究几乎没有。老鹳草的主要化学成分包括鞣质、挥发油、黄酮和有机酸等。有关老鹳草的药理作用报道主要集中在抗炎镇痛、抗菌、抗病毒和抗氧化等几个方面。抗炎镇痛作用的活性物质主要在醋酸乙酯部分和水提部分，抗菌作用的活性物质主要在乙醇提取物部分，抗病毒作用的活性物质主要在水煎醇沉后的黄酮部分，抗氧化作用的活性物质主要是鞣质部分。药典老鹳草软膏的功能主治为除湿解毒，收敛生肌。结合以上两个方面，初步确定以槲皮素为含量测定检测指标。槲皮素具有广泛的药理作用，有抗氧化及清除氧自由基作用，能降低血压、保护心肌缺血再灌注损伤、免疫增强功能及抗癌、抗菌、抗病毒和镇痛等作用。原药典标准仅有颜色鉴别一项，专属性不强，不利于质量的控制。本文采用薄层色谱法(TLC)对其主要成分槲皮素和没食子酸进行了定性研究，并采用高效液相色谱法(HPLC)测定了其主要成分槲皮素的含量。经反复实验，确定的检测方法分离度高、重现性好、阴性无干扰，方法可行。
1 仪器与试药
1.1 仪器美国Agilent 1100高效液相色谱仪，带四元泵；DAD检测器；自动进样器；在线真空脱气机；智能化柱温箱及HP化学工作站；Mettler AG285型电子分析天平。
1.2 试药老鹳草凝胶由云南省药物研究所制剂室提供，槲皮素(批号：100081－200406，供含量测定用)、没食子酸(批号：831－9501，供含量测定用)对照品购自中国药品生物制品检定所。所用流动相甲醇为色谱纯，处理样品的甲醇为分析纯，磷酸、盐酸为分析纯，水为超纯水。
2 方法与结果
2.1 鉴别试验取本品2g，加10 mL水溶解，加乙醚提取2次，每次15 mL，弃乙醚层，水层加10 mL稀盐酸，水浴加热1 h，迅速冷却后滤过，加乙酸乙脂20、15、15 mL提取3次，弃水层，乙酸乙脂层挥干，残渣加甲醇2 mL溶解，作为供试品溶液，另取阴性样品2g，照供试品方法制得老鹳草阴性样品溶液。再分别取槲皮素和没食子酸对照品适量，加甲醇制成每1 mL含2 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2005年，附录ⅥB)试验，吸取上述3种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯一乙酸乙脂一甲酸(10：5：3)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3％三氯化铝显色，在105℃烘2 min，放冷，在254 nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点且阴性对照液无干扰。结果见图1。
2.2 含量测定
2.2.1 色谱条件Waters XTerra MS Ci8柱(5μm，4.6×250 mm)；流动相为甲醇－0.2％磷酸(50：50)，检测波长为370 nm，柱温35℃。理论板数按槲皮素峰计算应不低于3000；其他应符合药典要求。
2.2.2 供试品溶液的制备取样品约5g，精密称定，置50 mL量瓶中，加入甲醇－25％盐酸溶液(3：1)50 mL，精密称定重量。80℃水浴回流1.5 h，迅速冷至室温，甲醇－25％盐酸溶液(3：1)补重，滤过，即得。
2.2.3 对照品溶液的制备精密称取槲皮素对照品适量，置100mL量瓶中，加甲醇制成每1mL含0.02 mg的溶液，即得。
2.2.4 阴性样品溶液的制备取不含老鹳草提取物的凝胶基质2g，同供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液。
2.2.5 系统适用性实验按2.2.1中的色谱条件，分别取对照品溶液、阴性样品溶液、供试品溶液进样10 μL测定，分析结果见图2。结果被测组分分离效果较好，槲皮素峰达基线分离，理论板数按槲皮素峰计算大于5000。
2.2.6 线性关系考察精密称取槲皮素对照品25.44 mg，置100 mL量瓶中，加适量甲醇溶解后定容至刻度，摇匀，作为母液备用。分取0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、5.0、10 mL置25mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的滤膜过滤作为供试品溶液，按上述方法进样，检测，以进样量(μg)为横坐标x，峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线，得回归方程：Y=41248.47X-28.96，r=0.99998，结果槲皮素在0.002～2.544μg范围内有良好的线性关系。
2.2.7 精密度试验取配制好的对照品溶液按照上述方法依法测定，连续进样6次，以峰面积计算，结果RSD为0.31％(n＝6)，表明本法的精密度较好。
2.2.8 重现性试验取适量供试品(批号：20051019)按照供试品溶液制备方法同时制成6份供试液，进样10 μL测定，以峰面积计算槲皮素的含量为0.0161％RSD为1.30％(n＝6)，表明本法的重现性较好。
2.2.9 稳定性试验取已配制好的供试品溶液按照含量测定方法依法测定，分别于0、1、2、3、6、12、24 h进样，进样体积10μL，以峰面积计算，结果RSD为1.26％(n=7)，所得的样品中槲皮素峰面积基本一致，说明样品在24h内基本稳定。
2.2.10 加样回收率试验取9份供试品(批号：20051019，已测含量为0.0161％)，精密称定，分置已编号为1～9的锥形瓶中，在1、2、3号锥形瓶中分别加入浓度为0.0730 mg/mL的槲皮素对照品溶液各5 mL，在4、5、6号锥形瓶中分别加入浓度为0.0888 mg/mL的槲皮素对照品溶液各5 mL，在7、8、9号锥形瓶中分别加入浓度为0.1028 mg/mL的槲皮素对照品溶液各5 mL，然后按确定好的样品前处理方法同法处理，将处理好的供试溶液按含量测定方法同法测定，计算回收率，平均回收率为99.01％，RSD=1.36％(n＝9)。
2.2.11 样品含量测定分别取3批样品，照上述含量测定方法分别测定并计算槲皮素的含量。3批样品的平均含量为0.0157％。
3 讨论
样品中游离的槲皮素含量极低，响应值太小，所以选用了酸水解测定总槲皮素的方法，另外，本品的基质为卡波姆，大量酸提供的H’中和了卡波姆主链上的负电荷，使本来伸张的卡波姆主链收缩成团，降低了卡波姆的粘度，样品处理后过滤起来比较容易。
因为测定的是水解后的总槲皮素，本品中槲皮素的水解受酸的浓度、水解时间、水解温度及酸醇比例这4个因素的影响。为了比较全面的对槲皮素的水解条件进行掌控，本文对槲皮素的水解选用L9(34)正交表安排试验，实验结果显示最优的提取条件为A2C3D2B2，即以25％的盐酸与甲醇按3：1的比例，在80℃热回流90 min为提取条件，能得到较好的提取效果。
关键词：老鹳草凝胶；薄层鉴别；高效液相色谱法；没食子酸；槲皮素；含量测定
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1007-2349(2010)05-0064-02
老鹳草凝胶是在老鹳草软膏(《中国药典》一部，2005年)的基础上改剂型新药，该药具有除湿解毒，收敛生肌的功效，在临床上用于治疗湿毒蕴结所致的湿疹、痈、疔、疮及小面积水、火烫伤。
有关老鹳草化学成分的深入研究报道不多，大多文献报道的都是其化学成分的定性研究内容，定量研究几乎没有。老鹳草的主要化学成分包括鞣质、挥发油、黄酮和有机酸等。有关老鹳草的药理作用报道主要集中在抗炎镇痛、抗菌、抗病毒和抗氧化等几个方面。抗炎镇痛作用的活性物质主要在醋酸乙酯部分和水提部分，抗菌作用的活性物质主要在乙醇提取物部分，抗病毒作用的活性物质主要在水煎醇沉后的黄酮部分，抗氧化作用的活性物质主要是鞣质部分。药典老鹳草软膏的功能主治为除湿解毒，收敛生肌。结合以上两个方面，初步确定以槲皮素为含量测定检测指标。槲皮素具有广泛的药理作用，有抗氧化及清除氧自由基作用，能降低血压、保护心肌缺血再灌注损伤、免疫增强功能及抗癌、抗菌、抗病毒和镇痛等作用。原药典标准仅有颜色鉴别一项，专属性不强，不利于质量的控制。本文采用薄层色谱法(TLC)对其主要成分槲皮素和没食子酸进行了定性研究，并采用高效液相色谱法(HPLC)测定了其主要成分槲皮素的含量。经反复实验，确定的检测方法分离度高、重现性好、阴性无干扰，方法可行。
1 仪器与试药
1.1 仪器美国Agilent 1100高效液相色谱仪，带四元泵；DAD检测器；自动进样器；在线真空脱气机；智能化柱温箱及HP化学工作站；Mettler AG285型电子分析天平。
1.2 试药老鹳草凝胶由云南省药物研究所制剂室提供，槲皮素(批号：100081－200406，供含量测定用)、没食子酸(批号：831－9501，供含量测定用)对照品购自中国药品生物制品检定所。所用流动相甲醇为色谱纯，处理样品的甲醇为分析纯，磷酸、盐酸为分析纯，水为超纯水。
2 方法与结果
2.1 鉴别试验取本品2g，加10 mL水溶解，加乙醚提取2次，每次15 mL，弃乙醚层，水层加10 mL稀盐酸，水浴加热1 h，迅速冷却后滤过，加乙酸乙脂20、15、15 mL提取3次，弃水层，乙酸乙脂层挥干，残渣加甲醇2 mL溶解，作为供试品溶液，另取阴性样品2g，照供试品方法制得老鹳草阴性样品溶液。再分别取槲皮素和没食子酸对照品适量，加甲醇制成每1 mL含2 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2005年，附录ⅥB)试验，吸取上述3种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯一乙酸乙脂一甲酸(10：5：3)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3％三氯化铝显色，在105℃烘2 min，放冷，在254 nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点且阴性对照液无干扰。结果见图1。
2.2 含量测定
2.2.1 色谱条件Waters XTerra MS Ci8柱(5μm，4.6×250 mm)；流动相为甲醇－0.2％磷酸(50：50)，检测波长为370 nm，柱温35℃。理论板数按槲皮素峰计算应不低于3000；其他应符合药典要求。
2.2.2 供试品溶液的制备取样品约5g，精密称定，置50 mL量瓶中，加入甲醇－25％盐酸溶液(3：1)50 mL，精密称定重量。80℃水浴回流1.5 h，迅速冷至室温，甲醇－25％盐酸溶液(3：1)补重，滤过，即得。
2.2.3 对照品溶液的制备精密称取槲皮素对照品适量，置100mL量瓶中，加甲醇制成每1mL含0.02 mg的溶液，即得。
2.2.4 阴性样品溶液的制备取不含老鹳草提取物的凝胶基质2g，同供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液。
2.2.5 系统适用性实验按2.2.1中的色谱条件，分别取对照品溶液、阴性样品溶液、供试品溶液进样10 μL测定，分析结果见图2。结果被测组分分离效果较好，槲皮素峰达基线分离，理论板数按槲皮素峰计算大于5000。
2.2.6 线性关系考察精密称取槲皮素对照品25.44 mg，置100 mL量瓶中，加适量甲醇溶解后定容至刻度，摇匀，作为母液备用。分取0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、5.0、10 mL置25mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的滤膜过滤作为供试品溶液，按上述方法进样，检测，以进样量(μg)为横坐标x，峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线，得回归方程：Y=41248.47X-28.96，r=0.99998，结果槲皮素在0.002～2.544μg范围内有良好的线性关系。
2.2.7 精密度试验取配制好的对照品溶液按照上述方法依法测定，连续进样6次，以峰面积计算，结果RSD为0.31％(n＝6)，表明本法的精密度较好。
2.2.8 重现性试验取适量供试品(批号：20051019)按照供试品溶液制备方法同时制成6份供试液，进样10 μL测定，以峰面积计算槲皮素的含量为0.0161％RSD为1.30％(n＝6)，表明本法的重现性较好。
2.2.9 稳定性试验取已配制好的供试品溶液按照含量测定方法依法测定，分别于0、1、2、3、6、12、24 h进样，进样体积10μL，以峰面积计算，结果RSD为1.26％(n=7)，所得的样品中槲皮素峰面积基本一致，说明样品在24h内基本稳定。
2.2.10 加样回收率试验取9份供试品(批号：20051019，已测含量为0.0161％)，精密称定，分置已编号为1～9的锥形瓶中，在1、2、3号锥形瓶中分别加入浓度为0.0730 mg/mL的槲皮素对照品溶液各5 mL，在4、5、6号锥形瓶中分别加入浓度为0.0888 mg/mL的槲皮素对照品溶液各5 mL，在7、8、9号锥形瓶中分别加入浓度为0.1028 mg/mL的槲皮素对照品溶液各5 mL，然后按确定好的样品前处理方法同法处理，将处理好的供试溶液按含量测定方法同法测定，计算回收率，平均回收率为99.01％，RSD=1.36％(n＝9)。
2.2.11 样品含量测定分别取3批样品，照上述含量测定方法分别测定并计算槲皮素的含量。3批样品的平均含量为0.0157％。
3 讨论
样品中游离的槲皮素含量极低，响应值太小，所以选用了酸水解测定总槲皮素的方法，另外，本品的基质为卡波姆，大量酸提供的H’中和了卡波姆主链上的负电荷，使本来伸张的卡波姆主链收缩成团，降低了卡波姆的粘度，样品处理后过滤起来比较容易。
因为测定的是水解后的总槲皮素，本品中槲皮素的水解受酸的浓度、水解时间、水解温度及酸醇比例这4个因素的影响。为了比较全面的对槲皮素的水解条件进行掌控，本文对槲皮素的水解选用L9(34)正交表安排试验，实验结果显示最优的提取条件为A2C3D2B2，即以25％的盐酸与甲醇按3：1的比例，在80℃热回流90 min为提取条件，能得到较好的提取效果。