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摘要：目的 探讨糖网明目颗粒不同提取部位对缺氧诱导的人脐静脉内皮细胞EA.hy926中相关基因表达的作用机制。方法 以COCl2干预细胞复制缺氧模型，人脐静脉内皮细胞EA.hy926分为空白组、缺氧模型组、全方组、部位1组（苷类和黄酮类）、部位2组（有机酸和多糖类）和部位3组（生物碱类）。采用半定量RT-PCR检测糖网明目颗粒不同提取部位对缺氧诱导细胞中血管内皮细胞生长因子（VEGF）及其受体（VEGFR）1、2和细胞间黏附分子（ICAM）-1、白细胞介素（IL）-1α基因表达的变化。结果 缺氧导致EA.hy926细胞VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2、ICAM-1、IL-1α基因表达上调（P<0.05），VEGFR-1/VEGFR-2比值降低。糖网明目颗粒及其不同提取部位干预细胞后，VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2、ICAM-1、IL-1α基因表达降低（P<0.05）， VEGFR-1/VEGFR-2比值升高。结论 糖网明目颗粒中苷类和黄酮类、生物碱类及有机酸和多糖类调控缺氧诱导的血管内皮细胞基因表达的作用强度依次减弱。
关键词：糖网明目颗粒；糖尿病视网膜病变；人脐静脉内皮细胞；血管内皮细胞生长因子/受体；细胞间黏附分子-1；白细胞介素-1α
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.10.014
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）10-0045-05
Abstract：Objective To observe the effect of different extracts of Tangwang Mingmu Granule on hypoxia induced gene expressions in vascular endothelial cells. Methods COCl2 intervention cells were used to copy hypoxia models. Human umbilical vein endothelial cells EA. Hy926 were divided into blank group， hypoxia model group， Tangwang Mingmu Granule group， extract 1 （glycosides and flavonoids） group， extract 2 （orgain acids and polysaccharides） group and extract 3 （alkaloids） group. The changes in gene expressions of VEGF， VEGFR-1， VEGFR-2， ICAM-1 and IL-1α mRNA were detected by semi-quantitative RT-PCR. Results The gene expression levels of VEGF， VEGFR-1， VEGFR-2， ICAM-1 and IL-1α were significantly up-regulated under the hypoxic condition （P<0.05）， and the ratio of VEGFR-1/VEGFR-2 was significantly reduced. However， Tangwang Mingmu Granule significantly reversed the expressions of these genes. Conclusion The function intensity of gene expressions weakens in the following sequence：glycosides and flavonoids>alkaloids>organic acids and polysaccharides in Tangwang Mingmu Granule.
Key words：Tangwang Mingmu Granule；diabetic retinopathy；human umbilical vein endothelial cells；vascular endothelial cell growth factor （receptor）；ICAM-1；IL-1α
糖网明目颗粒是治疗糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）的中药6类新药。本课题前期研究结果表明，糖网明目颗粒能够明显改善糖尿病大鼠视网膜微血管病理学状态、降低血管生成相关因子的蛋白和基因水平[1-2]。本实验采用血管内皮细胞缺氧模型，进一步探讨糖网明目颗粒不同提取部位对缺氧诱导的人脐静脉内皮细胞EA.hy926中相关基因表达的作用机制。
1 实验材料
1.1 细胞
人脐静脉内皮细胞EA.hy 926购于中国科学院上海细胞库。
1.2 药物
糖网明目颗粒处方由女贞子、乌梅、黄连、密蒙花、肉桂、黄芪、益母草组成，所用饮片购于安国市萌露中药饮片有限公司，经北京汉典中医研究院刘晔鉴定均符合2010年版《中华人民共和国药典》要求。糖网明目颗粒提取物和不同提取部位由北京汉典中医研究院有限公司提供，采取醇提、水提相结合的方法，将各药材中的主要药效物质充分提取，最后经喷雾干燥制成提取物。其中，部位1为黄芪、女贞子、密蒙花提取物，主要含苷类和黄酮类物质；部位2为乌梅、肉桂提取物，主要含有机酸和多糖类物质；部位3为益母草、黄连提取物，主要含生物碱类物质。
1.3 试剂
胎牛血清（FBS），Hyclone，SH30070.03；0.25%胰蛋白酶，Hyclone，SH30042.01B；高糖DMEM培养液， Hyclone，SH30022.01B；DMSO，Amresco，0231；青链霉素混合液，Solarbio，P1400-100；COCl2·6H2O，Sigma， C8661-25G；25 cm2细胞培养瓶、移液管（Corning）；RT-PCR试剂盒，TaKaRa，RR019A。 1.4 仪器
YT-CJ-2ND型超净工作台（北京亚泰科隆仪器技术有限公司），MCO-175CO2培养箱（SANYO），BDS200倒置相差显微镜（奥特光学），DPL-ⅡA型喷雾制粒仪（重庆精工制药机械有限责任公司），LXJ-ⅡA型离心机（上海安亭科学仪器厂），BIOMATE型紫外可见分光光度计（Thermo），GE4852型PCR仪（杭州柏恒科技有限公司），JY600电泳仪（北京君意东方电子设备有限公司），ChampGel 5000型全自动凝胶成像系统（北京赛智创业科技有限公司）。
2 实验方法
2.1 细胞培养及药物干预
糖网明目颗粒及各提取部位培养液制备：精密称定糖网明目颗粒提取物0.444 4 g至50 mL离心管中，于超净台内加无血清高糖DMEM培养液至40 mL，涡旋震荡使药物溶解，静置30 min后混匀，5000 r/min离心20 min，吸取上清液，用0.45 μm滤器无菌条件下过滤后，加入4.44 mL FBS，混匀，制成贮存液，封口，于4 ℃冰箱内保存备用。贮存液糖网明目颗粒提取物浓度为10 mg/mL，含10%FBS。临用时将贮存液梯度稀释至所需浓度2.5 mg/mL。其中，各提取部位按照其所占处方比例、提取率折算，相当于全方剂量，工作液配制方法同糖网明目颗粒全方。
COCl2培养液制备：精密称定COCl2·6H2O 0.023 7 g，加10 mL超纯水，溶解，过滤，4 ℃避光保存备用。临用时用相应液体稀释至50 μmol/L，混匀，进行细胞干预。
EA.hy926细胞第3代经胰酶消化，用普通培养液（含10%FBS、1×105 U/L青霉素、100 mg/L硫酸链霉素的高糖DMEM培养液）稀释成2.5×104/mL细胞悬液，将3×106个细胞接种于25 cm2培养瓶中，普通培养液培养24 h后，空白组换用普通培养液，缺氧模型组换用COCl2培养液体外模拟EA.hy926细胞缺氧模型，全方组换用COCl2+糖网明目颗粒培养液，部位1组换用COCl2+部位1培养液，部位2组换用COCl2+部位2培养液，部位3组换用COCl2+部位3培养液，继续培养24 h后提取总RNA。
2.2 RT-PCR检测
药物干预24 h后，按照试剂盒说明书提取总RNA，紫外分光光度法测定其浓度，检测其质量。按照试剂盒说明书进行反转录反应，获得cDNA。PCR引物由北京赛百盛公司合成，详细信息见表1。反应条件：94 ℃，2 min；94 ℃，30 s；58 ℃，30 s；72 ℃，1 min；72 ℃，5 min；35个循环后转为4 ℃保存。
1.5%琼脂糖凝胶电泳检测上述反应产物，LaneID凝胶图像分析软件对PCR产物进行半定量分析，基因表达水平以β-actin为参比。
3 统计学方法
采用SPSS16.0统计软件进行分析，实验数据以—x±s表示，多组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 糖网明目颗粒不同提取部位对缺氧诱导的血管内皮细胞中血管内皮细胞生长因子基因表达的影响
血管内皮细胞缺氧24 h后，VEGF基因表达水平上调（P<0.05）；经药物干预24 h后，糖网明目颗粒全方组、部位1组和部位3组VEGF基因表达水平下调（P<0.05），并且组间比较无明显差异，而部位2组上调（P<0.05）。提示在抑制因缺氧导致的血管内皮细胞VEGF基因表达上调方面，糖网明目颗粒中部位1的苷类和黄酮类与部位3的生物碱类发挥了主要作用，而部位2则未发挥与糖网明目颗粒全方相同的抑制作用。结果见图1。
4.2 糖网明目颗粒不同提取部位对缺氧诱导的血管内皮细胞中血管内皮细胞生长因子受体1基因表达的影响
血管内皮细胞缺氧24 h后，VEGFR-1基因表达水平上调（P<0.05）；经药物干预24 h后，糖网明目颗粒全方组及各部位组VEGFR-1基因表达水平均下调（P<0.05），作用强度依次为全方组>部位1组>部位3组>部位2组。结果见图2。
4.3 糖网明目颗粒不同提取部位对缺氧诱导的血管内皮细胞中血管内皮细胞生长因子受体2基因表达的影响
血管内皮细胞缺氧24 h后，VEGFR-2基因表达水平上调（P<0.05）；经药物干预24 h后，糖网明目颗粒全方组及各部位组VEGFR-2基因表达水平均下调（P<0.05），作用强度依次为全方组>部位1组>部位3组>部位2组。结果见图3。
4.4 糖网明目颗粒不同提取部位对缺氧诱导的血管内皮细胞血管中内皮细胞生长因子受体1/2比值的影响
血管内皮细胞缺氧24 h后，VEGFR-1/VEGFR-2比值降低；经药物干预24 h后，糖网明目颗粒全方组及各部位组VEGFR-1/VEGFR-2比值均升高，作用强度依次为部位1组>全方组>部位3组>部位2组。结果见图4。
4.5 糖网明目颗粒不同提取部位对缺氧诱导的血管内皮细胞中细胞间黏附分子-1基因表达的影响
血管内皮细胞缺氧24 h后，ICAM-1基因表达水平显著上调（P<0.05）；经药物干预24 h后，糖网明目颗粒全方组及各部位组ICAM-1基因水平均显著下调（P<0.05），作用强度依次为全方组>部位1组>部位3组>部位2组。结果见图5。
4.6 糖网明目颗粒不同提取部位对缺氧诱导的血管内皮细胞中白细胞介素-1α基因表达的影响
血管内皮细胞缺氧24 h后，IL-1α基因表达水平显著上调（P<0.05）；经药物干预24 h后，糖网明目颗粒全方组及各部位组IL-1α基因表达水平显著下调（P<0.05），作用强度依次为全方组>部位1组>部位3组>部位2组。结果见图6。 5 讨论
在DR新生血管形成过程中，受缺氧条件诱导，正常血管的结构都产生相应改变，其中内皮细胞增殖是其重要步骤，周细胞凋亡、基底膜及细胞外基质的改变都促进了内皮细胞的增殖[3-4]。本课题前期研究显示，糖网明目颗粒能够显著抑制人脐静脉内皮细胞EA.hy926的增殖，可能因此影响DR新生血管形成过程，进而改善视网膜微血管病变状况。本实验采用EA.hy926细胞体外模拟DR病变过程中的缺氧状态，进一步观察糖网明目颗粒不同提取部位对该病发病过程中相关因子的影响，以明确糖网明目颗粒发挥药效的物质基础。
相关研究表明，适度的缺氧可使血管内皮细胞VEGF表达增加[5-6]。VEGF是目前所知最强的内皮细胞选择性促有丝分裂肽和血管生成因子，与受体（VEGFR-1、VEGFR-2）结合后，可刺激血管内皮细胞增殖及移行、细胞外基质变性，诱导新生血管的形成。已经公认，缺氧状态下VEGF与VEGFR-2结合后，能够促进内皮细胞的生长、增殖，进而促进血管生成。但VEGFR-1的作用目前尚不明确。Avouac等[7]研究表明，在缺氧条件下VEGFR-1膜蛋白和mRNA表达增加，其机制可能是VEGFR-1可诱导VEGF与VEGFR-2的结合[8]。Nilsson等[9]研究在缺氧条件下HUVEC中的VEGFR-1蛋白表达下降的机制可能是：VEGFR-1作为VEGFR-2的一个负性调节因子，拮抗VEGFR-2的促血管内皮细胞增殖的作用[10]。VEGF-VEGFR信号通路被激活后，可促进视网膜血管ICAM-1、IL-1α等炎症因子的基因表达和蛋白质分泌，使白细胞黏集，释放多种活性物质破坏血管壁，激活血小板，引起血流缓慢和血栓形成，导致视网膜局部缺血加重和新生血管形成[11-12]。本研究结果显示，在COCl2所致内皮细胞缺氧模型中，VEGF、VEGFR-1和VEGFR-2基因表达均上调，但VEGFR-1/VEGFR-2比值却低于空白组。可以推断：在正常状态下，VEGFR-1和VEGFR-2与VEGF的结合是竞争性拮抗，以维持内皮细胞正常生命活动；缺氧后，VEGFR-1和VEGFR-2的相对平衡被打破， VEGFR-1/VEGFR-2比值升高，VEGFR-1对VEGFR-2的抑制减弱，VEGFR-2反射性升高，进而诱导内皮细胞失控性增殖，ICAM-1和IL-1α炎症因子基因表达上调。
本实验结果显示，糖网明目颗粒不同提取部位能够不同程度地抑制缺氧诱导的血管内皮细胞中VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2、ICAM-1、IL-1α基因的表达，升高VEGFR-1/VEGFR-2比值，其中以部位1作用最明显，部位3次之，部位2稍弱，这与DR发病机制和糖网明目颗粒组方规律一致。DR病因是气阴两虚，方中黄芪补气，女贞子补肝肾明目，密蒙花清热养肝、明目退翳，这3味药在方中比例较大，补气益肝肾，从根本上调理DR病程中之气阴两虚状态。另外，气虚则推动无力，致气血瘀滞；阴虚生热，煎熬津液，精亏液少，血黏不畅。方中益母草活血调经、利尿消肿，黄连清热燥湿、泻火解毒，而此2味药所含有的生物碱类物质如黄连素又有一定的抗炎作用，两者共用，能够调理DR病程中的阴虚夹热之瘀滞状态，改善DR病程中的炎症反应。乌梅收敛生津止血，与黄芪配伍补气养血；肉桂补火助阳活血，与黄连配伍，水火既济，安神宁血。二者若单独使用，从本实验结果看药效不明显。
综上，在调控因缺氧导致的血管内皮细胞VEGFR-1/VEGFR-2比值降低和VEGF、ICAM-1、IL-1α基因表达上调方面，糖网明目颗粒各部位的作用强度为：部位1的苷类和黄酮类>部位3的生物碱类>部位2的有机酸类和多糖类。本结果为分析糖网明目颗粒的药效物质基础提供了实验依据。
参考文献：
[1] 蒿长英，陈明霞，郭平，等.糖网明目颗粒对糖尿病大鼠视网膜病变的防治作用及机制研究[J].中国中医药信息杂志，2015，22（1）：62-66.
[2] 蒿长英，陈明霞，郭平，等.糖网明目颗粒提取物对缺氧/高糖状态下血管内皮细胞肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1α表达的影响[J].中国中医药信息杂志，2015，22（8）：50-54.
[3] Higashimoto Y， Matsui T， Nishino Y， et al. Blockade by phosphorothioateaptamers of advanced glycation end products- induced damage in cultured pericytes and endothelial cells[J]. Microvasc Res，2013，90：64-70.
[4] Yang Y， Yang K， Li Y， et al. Decursin inhibited proliferation and angiogenesis of endothelial cells to suppress diabetic retinopathy via VEGFR2[J]. Mol Cell Endocrinol，2013，378（1/2）：46-52.
[5] Nomura M， Yamagishi S， Harada S， et al. Possible participation of autocrine and paracrine vascular endothelial growth factors in hypoxia-induced proliferation of endothelial cells and pericytes[J]. J Biol Chem，1995，270（47）：28316-28324.
[6] Shweiki D， Itin A， Soffer D， et al. Vascular endothelial growth factor induced by hypoxia may mediate hypoxia-initiated angiogenesis[J]. Nature，1992，359（6398）：843-845.
[7] Avouac J， Wipff J， Goldman O， et al. Angiogenesis in systemic sclerosis：impaired expression of vascular endothelial growth factor receptor 1 inendothelial progenitor-derived cells under hypoxic conditions[J]. Arthritis Rheum，2008，58（11）：3550-3561.
[8] 冯蓓.当归补血汤双向调节不同状态血管内皮细胞增殖及其机制的实验研究[D].成都：成都中医药大学，2012.
[9] Nilsson I， Shibuya M， Wennstrom S. Differential activation of vascular genes by hypoxia in primary endothelial cells[J]. Exp Cell Res，2004，299（2）：476-485.
[10] 吴正正.密蒙花方防治糖尿病视网膜病变VEGF信号转导机制研究[D].北京：中国中医科学院，2005.
[11] 曹建峰，庞东渤，叶文婕.HIF-1α及VEGF在增生性糖尿病视网膜病变视网膜前膜中的表达[J].国际眼科杂志，2013，13（5）：857-860.
[12] 张志清，龙崇德，姚晓明，等.初发胬肉与复发胬肉中IL-1α和VEGFR-1的表达相关性研究[J].眼外伤职业眼病杂志，2010，32（11）：801-803.
（收稿日期：2015-03-24；编辑：华强）
关键词：糖网明目颗粒；糖尿病视网膜病变；人脐静脉内皮细胞；血管内皮细胞生长因子/受体；细胞间黏附分子-1；白细胞介素-1α
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.10.014
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）10-0045-05
Abstract：Objective To observe the effect of different extracts of Tangwang Mingmu Granule on hypoxia induced gene expressions in vascular endothelial cells. Methods COCl2 intervention cells were used to copy hypoxia models. Human umbilical vein endothelial cells EA. Hy926 were divided into blank group， hypoxia model group， Tangwang Mingmu Granule group， extract 1 （glycosides and flavonoids） group， extract 2 （orgain acids and polysaccharides） group and extract 3 （alkaloids） group. The changes in gene expressions of VEGF， VEGFR-1， VEGFR-2， ICAM-1 and IL-1α mRNA were detected by semi-quantitative RT-PCR. Results The gene expression levels of VEGF， VEGFR-1， VEGFR-2， ICAM-1 and IL-1α were significantly up-regulated under the hypoxic condition （P<0.05）， and the ratio of VEGFR-1/VEGFR-2 was significantly reduced. However， Tangwang Mingmu Granule significantly reversed the expressions of these genes. Conclusion The function intensity of gene expressions weakens in the following sequence：glycosides and flavonoids>alkaloids>organic acids and polysaccharides in Tangwang Mingmu Granule.
Key words：Tangwang Mingmu Granule；diabetic retinopathy；human umbilical vein endothelial cells；vascular endothelial cell growth factor （receptor）；ICAM-1；IL-1α
糖网明目颗粒是治疗糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）的中药6类新药。本课题前期研究结果表明，糖网明目颗粒能够明显改善糖尿病大鼠视网膜微血管病理学状态、降低血管生成相关因子的蛋白和基因水平[1-2]。本实验采用血管内皮细胞缺氧模型，进一步探讨糖网明目颗粒不同提取部位对缺氧诱导的人脐静脉内皮细胞EA.hy926中相关基因表达的作用机制。
1 实验材料
1.1 细胞
人脐静脉内皮细胞EA.hy 926购于中国科学院上海细胞库。
1.2 药物
糖网明目颗粒处方由女贞子、乌梅、黄连、密蒙花、肉桂、黄芪、益母草组成，所用饮片购于安国市萌露中药饮片有限公司，经北京汉典中医研究院刘晔鉴定均符合2010年版《中华人民共和国药典》要求。糖网明目颗粒提取物和不同提取部位由北京汉典中医研究院有限公司提供，采取醇提、水提相结合的方法，将各药材中的主要药效物质充分提取，最后经喷雾干燥制成提取物。其中，部位1为黄芪、女贞子、密蒙花提取物，主要含苷类和黄酮类物质；部位2为乌梅、肉桂提取物，主要含有机酸和多糖类物质；部位3为益母草、黄连提取物，主要含生物碱类物质。
1.3 试剂
胎牛血清（FBS），Hyclone，SH30070.03；0.25%胰蛋白酶，Hyclone，SH30042.01B；高糖DMEM培养液， Hyclone，SH30022.01B；DMSO，Amresco，0231；青链霉素混合液，Solarbio，P1400-100；COCl2·6H2O，Sigma， C8661-25G；25 cm2细胞培养瓶、移液管（Corning）；RT-PCR试剂盒，TaKaRa，RR019A。 1.4 仪器
YT-CJ-2ND型超净工作台（北京亚泰科隆仪器技术有限公司），MCO-175CO2培养箱（SANYO），BDS200倒置相差显微镜（奥特光学），DPL-ⅡA型喷雾制粒仪（重庆精工制药机械有限责任公司），LXJ-ⅡA型离心机（上海安亭科学仪器厂），BIOMATE型紫外可见分光光度计（Thermo），GE4852型PCR仪（杭州柏恒科技有限公司），JY600电泳仪（北京君意东方电子设备有限公司），ChampGel 5000型全自动凝胶成像系统（北京赛智创业科技有限公司）。
2 实验方法
2.1 细胞培养及药物干预
糖网明目颗粒及各提取部位培养液制备：精密称定糖网明目颗粒提取物0.444 4 g至50 mL离心管中，于超净台内加无血清高糖DMEM培养液至40 mL，涡旋震荡使药物溶解，静置30 min后混匀，5000 r/min离心20 min，吸取上清液，用0.45 μm滤器无菌条件下过滤后，加入4.44 mL FBS，混匀，制成贮存液，封口，于4 ℃冰箱内保存备用。贮存液糖网明目颗粒提取物浓度为10 mg/mL，含10%FBS。临用时将贮存液梯度稀释至所需浓度2.5 mg/mL。其中，各提取部位按照其所占处方比例、提取率折算，相当于全方剂量，工作液配制方法同糖网明目颗粒全方。
COCl2培养液制备：精密称定COCl2·6H2O 0.023 7 g，加10 mL超纯水，溶解，过滤，4 ℃避光保存备用。临用时用相应液体稀释至50 μmol/L，混匀，进行细胞干预。
EA.hy926细胞第3代经胰酶消化，用普通培养液（含10%FBS、1×105 U/L青霉素、100 mg/L硫酸链霉素的高糖DMEM培养液）稀释成2.5×104/mL细胞悬液，将3×106个细胞接种于25 cm2培养瓶中，普通培养液培养24 h后，空白组换用普通培养液，缺氧模型组换用COCl2培养液体外模拟EA.hy926细胞缺氧模型，全方组换用COCl2+糖网明目颗粒培养液，部位1组换用COCl2+部位1培养液，部位2组换用COCl2+部位2培养液，部位3组换用COCl2+部位3培养液，继续培养24 h后提取总RNA。
2.2 RT-PCR检测
药物干预24 h后，按照试剂盒说明书提取总RNA，紫外分光光度法测定其浓度，检测其质量。按照试剂盒说明书进行反转录反应，获得cDNA。PCR引物由北京赛百盛公司合成，详细信息见表1。反应条件：94 ℃，2 min；94 ℃，30 s；58 ℃，30 s；72 ℃，1 min；72 ℃，5 min；35个循环后转为4 ℃保存。
1.5%琼脂糖凝胶电泳检测上述反应产物，LaneID凝胶图像分析软件对PCR产物进行半定量分析，基因表达水平以β-actin为参比。
3 统计学方法
采用SPSS16.0统计软件进行分析，实验数据以—x±s表示，多组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 糖网明目颗粒不同提取部位对缺氧诱导的血管内皮细胞中血管内皮细胞生长因子基因表达的影响
血管内皮细胞缺氧24 h后，VEGF基因表达水平上调（P<0.05）；经药物干预24 h后，糖网明目颗粒全方组、部位1组和部位3组VEGF基因表达水平下调（P<0.05），并且组间比较无明显差异，而部位2组上调（P<0.05）。提示在抑制因缺氧导致的血管内皮细胞VEGF基因表达上调方面，糖网明目颗粒中部位1的苷类和黄酮类与部位3的生物碱类发挥了主要作用，而部位2则未发挥与糖网明目颗粒全方相同的抑制作用。结果见图1。
4.2 糖网明目颗粒不同提取部位对缺氧诱导的血管内皮细胞中血管内皮细胞生长因子受体1基因表达的影响
血管内皮细胞缺氧24 h后，VEGFR-1基因表达水平上调（P<0.05）；经药物干预24 h后，糖网明目颗粒全方组及各部位组VEGFR-1基因表达水平均下调（P<0.05），作用强度依次为全方组>部位1组>部位3组>部位2组。结果见图2。
4.3 糖网明目颗粒不同提取部位对缺氧诱导的血管内皮细胞中血管内皮细胞生长因子受体2基因表达的影响
血管内皮细胞缺氧24 h后，VEGFR-2基因表达水平上调（P<0.05）；经药物干预24 h后，糖网明目颗粒全方组及各部位组VEGFR-2基因表达水平均下调（P<0.05），作用强度依次为全方组>部位1组>部位3组>部位2组。结果见图3。
4.4 糖网明目颗粒不同提取部位对缺氧诱导的血管内皮细胞血管中内皮细胞生长因子受体1/2比值的影响
血管内皮细胞缺氧24 h后，VEGFR-1/VEGFR-2比值降低；经药物干预24 h后，糖网明目颗粒全方组及各部位组VEGFR-1/VEGFR-2比值均升高，作用强度依次为部位1组>全方组>部位3组>部位2组。结果见图4。
4.5 糖网明目颗粒不同提取部位对缺氧诱导的血管内皮细胞中细胞间黏附分子-1基因表达的影响
血管内皮细胞缺氧24 h后，ICAM-1基因表达水平显著上调（P<0.05）；经药物干预24 h后，糖网明目颗粒全方组及各部位组ICAM-1基因水平均显著下调（P<0.05），作用强度依次为全方组>部位1组>部位3组>部位2组。结果见图5。
4.6 糖网明目颗粒不同提取部位对缺氧诱导的血管内皮细胞中白细胞介素-1α基因表达的影响
血管内皮细胞缺氧24 h后，IL-1α基因表达水平显著上调（P<0.05）；经药物干预24 h后，糖网明目颗粒全方组及各部位组IL-1α基因表达水平显著下调（P<0.05），作用强度依次为全方组>部位1组>部位3组>部位2组。结果见图6。 5 讨论
在DR新生血管形成过程中，受缺氧条件诱导，正常血管的结构都产生相应改变，其中内皮细胞增殖是其重要步骤，周细胞凋亡、基底膜及细胞外基质的改变都促进了内皮细胞的增殖[3-4]。本课题前期研究显示，糖网明目颗粒能够显著抑制人脐静脉内皮细胞EA.hy926的增殖，可能因此影响DR新生血管形成过程，进而改善视网膜微血管病变状况。本实验采用EA.hy926细胞体外模拟DR病变过程中的缺氧状态，进一步观察糖网明目颗粒不同提取部位对该病发病过程中相关因子的影响，以明确糖网明目颗粒发挥药效的物质基础。
相关研究表明，适度的缺氧可使血管内皮细胞VEGF表达增加[5-6]。VEGF是目前所知最强的内皮细胞选择性促有丝分裂肽和血管生成因子，与受体（VEGFR-1、VEGFR-2）结合后，可刺激血管内皮细胞增殖及移行、细胞外基质变性，诱导新生血管的形成。已经公认，缺氧状态下VEGF与VEGFR-2结合后，能够促进内皮细胞的生长、增殖，进而促进血管生成。但VEGFR-1的作用目前尚不明确。Avouac等[7]研究表明，在缺氧条件下VEGFR-1膜蛋白和mRNA表达增加，其机制可能是VEGFR-1可诱导VEGF与VEGFR-2的结合[8]。Nilsson等[9]研究在缺氧条件下HUVEC中的VEGFR-1蛋白表达下降的机制可能是：VEGFR-1作为VEGFR-2的一个负性调节因子，拮抗VEGFR-2的促血管内皮细胞增殖的作用[10]。VEGF-VEGFR信号通路被激活后，可促进视网膜血管ICAM-1、IL-1α等炎症因子的基因表达和蛋白质分泌，使白细胞黏集，释放多种活性物质破坏血管壁，激活血小板，引起血流缓慢和血栓形成，导致视网膜局部缺血加重和新生血管形成[11-12]。本研究结果显示，在COCl2所致内皮细胞缺氧模型中，VEGF、VEGFR-1和VEGFR-2基因表达均上调，但VEGFR-1/VEGFR-2比值却低于空白组。可以推断：在正常状态下，VEGFR-1和VEGFR-2与VEGF的结合是竞争性拮抗，以维持内皮细胞正常生命活动；缺氧后，VEGFR-1和VEGFR-2的相对平衡被打破， VEGFR-1/VEGFR-2比值升高，VEGFR-1对VEGFR-2的抑制减弱，VEGFR-2反射性升高，进而诱导内皮细胞失控性增殖，ICAM-1和IL-1α炎症因子基因表达上调。
本实验结果显示，糖网明目颗粒不同提取部位能够不同程度地抑制缺氧诱导的血管内皮细胞中VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2、ICAM-1、IL-1α基因的表达，升高VEGFR-1/VEGFR-2比值，其中以部位1作用最明显，部位3次之，部位2稍弱，这与DR发病机制和糖网明目颗粒组方规律一致。DR病因是气阴两虚，方中黄芪补气，女贞子补肝肾明目，密蒙花清热养肝、明目退翳，这3味药在方中比例较大，补气益肝肾，从根本上调理DR病程中之气阴两虚状态。另外，气虚则推动无力，致气血瘀滞；阴虚生热，煎熬津液，精亏液少，血黏不畅。方中益母草活血调经、利尿消肿，黄连清热燥湿、泻火解毒，而此2味药所含有的生物碱类物质如黄连素又有一定的抗炎作用，两者共用，能够调理DR病程中的阴虚夹热之瘀滞状态，改善DR病程中的炎症反应。乌梅收敛生津止血，与黄芪配伍补气养血；肉桂补火助阳活血，与黄连配伍，水火既济，安神宁血。二者若单独使用，从本实验结果看药效不明显。
综上，在调控因缺氧导致的血管内皮细胞VEGFR-1/VEGFR-2比值降低和VEGF、ICAM-1、IL-1α基因表达上调方面，糖网明目颗粒各部位的作用强度为：部位1的苷类和黄酮类>部位3的生物碱类>部位2的有机酸类和多糖类。本结果为分析糖网明目颗粒的药效物质基础提供了实验依据。
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（收稿日期：2015-03-24；编辑：华强）