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摘 要 利用RACE技术从巴西橡胶树中克隆到一个叶绿体型FBPase基因，命名为HbcpFBPase。该基因的cDNA全长为1 512 bp，包含1 209 bp的开放阅读框，编码一个由402个氨基酸残基组成的蛋白，蛋白分子量大小约为43.88 ku，理论等电点为6.64。多重序列比对表明该基因为叶绿体型果糖-1，6-二磷酸酶。TargetP软件预测HbcpFBPase在叶绿体中的概率是0.961。实时荧光定量PCR分析表明，HbcpFBPase基因在雌花中表达量最高，雄花及种子次之；此外，机械伤害和割胶以及多种植物激素如乙烯利ET及植物生长素2，4-D可使HbcpFBPase基因下调表达。研究结果对进一步研究橡胶树光合作用碳固定、以及深入研究光合作用与胶乳合成之间的关系提供理论参考。
关键词 巴西橡胶树；HbcpFBPase基因；克隆；生物信息学；基因表达
中图分类号 S794.1 文献标识码 A
Abstract Fructose 1，6 - bisphosphatase（fructose-1，6-bisphosphatase， FBPase， EC 3.1.3.11）is a regulatory key enzyme for dark reactions of photosynthesis in green plants. In this study， the full-length cDNA of a putative chloroplast FBPase gene from Hevea brasiliensis was cloned by using rapid amplification of cDNA ends（RACE）technology， and named as HbcpFBPase. The nucleotide sequence of HbcpFBPase cDNA was 1 512 bp long， which contained an open reading frame（ORF）of 1 209 bp， and predicted a peptide of 402 amino-acids s with a molecular weight of 43.88 ku and a theoretical pI of 6.64. Multiple sequence alignment indicated that HbcpFBPase were grouped together with other known chloroplast FBPase enzymes. TargetP software predicting showed HbcpFBPase had a probability of 0.961 localized in the chloroplast. Real-time PCR analysis showed that HbcpFBPase gene was most highly expressed in the female flower， and then in male flower and seeds. Furthermore， HbcpFBPase expressions were found to be down regulated by wounding， tapping and several phytohormones（ethylene and auxin）. This study will be beneficial to further studies of rubber tree carbon fixation of photosynthesis， as well as the relationship between photosynthesis and rubber latex production.
Key words Hevea brasiliensis； HbcpFBPase； Gene cloning； Bioinformatics analysis； Gene expression
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.03.002
天然橡胶是一种重要的工业原料，在交通运输及军用工业中都发挥着重要作用。世界上产胶植物有2 000余种[1]，其中99%的天然橡胶来自巴西橡胶树[2]。与其它高等绿色植物一样，橡胶树利用光合作用在源组织叶片中合成蔗糖，为橡胶烃合成提供原料，因此，蔗糖的分配和利用将直接影响巴西橡胶树的橡胶合成。
果糖-1，6-二磷酸酶（fructose-1，6-bisphosphatase，FBPase，EC 3.1.3.11）是在绿色植物光合作用暗反应阶段起重要调控作用的关键酶。高等植物中存在着2种果糖-1，6-二磷酸酶（fructose-1，6-bisphosphatase，FBPase）：胞质型（cyFBPase）和叶绿体型（cpFBPase），分别在糖异生代谢和光合作用中起关键作用[3-8]。大多数高等植物中的FBPase以单聚体、二聚体和四聚体的形式存在，其中有催化活性的是四聚体形式的FBPase[9]。叶绿体和胞质中的果糖-1，6-二磷酸酶均能被高度地调控，但调控的机制却不同，cyFBPase在糖异生中起调控作用，受腺苷一磷酸（AMP）和果糖-1，6-二磷酸的强烈变构抑制；相反的，cpFBPase在光合作用中起调控作用，对AMP和果糖-1，6-二磷酸均不敏感[10]。
光合生物固定CO2的限速步骤主要集中在光合作用暗反应阶段[11]，而其中的Calvin循环（即C3循环）是所有光合生物碳元素光合流动过程的中心环节[12]。叶绿体型果糖-1，6-二磷酸酶是Calvin循环中一个非常关键的酶，该酶参与产生二氧化碳接受体的反应，将果糖-1，6-二磷酸不可逆的水解成果糖-6-磷酸，并且调控着Clavin循环中PO43-的循环[13-14]。FBPase的含量与同一反应中的其他酶类相比极其微弱，但其作用却是极为重要的[15]。 2000年，Tang等[16]克隆得到小麦cpFBPase基因，其转化大肠杆菌后得到该基因的高表达；2001年，Miyagawa等[17]将蓝藻叶绿体的FBPase/SBPase转入烟草中，提高了转基因烟草的光合能力和糖类的积累，并且加速了其植株的生长。2002年，Tine Thorbjornsen等[18]成功地分离到马铃薯cpFBPase基因，并进行了转化分析，与野生型的马铃薯块茎相比转化株含有更高的叶绿体FBPase活性，并且积累更多的淀粉。综合前人的研究结果，初步表明叶绿型FBPase在源组织及库组织的糖代谢中均发挥重要调控作用。此外，Xiao等[19]最近研究结果表明，cpFBPase在如高温、干旱等非生物胁迫下也起着重要的作用。
本研究首次从巴西橡胶树中分离并获得一个叶绿体型FBPase基因，利用生物信息学平台分析该基因的结构功能，并采用实时荧光定量PCR技术分析该基因的表达模式。解析HbcpFBPase基因的结构和功能，研究HbcpFBPase基因的表达模式，有助于初步揭示橡胶树叶绿体型FBPase在光合作用以及在糖代谢过程中的调控机理，为进一步研究橡胶树光合作用、胶乳糖代谢提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 供试材料为热研7-33-97橡胶树无性系，由中国热带农业科学院橡胶研究所培育，种植于中国热带农业科学院试验场三队。
1.1.2 载体与菌株 克隆载体pMDR18-T Simple Vector购自大连宝生物公司（TaKaRa），Escherichia coli JM109菌株由本实验室保存。
1.1.3 药品与试剂 反转录试剂盒RevertAidTM First Stand cDNA Systhesis Kit为Fermentas公司产品；TransTaq DNA Polymerase HiFi Fidelity（HiFi）购自北京全式金生物技术有限公司；DNA凝胶回收试剂盒Gel Extraction Kit为OMEGA公司产品；实时荧光定量PCR试剂SYBRR Premix Ex TaqTMⅡ（Perfect Real Time）为大连宝生物公司（TaKaRa）产品；引物合成和测序均由上海英骏生物技术有限公司（Introvigen）完成；其它生化试剂为进口或国产分析纯试剂，购自上海生物工程技术服务有限公司。
1.2 方法
1.2.1 植物材料处理 同一处理的试验用橡胶树均在相同林段中，胶乳、树皮、树叶、种子、雌花和雄花等组织来自于中国热带农业科学院试验场三队的热研7-33-97品系，其中胶乳的具体采集方法参照Tang等[20]方法进行。
不同发育时期叶片选用同一林段的未开割橡胶树，按照叶芽、古铜期、变色期、淡绿期、稳定期和衰老期，分别选取15株；每5株采取后的样品混在一起作为一个重复，共3个重复。
激素处理选用已开割3 a的巴西橡胶树，在采胶前3、12、24 h分别将乙烯利（ET，1.5%）、茉莉酸（JA，0.005%）、脱落酸（ABA，200 μmol/L）、细胞分裂素（CTK，200 μmol/L）、赤霉素（GA，100 μmol/L）、水杨酸（SA，200 μmol/L）及植物生长素（2，4-D，66 μmol/L）涂于割线及其上部约2 cm的割面，以0 h为对照，于同一时间采集胶乳[20-21]。
伤害和割胶处理均选用树龄8 a且已达到开割标准的未开割橡胶树，具体处理方法参照相关文献[22]进行。
死皮树材料选取轻度死皮（死皮率<30%），中度死皮（30%～60%）和严重死皮（60%～90%）3种情况，以健康树为对照，于同一时间采集胶乳。
1.2.2 胶乳总RNA提取及cDNA第一链的合成
橡胶树胶乳总RNA的提取采用本实验室改良的提取方法[24]，其他组织RNA提取参照Kiefer等[23]提取方法进行，cDNA第一条链合成使用Fermentas公司反转录试剂盒，具体操作步骤按照说明书进行。
1.2.3 HbcpFBPase基因全长cDNA的克隆 结合NCBI上搜索得到的白杨树（XP_002323933.2）以及蓖麻（XM_002532720.1）的果糖-1，6-二磷酸酶（FBPase）的核苷酸序列，搜索本实验室的转录组数据库，得到一条拼接序列。以此设计特异性引物进行扩增（见表1），并利用cDNA末端的快速扩增技术（RACE），最终获得包含完整读码框的cDNA全长序列。1%的琼脂糖凝胶电泳检测，获得目的片段，回收产物连接于pMD18-T载体，送上海英骏生物技术有限公司测序。
1.2.4 生物信息学分析 HbcpFBPase基因核苷酸翻译及多序列比对使用DNAMAN7.0软件；采用ExPASy服务系统中的ProtParam工具对蛋白质基本理化性质进行预测（http：//us.expasy.org/tools/protparam.html）；通过NCBI的在线软件CDD（conserved domain database）对该基因的保守结构域进行分析；亚细胞定位采用TargetP预测http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/；其他物种的氨基酸序列来源于NCBI数据库，使用MEGA5.05软件，采用Neighbor-Joining方法进行聚类分析，进行1 000次bootstrap统计学检验。
1.2.5 实时荧光定量PCR分析 利用实时荧光定量PCR技术分析HbcpFBPase基因在不同组织，以及割胶、伤害、不同激素等各种处理下的表达模式，采用大连宝生物公司（TaKaRa）的实时荧光定量PCR试剂盒SYBRR Premix Ex TaqTM Ⅱ（Perfect Real Time），使用罗氏公司LightCycler2.0实时荧光定量PCR系统。根据克隆得到的HbcpFBPase基因cDNA全长序列设计引物HbcpFBPase-Q-F、HbcpFBPase-Q-R（表1），使用YLS8（yellow leaf-specific protein 8）[20]作为内参基因（表1），每个样品设3个重复，分析HbcpFBPase基因的表达模式。 2 结果与分析
2.1 HbcpFBPase基因的克隆与序列分析
根据蓖麻和杨树FBPase基因的核苷酸序列，在橡胶树胶乳转录组数据库中进行搜索，拼接得到一条1 200 bp的核苷酸序列。设计特异引物，以橡胶树cDNA为模板获得一条1 146 bp的核苷酸序列，再采用5′RACE技术后，最终获得包含完整读码框的cDNA全长序列。序列分析发现该片段为橡胶树FBPase基因的cDNA全长序列1 513 bp，ORF Finder软件分析结果显示，该序列包含233 bp的5′非编码区（5′UTR），71 bp的3′非编码区（3′UTR），以及长度为1 209 bp的开放阅读框（ORF）（图1）。
2.2 HbcpFBPase基因生物信息学分析
采用ProtParam tool软件预测该基因编码了一个由402个氨基酸残基组成的蛋白，蛋白分子量大小约为43.88 ku；氨基酸组成分析结果显示，该蛋白富含丝氨酸Ser（10.2%），甘氨酸Gly（9.5%）和异亮氨酸Leu（9.0%），而半胱氨酸Cys（0.7%）和色氨酸Trp（0.5%）含量较低。该蛋白理论等电点（PI）为6.64，不稳定系数为（Instability index）42.32，说明该蛋白属于不稳定蛋白。
NCBI在线软件CDD（conserved domain database）分析结果显示，该蛋白含有果糖-1，6-二磷酸酶保守结构域（FBPase，Fructose-1，6-bisphosphatase，cd00354）。Blast比对结果表明，该蛋白氨基酸序列与蓖麻（Ricinus communis，XP_002532766），毛果杨（Populus trichocarpa，XP_002323933.2），葡萄（Vitis vinifera，XP_002270826），可可（Theobroma cacao，XP_007042824.1）的叶绿体型FBPase氨基酸序列同源性分别达到了82%、81%、75%、75%（图2星号所示为活性位点）。用TargetP软件亚细胞定位预测结果显示，HbcpFBPase在叶绿体中的概率为0.961，因此综合推测该蛋白为橡胶树叶绿体型果糖-1，6-二磷酸酶，命名为HbcpFBPase。
2.3 氨基酸序列比对及进化树构建
为了进一步比较橡胶树和其他植物果糖-1，6-二磷酸酶基因在进化上的相互关系，选取蓖麻（Ricinus communis）、可可（Theobroma cacao）、毛果杨（Populus trichocarpa）、葡萄（Vitis vinifera）、黄瓜（Cucumis sativus）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、荠菜（Capsella rubella）、大豆（Glycine max）、鹰嘴豆（Cicer arietinum）、大麦（Hordeum vulgare）、水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）、高粱（Sorghum bicolor）、二穗短柄草（Brachypodiumdistachyon）、小米（Setaria italica）、苜蓿（Medicago truncatula）16个物种，搜索其FBPase蛋白氨基酸序列17条，利用Mega5.05软件，采用Neighbor-Joining，进行1 000次bootstrap统计学检验构建进化树（图3）。结果显示，17条FBPase蛋白序列被分为两类，即I类双子叶植物，其中包括本次研究的橡胶树和双子叶模式生物拟南芥；II类单子叶植物，其中包括水稻、玉米等典型的单子叶植物。HbcpFBPase与其他物种FBPase的蛋白序列同源性均较高，这也说明该基因在进化过程中相对保守。
2.4 HbcpFBPase表达分析
2.4.1 HbcpFBPase基因的组织特异表达模式分析
采用实时荧光定量PCR技术分析HbcpFBPase基因在橡胶树不同组织中的表达特性，结果显示，该基因在橡胶树雌花、雄花、种子、根、树皮、叶片及胶乳中均有表达，其中在雌花中的表达丰度最高；其次在雄花、种子、根及树皮中的表达次之；胶乳中表达丰度最低（图4）。
2.4.2 HbcpFBPase基因在叶片发育过程中的表达模式分析 在橡胶树叶片芽期到稳定期的发育过程中，HbcpFBPase基因表达丰度变化不大，在衰老期其表达量达到峰值（图5）。
2.4.3 HbcpFBPase在不同激素处理下的表达模式分析 分析7种不同激素（乙烯利ET、茉莉酸JA、脱落酸ABA、细胞分裂素CTK、赤霉素GA、水杨酸SA及植物生长素2，4-D）对该基因在胶乳中表达调控的影响，发现乙烯利ET和植物生长素2，4-D处理后该基因下调表达，且均在处理24 h表达量降至最低；脱落酸ABA和水杨酸SA处理后，其表达量有缓慢上升的趋势；赤霉素GA处理则呈现先下调，后在24 h时上调至0 h对照的表达水平；而茉莉酸JA、细胞分裂素CTK则对HbcpFBPase基因的表达无明显影响（图6）。
2.4.4 HbcpFBPase在割胶及伤害处理下的表达模式分析 分析HbcpFBPase基因在割胶及伤害处理下的表达模式，结果表明，伤害处理使胶乳中HbcpFBPase基因明显下调表达，在处理12 h表达量降到最低，这一点和乙烯利刺激后变化趋势相似，可能是因为伤害处理后会产生乙烯有关；在未开割树中，割胶明显影响胶乳中HbcpFBPase基因的表达，与第一刀的表达水平相比，第二刀中HbcpFBPase基因略有上调，但此后直到第6刀明显下调表达，且在第6刀后一直保持低水平表达（图7）。
在不同死皮程度橡胶树的胶乳中，HbcpFBPase基因的表达模式与死皮程度没有明显的关联。 3 讨论与结论
叶绿体型果糖-1，6-二磷酸酶是植物Calvin循环的关键酶之一，其参与CO2接受体再生的反应，催化果糖-1，6-二磷酸生成果糖-6-磷酸，并且也参与在叶绿体中淀粉的合成[25]。在高等植物中，原初同化产物一部分以三碳糖的形式被运输到细胞质中用于蔗糖的合成及其它代谢，另一部分则留在叶绿体中转化为淀粉，cpFBPase催化产物果糖-6-磷酸是代谢物从卡尔文循环进入淀粉合成过程中的分支点。因此，cpFBPase也许在调节蔗糖和淀粉的碳分配中起着重要作用[26-30]。
在巴西橡胶树中，蔗糖是合成天然橡胶的主要原料，源组织叶片光合作用合成蔗糖的能力，以及乳管中蔗糖的代谢水平均影响橡胶树的产胶能力，因此蔗糖的合成和供给与橡胶树的产量密切相关[31-33]。本研究首次从橡胶树中分离并获得一个叶绿体型果糖-1，6-二磷酸酶基因，实时荧光定量PCR分析表明，HbcpFBPase基因在分析的7种组织中均有表达，其中在雌花中表达量最高，雄花及种子次之，此前也有研究者以油茶“湘林 1 号”的近成熟种子为材料，在库组织中克隆获得油茶cpFBPase基因[15]；且该基因在库组织胶乳中的表达受割胶和伤害影响，推测其不仅仅只作用于光合作用暗反应阶段，可能也与cyFBPase一样通过糖代谢的方式参与橡胶树胶乳再生过程[34]。在所进行的7种激素（乙烯利ET、茉莉酸JA、脱落酸ABA、细胞分裂素CTK、赤霉素GA、水杨酸SA及植物生长素2，4-D）处理中，ET能明显下调HbcpFBPase的表达，在处理12 h后的mRNA表达量降低到对照的一半左右（图5），推断该基因启动子中可能含有受乙烯利诱导的顺式调控元件，但其受乙烯利调控的分子机制和生理学意义还需进一步验证[35]。在ABA、GA、SA及2，4-D处理后，该基因的表达量略有变化，但并不明显；而在JA和CTK处理下，表达量几乎不受影响。除此之外，本研究分析了该基因在不同发育时期叶片中的表达模式，结果表明HbcpFBPase基因与叶片发育进程关系不大，推测其可能直接影响光合作用效率及碳水化合物的积累[17]。
本研究结果初步表明，橡胶树cpFBPase在库组织胶乳糖代谢调控中发挥重要作用，在后续研究中，将进一步研究其在胶乳糖代谢中的调控能力，从而为揭示橡胶树产胶机理提供一定的理论基础。同时，本实验尚未涉及到光合作相关实验，后续研究将关注该基因在光合作用碳固定中的调控能力。
参考文献
[1] 何 康，黄宗道. 热带北缘橡胶树栽培[M].广东科技出版社，1987： 1.
[2] Allen P W， Jones K P. A historical perspective of the rubber industry. In “Natural rubber scienceand technology” （Roberts A.D.）[M]. Oxford University Press， 1988.
[3] Zimmermann G， Kelly G J， Latzko E. Efficient purification and molecular properties of spinach chloroplast fructose-1，6-bisphosphatase[J]. Eur J Biochem， 1976， 70： 361-367.
[4] Zimmermann G， Kelly G J， Latzko E. Purification and properties of spinach leaf cytoplasmic fructose-1，6-bisphosphatase[J]. J Biol Chem 1978， 253： 5 952-5 955.
[5] Eli Khayat， Chee Harn， Jaleh Daie. Purif ication and light～dependent molecular modulation of the cytosolic Fructose～l，6～Bisphosphatase in sugarbeet leaves[J]. Plant Physiol， 1993， 101： 57-64.
[6] Si L Z， Cao S Y， Chu C C. Isolation of a 1 195 bp 5 '～rice cytosolic fructose～1， 6～bisphosphatase and analysis of its expression in transgenic rice[J]. Acta Botanica Sinica， 2003， 45（3）： 359-364.
[7] Daie J. Cytosolic fructose-1，6-bisphosphatase： a key enzyme in the sucrose biosynthetic pathway[J]. Photosynthesis Research， 1993， 38： 5-14.
[8] Chueca A. Chloroplast fructose-1，6-bisphosphatase： structure and function[J]. Photosynthesis Research， 2002， 74： 235-249.
[9] Schnarrenberger C， Martin W. The Calvin cycle： A historical perspective[J].. Photosynthetica， 1997， 33： 331-345.
[10] 叶冰莹， 黄金存， 邵武华. 甘蔗果糖-1，6-二磷酸酯酶的 cDNA片段克隆及序列分析[J]. 中国糖科， 2009， 3： 1-4. [11] Hall D O， Rao K K.Photosynthesis[M]. New York： Cambridge Univ Press， 1995： 97-126.
[12] Jing Y X， Kuang T Y， Li D B， et al. Molecular Biology of Plants[M]. Beijing： Science Press， 1995.
[13] Serrato， A J. Changing sugar partitioning in FBPase～manipulated plants[J]. J Exp Bot， 2009. 60（10）： 2 923-2 931.
[14] Marcus F， Gontero B， Harrsch P B， et al. Amino acid sequence homology among fructose-1，6-bisphosphatases[J]. Biochem Biophys Res Commun， 1986， 135（2）： 374-381.
[15] 谭晓风， 曹彦妮， 郭静怡. 油茶FBPase基因的全长cDNA克隆及序列分析[J]. 江西农业大学学报， 2011， 33（3）： 514-520.
[16] Tang G L， Wang Y F， Chen H B. Overexpression in Escherichia coli and Characterization of the Chlaoroplast Fructose～1， 6～bisphosphatase from Wheat[J]. Protein Expression and Purification， 2000， 19： 411-418.
[17] Miyagawa Y， Tamoi M， Shigeoka S. Overexpression of a cyanobacterial fructose-1，6-/sedoheptulose～1，7～bisphosphatase in tobacco enhances photosynthesis and growth[J]. Nat Biotechnol， 2001， 19（10）： 965-969.
[18] Thorbjornsen T， Asp T， Jorgensen K， et al. Starch biosynthesis from triose～phosphate in transgenic potato tubers expressing plastidic fructose-1，6-bisphosphatase[J]. Planta， 2002， 214（4）： 616-624.
[19] Xiao H D， Chen C S， Xu Y. Cloning and expression analysis of the chloroplast fructose-1，6-bisphosphatase gene from Pyropia haitanensis Acta Oceanol[J]. Sin.， 2014， 33（4）： 92-100.
[20] Tang C R. A convenient and efficient protocol for isolating high～quality RNA from latex of Hevea brasiliensis（para rubber tree）[J]. J. Biochem. Biophys Methods， 2007. 70（5）： 749-754.
[21] Kongsawadworakul P， Peret B， Morin D， et al. and Chrestin H. Ethylene～cyanide metabolism[C]//ACC～oxidase and cyanoalanine synthase cross～roads in Hevea brasiliensis： Effects induced by yield stimulation with EthrelR and other stresses. Proceedings of IRRDB Conference， Kunming， China，2004： 331-345.
[22] Tang C R， Huang D B， Yang J H. The sucrose transporter HbSUT3 plays an active role in sucrose loading to laticifer and rubber productivity in exploited trees of Hevea brasiliensis （para rubber tree）[J]. Plant， Cell and Environment 2010， 33： 1 708-1 720.
[23] Kiefer E， Heller W， Ernst D. A simple and efficient protocol for isolation of functional RNA from plant tissues rich in secondary metabolites[J]. Plant Mol Biol Rep， 2000， 18： 33-39.
[24] Li H P， Qin Y X， Xiao X H， et al. Screening of valid internal control genes for gene expression studies in Hevea brasiliensis by real time PCR and expression validation of a sucrose transporter gene HbSUT3[J]. Plant Sci， 2011， 182（2）： 132-139. [25] 司丽珍， 储成才. 植物蔗糖合成的分子机制[J]. 中国生物工程杂志， 2003， 23（1）： 11-16， 29.
[26] 马为民， 施定基， 王全喜. 用基因工程提高光合同化CO2效率的一个关键酶--果糖-1，6-二磷酸酶[J]. 生物化学与生物物理进展， 2003（3）： 446.
[27] Woodrow I E， Berry J A. Enzymic regulation of photosynthetic CO2 fixation in C3 plants[J]. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 1988， 39： 533-594.
[28] Geiger D R， Servaites J C. Diurnalre gelation of photosynthetic carbon metabolism in C3 plants[J]. Annu RevPlant Physiol Plant Mol Biol， 1994， 5： 235-256.
[29] Kobmann J， Sonnewald U， Willmitzer L. Reduction of the chloroplastic fructose-1，6-bisphosphatase in transgenic potato plants impairs photosynthesis and plant growth[J]. Plant J， 1994， 6： 637-650.
[30] Raines CA. The Calvin cycle revisited[J]. Photosynth Res，2003， 75： 1-10.
[31] 阳江华， 黄德宝， 刘术金. 巴西橡胶树6个蔗糖转运蛋白基因的克隆与序列分析[J]. 热带作物学报， 2007， 28（4）： 32-38.
[32] 肖小虎， 戚继艳， 方永军. 巴西橡胶树中碱性转化酶HbNINa基因的克隆和表达模式分析[J]. 热带作物学报，2013， 34（7）： 1 264-1 269.
[33] 唐朝荣， 肖小虎， 方永军. 巴西橡胶树磷酸蔗糖磷酸化酶基因的克隆和表达模式分析[J]. 热带作物学报， 2013， 34（5）： 855-859.
[34] 龙翔宇， 曹 冰， 梁启福. 橡胶树果糖-1，6-双磷酸酯酶基因的克隆及表达特性分析[J]. 植物生理学报， 2013， 49（11）： 1 212-1 220.
[35] 黄亚成， 秦云霞， 刘林娅. 橡胶树HbRAN1基因的克隆和表达分析[J]. 热带作物学报， 2013， 34（7）： 1 257-1 263.
关键词 巴西橡胶树；HbcpFBPase基因；克隆；生物信息学；基因表达
中图分类号 S794.1 文献标识码 A
Abstract Fructose 1，6 - bisphosphatase（fructose-1，6-bisphosphatase， FBPase， EC 3.1.3.11）is a regulatory key enzyme for dark reactions of photosynthesis in green plants. In this study， the full-length cDNA of a putative chloroplast FBPase gene from Hevea brasiliensis was cloned by using rapid amplification of cDNA ends（RACE）technology， and named as HbcpFBPase. The nucleotide sequence of HbcpFBPase cDNA was 1 512 bp long， which contained an open reading frame（ORF）of 1 209 bp， and predicted a peptide of 402 amino-acids s with a molecular weight of 43.88 ku and a theoretical pI of 6.64. Multiple sequence alignment indicated that HbcpFBPase were grouped together with other known chloroplast FBPase enzymes. TargetP software predicting showed HbcpFBPase had a probability of 0.961 localized in the chloroplast. Real-time PCR analysis showed that HbcpFBPase gene was most highly expressed in the female flower， and then in male flower and seeds. Furthermore， HbcpFBPase expressions were found to be down regulated by wounding， tapping and several phytohormones（ethylene and auxin）. This study will be beneficial to further studies of rubber tree carbon fixation of photosynthesis， as well as the relationship between photosynthesis and rubber latex production.
Key words Hevea brasiliensis； HbcpFBPase； Gene cloning； Bioinformatics analysis； Gene expression
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.03.002
天然橡胶是一种重要的工业原料，在交通运输及军用工业中都发挥着重要作用。世界上产胶植物有2 000余种[1]，其中99%的天然橡胶来自巴西橡胶树[2]。与其它高等绿色植物一样，橡胶树利用光合作用在源组织叶片中合成蔗糖，为橡胶烃合成提供原料，因此，蔗糖的分配和利用将直接影响巴西橡胶树的橡胶合成。
果糖-1，6-二磷酸酶（fructose-1，6-bisphosphatase，FBPase，EC 3.1.3.11）是在绿色植物光合作用暗反应阶段起重要调控作用的关键酶。高等植物中存在着2种果糖-1，6-二磷酸酶（fructose-1，6-bisphosphatase，FBPase）：胞质型（cyFBPase）和叶绿体型（cpFBPase），分别在糖异生代谢和光合作用中起关键作用[3-8]。大多数高等植物中的FBPase以单聚体、二聚体和四聚体的形式存在，其中有催化活性的是四聚体形式的FBPase[9]。叶绿体和胞质中的果糖-1，6-二磷酸酶均能被高度地调控，但调控的机制却不同，cyFBPase在糖异生中起调控作用，受腺苷一磷酸（AMP）和果糖-1，6-二磷酸的强烈变构抑制；相反的，cpFBPase在光合作用中起调控作用，对AMP和果糖-1，6-二磷酸均不敏感[10]。
光合生物固定CO2的限速步骤主要集中在光合作用暗反应阶段[11]，而其中的Calvin循环（即C3循环）是所有光合生物碳元素光合流动过程的中心环节[12]。叶绿体型果糖-1，6-二磷酸酶是Calvin循环中一个非常关键的酶，该酶参与产生二氧化碳接受体的反应，将果糖-1，6-二磷酸不可逆的水解成果糖-6-磷酸，并且调控着Clavin循环中PO43-的循环[13-14]。FBPase的含量与同一反应中的其他酶类相比极其微弱，但其作用却是极为重要的[15]。 2000年，Tang等[16]克隆得到小麦cpFBPase基因，其转化大肠杆菌后得到该基因的高表达；2001年，Miyagawa等[17]将蓝藻叶绿体的FBPase/SBPase转入烟草中，提高了转基因烟草的光合能力和糖类的积累，并且加速了其植株的生长。2002年，Tine Thorbjornsen等[18]成功地分离到马铃薯cpFBPase基因，并进行了转化分析，与野生型的马铃薯块茎相比转化株含有更高的叶绿体FBPase活性，并且积累更多的淀粉。综合前人的研究结果，初步表明叶绿型FBPase在源组织及库组织的糖代谢中均发挥重要调控作用。此外，Xiao等[19]最近研究结果表明，cpFBPase在如高温、干旱等非生物胁迫下也起着重要的作用。
本研究首次从巴西橡胶树中分离并获得一个叶绿体型FBPase基因，利用生物信息学平台分析该基因的结构功能，并采用实时荧光定量PCR技术分析该基因的表达模式。解析HbcpFBPase基因的结构和功能，研究HbcpFBPase基因的表达模式，有助于初步揭示橡胶树叶绿体型FBPase在光合作用以及在糖代谢过程中的调控机理，为进一步研究橡胶树光合作用、胶乳糖代谢提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 供试材料为热研7-33-97橡胶树无性系，由中国热带农业科学院橡胶研究所培育，种植于中国热带农业科学院试验场三队。
1.1.2 载体与菌株 克隆载体pMDR18-T Simple Vector购自大连宝生物公司（TaKaRa），Escherichia coli JM109菌株由本实验室保存。
1.1.3 药品与试剂 反转录试剂盒RevertAidTM First Stand cDNA Systhesis Kit为Fermentas公司产品；TransTaq DNA Polymerase HiFi Fidelity（HiFi）购自北京全式金生物技术有限公司；DNA凝胶回收试剂盒Gel Extraction Kit为OMEGA公司产品；实时荧光定量PCR试剂SYBRR Premix Ex TaqTMⅡ（Perfect Real Time）为大连宝生物公司（TaKaRa）产品；引物合成和测序均由上海英骏生物技术有限公司（Introvigen）完成；其它生化试剂为进口或国产分析纯试剂，购自上海生物工程技术服务有限公司。
1.2 方法
1.2.1 植物材料处理 同一处理的试验用橡胶树均在相同林段中，胶乳、树皮、树叶、种子、雌花和雄花等组织来自于中国热带农业科学院试验场三队的热研7-33-97品系，其中胶乳的具体采集方法参照Tang等[20]方法进行。
不同发育时期叶片选用同一林段的未开割橡胶树，按照叶芽、古铜期、变色期、淡绿期、稳定期和衰老期，分别选取15株；每5株采取后的样品混在一起作为一个重复，共3个重复。
激素处理选用已开割3 a的巴西橡胶树，在采胶前3、12、24 h分别将乙烯利（ET，1.5%）、茉莉酸（JA，0.005%）、脱落酸（ABA，200 μmol/L）、细胞分裂素（CTK，200 μmol/L）、赤霉素（GA，100 μmol/L）、水杨酸（SA，200 μmol/L）及植物生长素（2，4-D，66 μmol/L）涂于割线及其上部约2 cm的割面，以0 h为对照，于同一时间采集胶乳[20-21]。
伤害和割胶处理均选用树龄8 a且已达到开割标准的未开割橡胶树，具体处理方法参照相关文献[22]进行。
死皮树材料选取轻度死皮（死皮率<30%），中度死皮（30%～60%）和严重死皮（60%～90%）3种情况，以健康树为对照，于同一时间采集胶乳。
1.2.2 胶乳总RNA提取及cDNA第一链的合成
橡胶树胶乳总RNA的提取采用本实验室改良的提取方法[24]，其他组织RNA提取参照Kiefer等[23]提取方法进行，cDNA第一条链合成使用Fermentas公司反转录试剂盒，具体操作步骤按照说明书进行。
1.2.3 HbcpFBPase基因全长cDNA的克隆 结合NCBI上搜索得到的白杨树（XP_002323933.2）以及蓖麻（XM_002532720.1）的果糖-1，6-二磷酸酶（FBPase）的核苷酸序列，搜索本实验室的转录组数据库，得到一条拼接序列。以此设计特异性引物进行扩增（见表1），并利用cDNA末端的快速扩增技术（RACE），最终获得包含完整读码框的cDNA全长序列。1%的琼脂糖凝胶电泳检测，获得目的片段，回收产物连接于pMD18-T载体，送上海英骏生物技术有限公司测序。
1.2.4 生物信息学分析 HbcpFBPase基因核苷酸翻译及多序列比对使用DNAMAN7.0软件；采用ExPASy服务系统中的ProtParam工具对蛋白质基本理化性质进行预测（http：//us.expasy.org/tools/protparam.html）；通过NCBI的在线软件CDD（conserved domain database）对该基因的保守结构域进行分析；亚细胞定位采用TargetP预测http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/；其他物种的氨基酸序列来源于NCBI数据库，使用MEGA5.05软件，采用Neighbor-Joining方法进行聚类分析，进行1 000次bootstrap统计学检验。
1.2.5 实时荧光定量PCR分析 利用实时荧光定量PCR技术分析HbcpFBPase基因在不同组织，以及割胶、伤害、不同激素等各种处理下的表达模式，采用大连宝生物公司（TaKaRa）的实时荧光定量PCR试剂盒SYBRR Premix Ex TaqTM Ⅱ（Perfect Real Time），使用罗氏公司LightCycler2.0实时荧光定量PCR系统。根据克隆得到的HbcpFBPase基因cDNA全长序列设计引物HbcpFBPase-Q-F、HbcpFBPase-Q-R（表1），使用YLS8（yellow leaf-specific protein 8）[20]作为内参基因（表1），每个样品设3个重复，分析HbcpFBPase基因的表达模式。 2 结果与分析
2.1 HbcpFBPase基因的克隆与序列分析
根据蓖麻和杨树FBPase基因的核苷酸序列，在橡胶树胶乳转录组数据库中进行搜索，拼接得到一条1 200 bp的核苷酸序列。设计特异引物，以橡胶树cDNA为模板获得一条1 146 bp的核苷酸序列，再采用5′RACE技术后，最终获得包含完整读码框的cDNA全长序列。序列分析发现该片段为橡胶树FBPase基因的cDNA全长序列1 513 bp，ORF Finder软件分析结果显示，该序列包含233 bp的5′非编码区（5′UTR），71 bp的3′非编码区（3′UTR），以及长度为1 209 bp的开放阅读框（ORF）（图1）。
2.2 HbcpFBPase基因生物信息学分析
采用ProtParam tool软件预测该基因编码了一个由402个氨基酸残基组成的蛋白，蛋白分子量大小约为43.88 ku；氨基酸组成分析结果显示，该蛋白富含丝氨酸Ser（10.2%），甘氨酸Gly（9.5%）和异亮氨酸Leu（9.0%），而半胱氨酸Cys（0.7%）和色氨酸Trp（0.5%）含量较低。该蛋白理论等电点（PI）为6.64，不稳定系数为（Instability index）42.32，说明该蛋白属于不稳定蛋白。
NCBI在线软件CDD（conserved domain database）分析结果显示，该蛋白含有果糖-1，6-二磷酸酶保守结构域（FBPase，Fructose-1，6-bisphosphatase，cd00354）。Blast比对结果表明，该蛋白氨基酸序列与蓖麻（Ricinus communis，XP_002532766），毛果杨（Populus trichocarpa，XP_002323933.2），葡萄（Vitis vinifera，XP_002270826），可可（Theobroma cacao，XP_007042824.1）的叶绿体型FBPase氨基酸序列同源性分别达到了82%、81%、75%、75%（图2星号所示为活性位点）。用TargetP软件亚细胞定位预测结果显示，HbcpFBPase在叶绿体中的概率为0.961，因此综合推测该蛋白为橡胶树叶绿体型果糖-1，6-二磷酸酶，命名为HbcpFBPase。
2.3 氨基酸序列比对及进化树构建
为了进一步比较橡胶树和其他植物果糖-1，6-二磷酸酶基因在进化上的相互关系，选取蓖麻（Ricinus communis）、可可（Theobroma cacao）、毛果杨（Populus trichocarpa）、葡萄（Vitis vinifera）、黄瓜（Cucumis sativus）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、荠菜（Capsella rubella）、大豆（Glycine max）、鹰嘴豆（Cicer arietinum）、大麦（Hordeum vulgare）、水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）、高粱（Sorghum bicolor）、二穗短柄草（Brachypodiumdistachyon）、小米（Setaria italica）、苜蓿（Medicago truncatula）16个物种，搜索其FBPase蛋白氨基酸序列17条，利用Mega5.05软件，采用Neighbor-Joining，进行1 000次bootstrap统计学检验构建进化树（图3）。结果显示，17条FBPase蛋白序列被分为两类，即I类双子叶植物，其中包括本次研究的橡胶树和双子叶模式生物拟南芥；II类单子叶植物，其中包括水稻、玉米等典型的单子叶植物。HbcpFBPase与其他物种FBPase的蛋白序列同源性均较高，这也说明该基因在进化过程中相对保守。
2.4 HbcpFBPase表达分析
2.4.1 HbcpFBPase基因的组织特异表达模式分析
采用实时荧光定量PCR技术分析HbcpFBPase基因在橡胶树不同组织中的表达特性，结果显示，该基因在橡胶树雌花、雄花、种子、根、树皮、叶片及胶乳中均有表达，其中在雌花中的表达丰度最高；其次在雄花、种子、根及树皮中的表达次之；胶乳中表达丰度最低（图4）。
2.4.2 HbcpFBPase基因在叶片发育过程中的表达模式分析 在橡胶树叶片芽期到稳定期的发育过程中，HbcpFBPase基因表达丰度变化不大，在衰老期其表达量达到峰值（图5）。
2.4.3 HbcpFBPase在不同激素处理下的表达模式分析 分析7种不同激素（乙烯利ET、茉莉酸JA、脱落酸ABA、细胞分裂素CTK、赤霉素GA、水杨酸SA及植物生长素2，4-D）对该基因在胶乳中表达调控的影响，发现乙烯利ET和植物生长素2，4-D处理后该基因下调表达，且均在处理24 h表达量降至最低；脱落酸ABA和水杨酸SA处理后，其表达量有缓慢上升的趋势；赤霉素GA处理则呈现先下调，后在24 h时上调至0 h对照的表达水平；而茉莉酸JA、细胞分裂素CTK则对HbcpFBPase基因的表达无明显影响（图6）。
2.4.4 HbcpFBPase在割胶及伤害处理下的表达模式分析 分析HbcpFBPase基因在割胶及伤害处理下的表达模式，结果表明，伤害处理使胶乳中HbcpFBPase基因明显下调表达，在处理12 h表达量降到最低，这一点和乙烯利刺激后变化趋势相似，可能是因为伤害处理后会产生乙烯有关；在未开割树中，割胶明显影响胶乳中HbcpFBPase基因的表达，与第一刀的表达水平相比，第二刀中HbcpFBPase基因略有上调，但此后直到第6刀明显下调表达，且在第6刀后一直保持低水平表达（图7）。
在不同死皮程度橡胶树的胶乳中，HbcpFBPase基因的表达模式与死皮程度没有明显的关联。 3 讨论与结论
叶绿体型果糖-1，6-二磷酸酶是植物Calvin循环的关键酶之一，其参与CO2接受体再生的反应，催化果糖-1，6-二磷酸生成果糖-6-磷酸，并且也参与在叶绿体中淀粉的合成[25]。在高等植物中，原初同化产物一部分以三碳糖的形式被运输到细胞质中用于蔗糖的合成及其它代谢，另一部分则留在叶绿体中转化为淀粉，cpFBPase催化产物果糖-6-磷酸是代谢物从卡尔文循环进入淀粉合成过程中的分支点。因此，cpFBPase也许在调节蔗糖和淀粉的碳分配中起着重要作用[26-30]。
在巴西橡胶树中，蔗糖是合成天然橡胶的主要原料，源组织叶片光合作用合成蔗糖的能力，以及乳管中蔗糖的代谢水平均影响橡胶树的产胶能力，因此蔗糖的合成和供给与橡胶树的产量密切相关[31-33]。本研究首次从橡胶树中分离并获得一个叶绿体型果糖-1，6-二磷酸酶基因，实时荧光定量PCR分析表明，HbcpFBPase基因在分析的7种组织中均有表达，其中在雌花中表达量最高，雄花及种子次之，此前也有研究者以油茶“湘林 1 号”的近成熟种子为材料，在库组织中克隆获得油茶cpFBPase基因[15]；且该基因在库组织胶乳中的表达受割胶和伤害影响，推测其不仅仅只作用于光合作用暗反应阶段，可能也与cyFBPase一样通过糖代谢的方式参与橡胶树胶乳再生过程[34]。在所进行的7种激素（乙烯利ET、茉莉酸JA、脱落酸ABA、细胞分裂素CTK、赤霉素GA、水杨酸SA及植物生长素2，4-D）处理中，ET能明显下调HbcpFBPase的表达，在处理12 h后的mRNA表达量降低到对照的一半左右（图5），推断该基因启动子中可能含有受乙烯利诱导的顺式调控元件，但其受乙烯利调控的分子机制和生理学意义还需进一步验证[35]。在ABA、GA、SA及2，4-D处理后，该基因的表达量略有变化，但并不明显；而在JA和CTK处理下，表达量几乎不受影响。除此之外，本研究分析了该基因在不同发育时期叶片中的表达模式，结果表明HbcpFBPase基因与叶片发育进程关系不大，推测其可能直接影响光合作用效率及碳水化合物的积累[17]。
本研究结果初步表明，橡胶树cpFBPase在库组织胶乳糖代谢调控中发挥重要作用，在后续研究中，将进一步研究其在胶乳糖代谢中的调控能力，从而为揭示橡胶树产胶机理提供一定的理论基础。同时，本实验尚未涉及到光合作相关实验，后续研究将关注该基因在光合作用碳固定中的调控能力。
参考文献
[1] 何 康，黄宗道. 热带北缘橡胶树栽培[M].广东科技出版社，1987： 1.
[2] Allen P W， Jones K P. A historical perspective of the rubber industry. In “Natural rubber scienceand technology” （Roberts A.D.）[M]. Oxford University Press， 1988.
[3] Zimmermann G， Kelly G J， Latzko E. Efficient purification and molecular properties of spinach chloroplast fructose-1，6-bisphosphatase[J]. Eur J Biochem， 1976， 70： 361-367.
[4] Zimmermann G， Kelly G J， Latzko E. Purification and properties of spinach leaf cytoplasmic fructose-1，6-bisphosphatase[J]. J Biol Chem 1978， 253： 5 952-5 955.
[5] Eli Khayat， Chee Harn， Jaleh Daie. Purif ication and light～dependent molecular modulation of the cytosolic Fructose～l，6～Bisphosphatase in sugarbeet leaves[J]. Plant Physiol， 1993， 101： 57-64.
[6] Si L Z， Cao S Y， Chu C C. Isolation of a 1 195 bp 5 '～rice cytosolic fructose～1， 6～bisphosphatase and analysis of its expression in transgenic rice[J]. Acta Botanica Sinica， 2003， 45（3）： 359-364.
[7] Daie J. Cytosolic fructose-1，6-bisphosphatase： a key enzyme in the sucrose biosynthetic pathway[J]. Photosynthesis Research， 1993， 38： 5-14.
[8] Chueca A. Chloroplast fructose-1，6-bisphosphatase： structure and function[J]. Photosynthesis Research， 2002， 74： 235-249.
[9] Schnarrenberger C， Martin W. The Calvin cycle： A historical perspective[J].. Photosynthetica， 1997， 33： 331-345.
[10] 叶冰莹， 黄金存， 邵武华. 甘蔗果糖-1，6-二磷酸酯酶的 cDNA片段克隆及序列分析[J]. 中国糖科， 2009， 3： 1-4. [11] Hall D O， Rao K K.Photosynthesis[M]. New York： Cambridge Univ Press， 1995： 97-126.
[12] Jing Y X， Kuang T Y， Li D B， et al. Molecular Biology of Plants[M]. Beijing： Science Press， 1995.
[13] Serrato， A J. Changing sugar partitioning in FBPase～manipulated plants[J]. J Exp Bot， 2009. 60（10）： 2 923-2 931.
[14] Marcus F， Gontero B， Harrsch P B， et al. Amino acid sequence homology among fructose-1，6-bisphosphatases[J]. Biochem Biophys Res Commun， 1986， 135（2）： 374-381.
[15] 谭晓风， 曹彦妮， 郭静怡. 油茶FBPase基因的全长cDNA克隆及序列分析[J]. 江西农业大学学报， 2011， 33（3）： 514-520.
[16] Tang G L， Wang Y F， Chen H B. Overexpression in Escherichia coli and Characterization of the Chlaoroplast Fructose～1， 6～bisphosphatase from Wheat[J]. Protein Expression and Purification， 2000， 19： 411-418.
[17] Miyagawa Y， Tamoi M， Shigeoka S. Overexpression of a cyanobacterial fructose-1，6-/sedoheptulose～1，7～bisphosphatase in tobacco enhances photosynthesis and growth[J]. Nat Biotechnol， 2001， 19（10）： 965-969.
[18] Thorbjornsen T， Asp T， Jorgensen K， et al. Starch biosynthesis from triose～phosphate in transgenic potato tubers expressing plastidic fructose-1，6-bisphosphatase[J]. Planta， 2002， 214（4）： 616-624.
[19] Xiao H D， Chen C S， Xu Y. Cloning and expression analysis of the chloroplast fructose-1，6-bisphosphatase gene from Pyropia haitanensis Acta Oceanol[J]. Sin.， 2014， 33（4）： 92-100.
[20] Tang C R. A convenient and efficient protocol for isolating high～quality RNA from latex of Hevea brasiliensis（para rubber tree）[J]. J. Biochem. Biophys Methods， 2007. 70（5）： 749-754.
[21] Kongsawadworakul P， Peret B， Morin D， et al. and Chrestin H. Ethylene～cyanide metabolism[C]//ACC～oxidase and cyanoalanine synthase cross～roads in Hevea brasiliensis： Effects induced by yield stimulation with EthrelR and other stresses. Proceedings of IRRDB Conference， Kunming， China，2004： 331-345.
[22] Tang C R， Huang D B， Yang J H. The sucrose transporter HbSUT3 plays an active role in sucrose loading to laticifer and rubber productivity in exploited trees of Hevea brasiliensis （para rubber tree）[J]. Plant， Cell and Environment 2010， 33： 1 708-1 720.
[23] Kiefer E， Heller W， Ernst D. A simple and efficient protocol for isolation of functional RNA from plant tissues rich in secondary metabolites[J]. Plant Mol Biol Rep， 2000， 18： 33-39.
[24] Li H P， Qin Y X， Xiao X H， et al. Screening of valid internal control genes for gene expression studies in Hevea brasiliensis by real time PCR and expression validation of a sucrose transporter gene HbSUT3[J]. Plant Sci， 2011， 182（2）： 132-139. [25] 司丽珍， 储成才. 植物蔗糖合成的分子机制[J]. 中国生物工程杂志， 2003， 23（1）： 11-16， 29.
[26] 马为民， 施定基， 王全喜. 用基因工程提高光合同化CO2效率的一个关键酶--果糖-1，6-二磷酸酶[J]. 生物化学与生物物理进展， 2003（3）： 446.
[27] Woodrow I E， Berry J A. Enzymic regulation of photosynthetic CO2 fixation in C3 plants[J]. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 1988， 39： 533-594.
[28] Geiger D R， Servaites J C. Diurnalre gelation of photosynthetic carbon metabolism in C3 plants[J]. Annu RevPlant Physiol Plant Mol Biol， 1994， 5： 235-256.
[29] Kobmann J， Sonnewald U， Willmitzer L. Reduction of the chloroplastic fructose-1，6-bisphosphatase in transgenic potato plants impairs photosynthesis and plant growth[J]. Plant J， 1994， 6： 637-650.
[30] Raines CA. The Calvin cycle revisited[J]. Photosynth Res，2003， 75： 1-10.
[31] 阳江华， 黄德宝， 刘术金. 巴西橡胶树6个蔗糖转运蛋白基因的克隆与序列分析[J]. 热带作物学报， 2007， 28（4）： 32-38.
[32] 肖小虎， 戚继艳， 方永军. 巴西橡胶树中碱性转化酶HbNINa基因的克隆和表达模式分析[J]. 热带作物学报，2013， 34（7）： 1 264-1 269.
[33] 唐朝荣， 肖小虎， 方永军. 巴西橡胶树磷酸蔗糖磷酸化酶基因的克隆和表达模式分析[J]. 热带作物学报， 2013， 34（5）： 855-859.
[34] 龙翔宇， 曹 冰， 梁启福. 橡胶树果糖-1，6-双磷酸酯酶基因的克隆及表达特性分析[J]. 植物生理学报， 2013， 49（11）： 1 212-1 220.
[35] 黄亚成， 秦云霞， 刘林娅. 橡胶树HbRAN1基因的克隆和表达分析[J]. 热带作物学报， 2013， 34（7）： 1 257-1 263.