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【摘 要】目的：探讨酶联免疫斑点检测技术（ELISPOT）（T-SPOT.TB）在快速诊断结核杆菌感染性疾病中的临床应用价值。方法：利用ELISPOT检测对结核菌特异抗原刺激反应，分泌γ-干扰素的效应T淋巴细胞数量方法，对72例结核杆菌感染性疾病组和20例健康体检者组的外周血作能分泌结核特异的γ-干扰素的T淋巴细胞测定，与结核菌纯蛋白衍生物试验（ PPD） 、结核抗体检查结果进行比较分析。结果：T-SPOT.TB敏感性为 91.7%，较PPD试验36.1%、抗结核抗体55.6%和PPD试验+抗结核抗体29.2%均明显增高，P值均< 0. 01，在统计学上具有显著差异。T-SPOT.TB特异性为 95. 0%。较PPD试验（85%）、PPD试验+抗结核抗体（90%）差异无统计学意义（P值均>0.05），而较之结核抗体的特异性 60.0%，在统计学上也具有显著差异（P < 0. 01）。T-SPOT.TB的准确率为 92.4%，较PPD试验46.7%、抗结核抗体56.5%和PPD试验+抗结核抗体42.4%均明顯增高，P值均< 0. 01，在统计学上具有显著差异。结论：酶联免疫斑点试验验检测结核敏感性强、准确率高，是诊断结核感染的有效手段。
【关键词】结核分枝杆菌；T-SPOT.TB；PPD试验 抗结核抗体
结核病是由结核杆菌感染引起的慢性传染病，是目前严重威胁人类健康的三大感染性疾病之一， 快速诊断和治疗是结核病控制的关键问题，但是，结核病的诊断仍然存在严重问题。传统的结核病检测方法如痰涂片染色法、培养法、免疫学方法和分子生物学方法等等虽然很多，但是这些方法存在敏感性较低、特异性较差、操作复杂，检测周期长等问题。酶联免疫斑点试验（enzyme-linked immunos pot， ELISPOT） （T-SPOT.TB）是由Czerkinsky等[1]于1983年根据酶联免疫吸附试验（ ELISA）建立的一种体外检测单细胞水平特异性抗体分泌细胞功能的免疫学技术，并由La-lvani等[2]首先将其应用于结核病的快速诊断，为结核病的快速诊断提供了一条新途径。本研究旨在以T-SPOT.TB检测其外周血结核特异抗原T淋巴细胞的数量，探讨该技术在结核病快速诊断中的应用价值。
1 材料与方法
1.1病例资料 结核组： 72 例均为 2012 年 3 月～2013年3 月本院住院的结核患者，结核病诊断依据2001年中华医学会结核病学分会制定的结核病的诊断标准执行，具有较高的可信性和可比性。男 44 例，女 28 例，年龄 16 ～78（ 39.6 ± 16.5.） 岁。其中肺结核 54 例，结核性胸膜炎 14 例，骨结核2例，结核性脑膜炎 1 例，肠结核 1例，所有病例均为临床确诊病例。健康对照组： 22 名本院体检中心体检健康人员，男 14 例，女 6 例，年龄12 ～ 46（ 28.5 ± 12. 0） 岁，均无结核病史和任何临床症状，经X 线检查确定无异常。
1.2 T-SPOT.TB 取3～4mL外周抗凝血，用淋巴细胞分层液分离、提纯外周血单个核细胞（PB-MC），调节细胞浓度至2.0×106/L。取一预包被IFN-C捕获单克隆抗体的微孔板，每个测试样本需要微孔板3孔：阴性对照孔内加入完全细胞培养液50uL，阳性对照孔内加入阳性对照PHA50uL；在测试孔内分别加入CFP10-ESAT6融合蛋白50uL。分别在上述各孔内加100uL含有2×105个PBMC的悬液，将微量板置于37℃含5%CO2孵箱中孵育20h；弃上清液，用200uL×PBS洗板4次，每孔加入50uL1∶60稀释的IFN-γ检测抗体，37℃孵育2h；洗板后，每孔加入50uL1：1 000稀释的链亲合素-碱性磷酸酶，室温孵育2h；洗板后，每孔加入50uL新鲜配制的BICP/NBT底物，显色15min；可见板底显示紫色斑点，用蒸馏水洗板中止反应。每1个点代表1个分泌IFN-γ的T细胞，应用CTL公司酶联斑点分析仪计数着色的斑点。当阴性对照孔点数<6，检测孔点数减去阴性对照孔点数≧8，可判断所检测标本为阳性；如果阴性对照孔点数≧6，检测孔点数为阴性对照孔2倍，可判断所检测标本为阳性。
1.3 PPD试验：于左前臂皮内注射标准PPD 0.1ml（含5个结核菌素单位）。72h查验反应结果，记录硬结平均直径。按PPD皮试结果分级：PPD（-）：硬结<5mm；PPD（+）：硬结5～9mm；PPD（++）：硬结10～19mm；PPD强阳性（+ + +）：硬结≥20mm或出现明显水泡、坏死。
1.4 抗结核抗体检测 取外周不抗凝血2～3mL，1～2h后3 000r/min离心15min，取上清液用于抗结核抗体检测。联合检测3个抗结核抗体所用抗原分别为阿拉伯甘露聚糖、结核分枝杆菌活动期产生的38×103u蛋白及16×103u蛋白。严格按试剂盒提供的步骤操作。检测的血或（和）痰及体液标本≧2。
1.5 统计学处理 应用 SPSS 17. 0 软件分析，采用χ2检验对各组检出阳性率进行统计学分析。
2 结果
2.1 结核组患者和健康对照组的结核相关检查结果见表1
T-SPOT.TB的灵敏性91.7 %（66/72），PPD试验的灵敏性为36.1%（26/72），抗结核抗体的灵敏性为55.6%（40/72），PPD试验+抗结核抗体联合检查的灵敏性为29.2%（21/72）， T-SPOT.TB的灵敏性较PPD试验、抗结核抗体、PPD试验+抗结核抗体联合检查的灵敏度性均明显增高，P均< 0. 01，具有显著统计学差异。T-SPOT.TB的特异性95.0%（19/20），与PPD试验的85.0%（17/20）和PPD试验+抗结核抗体联合检查的90.0%（18/20）相比，差异无统计学意义（P值均>0.05），但是较之抗结核抗体的特异性60.0%（12/20）有显著统计学差异（P < 0. 01）。T-SPOT.TB的准确率92.4 %（85/92），PPD试验的准确率为46.7%（43/92），抗结核抗体的准确率为56.5%（52/92），PPD试验+抗结核抗体联合检查的准确率为42.4%（39/92）， T-SPOT.TB的准确率较PPD试验、抗结核抗体、PPD试验+抗结核抗体联合检查的准确率均明显增高，P均< 0. 01，具有显著统计学差异。 3 讨论
T-SPOT·TB是以 T 细胞免疫应答为基础的 γ-干扰素（ γ-IFN） 释放实验，其原理是结核杆菌感染者外周血单核细胞 （ PBMC） 中存在的特异性 T 细胞在受到抗原早期分泌性抗原靶蛋白 6（ ESAT-6） 和培养滤过蛋白 10 （ CFP-10） 刺激后会分泌 γ-IFN，释放的 γ-IFN 随即与微孔板底部包被的 γ-IFN 抗体结合而形成免疫复合物，该复合物再与随后加入的碱性磷酸酶标记的抗抗体结合，继而分解分解随后加入的显色底物溶液而在反应部位形成不溶性色素沉淀斑点。每一个斑点代表 1 个 γ-IFN 分泌细胞（ 结核特异的效应 T 细胞） 。根据斑点数推测体内是否存在对结核杆菌反应的效应 T 细胞，从而对结核杆菌感染进行辅助诊断[3]。其中抗原 ESAT-6 和 CFP-10 为结核分枝杆菌和少数非结核分枝杆菌所特有，而不存在于卡介苗及大多数非结核分枝杆菌中[4]，因而从根本上避免了传统结核菌素皮试中所存在的 BCG 交叉抗原反应，从而确保了 T-SPOT·TB 的高度特异性。
本研究对 92 例受检者进行了 T-SPOT·TB 检测，结果表明其诊断结核的特异性和敏感性分别为95. 0% 和 91.7% 。这与国内外学者[5、6、7、8]的研究结果相似。而且整个检测过程，仅需24 h。由于每份标本采用阴性、阳性对照，结果更加客观可靠、操作简便。通过使用仪器尚可实现自动化。说明ELISPOT法可快速检测外周血中的结核菌抗原特异T淋巴细胞的反应频率，对结核病的快速诊断提供可靠的客观依据。
除了 T-SPOT·TB 检测以外，本研究对 92 例受检者还进行了 PPD 和结核抗体检查，结果表明 T-SPOT·TB 诊断结核敏感性91.7%、准确率92.4%均显著高于PPD 试验、抗结核抗体和PPD 试验+抗结核抗体联合检验方法，具有显著统计学差异（P 均< 0. 01）。T-SPOT·TB的特异性水平95%这与国内外多位学者[5，8]的研究结果一致。其优于PPD试验、PPD试验+抗结核抗体联合检查，可能由于健康体检组样本量较少，无统计学差异（P值均>0.05）。但是显著优于抗结核抗体的60%水平（P < 0. 01）。我国是结核感染的高流行区，可能存在着相当比例的潜伏结核感染者，而且卡介苗接种率高，这就严重影响了抗结核抗体检查和PPD试验的临床应用价值。而T-SPOT·TB不受卡介苗接种接种影响[2，5]，还可以有效地筛选出潜伏结核感染者，对这些潜伏感染患者进行干预治疗可以有效遏制潜伏结核转化为活动性结核，提高了它对结核病的诊断准确率，这些对于减少结核感染的传播和流行，实现结核病疫情控制目标至关重要。 总而言之，本研究进一步肯定了T-SPOT.TB检测在结核杆菌感染性疾病临床诊断中的应用价值。它具有快速、准确的特点，较目前临床常用的PPD试验及抗结核抗体检测有明显的优势，值得进一步推广和应用。
参考文献：
[1] MD， Adetifa IM， Donkor S， et al. Evaluationofthcontr-ibution of major T cell subsetsto IFN-gamma production in TB in-fection by ELISPOT. Immunol Invest， 2009，38（5）：341～349.
[2] LalvaniA， Pathan AA， McShane H， et a1. Rapid detection of My-cobacterium tuberculosis infecti on by enumeration of antigen-spe-cific T cells. Am J Respir Crit CareMed， 200 l，163 （4） ： 824～828
[3] 霍霏霏，刘晓清. 结核病免疫学诊断新进展 T-SPOT·TB[J].中华实验和临床感染病杂志，2010，4（ 2） ： 48 -50.
[4] Behr M A，Wilson M A，Gill W P，et al. Comparative genomics ofBCG vaccines by whole-genome DNA microarray[J]. Science， 1999，284（ 5419） ： 1520 - 3.
[5] Lee J Y，Choi H J，Park I N，et al. Comparison of two commercialinterferon-gamma assays for diagnosing Mycobacterium tuberculosisinfection[J]. Eur Respir J，2006，28（ 1） ： 24 - 30.
[6] Pai M，Zwerling A，Menzies D. Systematic review：T-cell-basedassays for the diagnosis of latent tuberculosis infection： an update[J]. Ann Intern Med，2008，149（ 3） ： 177 -84.
[7] 樂 军，梁 莉，李苏辉，等. 酶联免疫斑点试验快速诊断结核分枝杆菌感染的临床应用价值[J]. 中华检验医学杂志，2006， 29（ 11） ： 1005 - 8.
[8] 张 瑛，孙亚蒙，徐欣晖，等. 结核感染 T 细胞斑点试验在结核性疾病中的诊断价值[J]. 中华临床医师杂志，2010，4（ 12） ： 2431 - 5.
【关键词】结核分枝杆菌；T-SPOT.TB；PPD试验 抗结核抗体
结核病是由结核杆菌感染引起的慢性传染病，是目前严重威胁人类健康的三大感染性疾病之一， 快速诊断和治疗是结核病控制的关键问题，但是，结核病的诊断仍然存在严重问题。传统的结核病检测方法如痰涂片染色法、培养法、免疫学方法和分子生物学方法等等虽然很多，但是这些方法存在敏感性较低、特异性较差、操作复杂，检测周期长等问题。酶联免疫斑点试验（enzyme-linked immunos pot， ELISPOT） （T-SPOT.TB）是由Czerkinsky等[1]于1983年根据酶联免疫吸附试验（ ELISA）建立的一种体外检测单细胞水平特异性抗体分泌细胞功能的免疫学技术，并由La-lvani等[2]首先将其应用于结核病的快速诊断，为结核病的快速诊断提供了一条新途径。本研究旨在以T-SPOT.TB检测其外周血结核特异抗原T淋巴细胞的数量，探讨该技术在结核病快速诊断中的应用价值。
1 材料与方法
1.1病例资料 结核组： 72 例均为 2012 年 3 月～2013年3 月本院住院的结核患者，结核病诊断依据2001年中华医学会结核病学分会制定的结核病的诊断标准执行，具有较高的可信性和可比性。男 44 例，女 28 例，年龄 16 ～78（ 39.6 ± 16.5.） 岁。其中肺结核 54 例，结核性胸膜炎 14 例，骨结核2例，结核性脑膜炎 1 例，肠结核 1例，所有病例均为临床确诊病例。健康对照组： 22 名本院体检中心体检健康人员，男 14 例，女 6 例，年龄12 ～ 46（ 28.5 ± 12. 0） 岁，均无结核病史和任何临床症状，经X 线检查确定无异常。
1.2 T-SPOT.TB 取3～4mL外周抗凝血，用淋巴细胞分层液分离、提纯外周血单个核细胞（PB-MC），调节细胞浓度至2.0×106/L。取一预包被IFN-C捕获单克隆抗体的微孔板，每个测试样本需要微孔板3孔：阴性对照孔内加入完全细胞培养液50uL，阳性对照孔内加入阳性对照PHA50uL；在测试孔内分别加入CFP10-ESAT6融合蛋白50uL。分别在上述各孔内加100uL含有2×105个PBMC的悬液，将微量板置于37℃含5%CO2孵箱中孵育20h；弃上清液，用200uL×PBS洗板4次，每孔加入50uL1∶60稀释的IFN-γ检测抗体，37℃孵育2h；洗板后，每孔加入50uL1：1 000稀释的链亲合素-碱性磷酸酶，室温孵育2h；洗板后，每孔加入50uL新鲜配制的BICP/NBT底物，显色15min；可见板底显示紫色斑点，用蒸馏水洗板中止反应。每1个点代表1个分泌IFN-γ的T细胞，应用CTL公司酶联斑点分析仪计数着色的斑点。当阴性对照孔点数<6，检测孔点数减去阴性对照孔点数≧8，可判断所检测标本为阳性；如果阴性对照孔点数≧6，检测孔点数为阴性对照孔2倍，可判断所检测标本为阳性。
1.3 PPD试验：于左前臂皮内注射标准PPD 0.1ml（含5个结核菌素单位）。72h查验反应结果，记录硬结平均直径。按PPD皮试结果分级：PPD（-）：硬结<5mm；PPD（+）：硬结5～9mm；PPD（++）：硬结10～19mm；PPD强阳性（+ + +）：硬结≥20mm或出现明显水泡、坏死。
1.4 抗结核抗体检测 取外周不抗凝血2～3mL，1～2h后3 000r/min离心15min，取上清液用于抗结核抗体检测。联合检测3个抗结核抗体所用抗原分别为阿拉伯甘露聚糖、结核分枝杆菌活动期产生的38×103u蛋白及16×103u蛋白。严格按试剂盒提供的步骤操作。检测的血或（和）痰及体液标本≧2。
1.5 统计学处理 应用 SPSS 17. 0 软件分析，采用χ2检验对各组检出阳性率进行统计学分析。
2 结果
2.1 结核组患者和健康对照组的结核相关检查结果见表1
T-SPOT.TB的灵敏性91.7 %（66/72），PPD试验的灵敏性为36.1%（26/72），抗结核抗体的灵敏性为55.6%（40/72），PPD试验+抗结核抗体联合检查的灵敏性为29.2%（21/72）， T-SPOT.TB的灵敏性较PPD试验、抗结核抗体、PPD试验+抗结核抗体联合检查的灵敏度性均明显增高，P均< 0. 01，具有显著统计学差异。T-SPOT.TB的特异性95.0%（19/20），与PPD试验的85.0%（17/20）和PPD试验+抗结核抗体联合检查的90.0%（18/20）相比，差异无统计学意义（P值均>0.05），但是较之抗结核抗体的特异性60.0%（12/20）有显著统计学差异（P < 0. 01）。T-SPOT.TB的准确率92.4 %（85/92），PPD试验的准确率为46.7%（43/92），抗结核抗体的准确率为56.5%（52/92），PPD试验+抗结核抗体联合检查的准确率为42.4%（39/92）， T-SPOT.TB的准确率较PPD试验、抗结核抗体、PPD试验+抗结核抗体联合检查的准确率均明显增高，P均< 0. 01，具有显著统计学差异。 3 讨论
T-SPOT·TB是以 T 细胞免疫应答为基础的 γ-干扰素（ γ-IFN） 释放实验，其原理是结核杆菌感染者外周血单核细胞 （ PBMC） 中存在的特异性 T 细胞在受到抗原早期分泌性抗原靶蛋白 6（ ESAT-6） 和培养滤过蛋白 10 （ CFP-10） 刺激后会分泌 γ-IFN，释放的 γ-IFN 随即与微孔板底部包被的 γ-IFN 抗体结合而形成免疫复合物，该复合物再与随后加入的碱性磷酸酶标记的抗抗体结合，继而分解分解随后加入的显色底物溶液而在反应部位形成不溶性色素沉淀斑点。每一个斑点代表 1 个 γ-IFN 分泌细胞（ 结核特异的效应 T 细胞） 。根据斑点数推测体内是否存在对结核杆菌反应的效应 T 细胞，从而对结核杆菌感染进行辅助诊断[3]。其中抗原 ESAT-6 和 CFP-10 为结核分枝杆菌和少数非结核分枝杆菌所特有，而不存在于卡介苗及大多数非结核分枝杆菌中[4]，因而从根本上避免了传统结核菌素皮试中所存在的 BCG 交叉抗原反应，从而确保了 T-SPOT·TB 的高度特异性。
本研究对 92 例受检者进行了 T-SPOT·TB 检测，结果表明其诊断结核的特异性和敏感性分别为95. 0% 和 91.7% 。这与国内外学者[5、6、7、8]的研究结果相似。而且整个检测过程，仅需24 h。由于每份标本采用阴性、阳性对照，结果更加客观可靠、操作简便。通过使用仪器尚可实现自动化。说明ELISPOT法可快速检测外周血中的结核菌抗原特异T淋巴细胞的反应频率，对结核病的快速诊断提供可靠的客观依据。
除了 T-SPOT·TB 检测以外，本研究对 92 例受检者还进行了 PPD 和结核抗体检查，结果表明 T-SPOT·TB 诊断结核敏感性91.7%、准确率92.4%均显著高于PPD 试验、抗结核抗体和PPD 试验+抗结核抗体联合检验方法，具有显著统计学差异（P 均< 0. 01）。T-SPOT·TB的特异性水平95%这与国内外多位学者[5，8]的研究结果一致。其优于PPD试验、PPD试验+抗结核抗体联合检查，可能由于健康体检组样本量较少，无统计学差异（P值均>0.05）。但是显著优于抗结核抗体的60%水平（P < 0. 01）。我国是结核感染的高流行区，可能存在着相当比例的潜伏结核感染者，而且卡介苗接种率高，这就严重影响了抗结核抗体检查和PPD试验的临床应用价值。而T-SPOT·TB不受卡介苗接种接种影响[2，5]，还可以有效地筛选出潜伏结核感染者，对这些潜伏感染患者进行干预治疗可以有效遏制潜伏结核转化为活动性结核，提高了它对结核病的诊断准确率，这些对于减少结核感染的传播和流行，实现结核病疫情控制目标至关重要。 总而言之，本研究进一步肯定了T-SPOT.TB检测在结核杆菌感染性疾病临床诊断中的应用价值。它具有快速、准确的特点，较目前临床常用的PPD试验及抗结核抗体检测有明显的优势，值得进一步推广和应用。
参考文献：
[1] MD， Adetifa IM， Donkor S， et al. Evaluationofthcontr-ibution of major T cell subsetsto IFN-gamma production in TB in-fection by ELISPOT. Immunol Invest， 2009，38（5）：341～349.
[2] LalvaniA， Pathan AA， McShane H， et a1. Rapid detection of My-cobacterium tuberculosis infecti on by enumeration of antigen-spe-cific T cells. Am J Respir Crit CareMed， 200 l，163 （4） ： 824～828
[3] 霍霏霏，刘晓清. 结核病免疫学诊断新进展 T-SPOT·TB[J].中华实验和临床感染病杂志，2010，4（ 2） ： 48 -50.
[4] Behr M A，Wilson M A，Gill W P，et al. Comparative genomics ofBCG vaccines by whole-genome DNA microarray[J]. Science， 1999，284（ 5419） ： 1520 - 3.
[5] Lee J Y，Choi H J，Park I N，et al. Comparison of two commercialinterferon-gamma assays for diagnosing Mycobacterium tuberculosisinfection[J]. Eur Respir J，2006，28（ 1） ： 24 - 30.
[6] Pai M，Zwerling A，Menzies D. Systematic review：T-cell-basedassays for the diagnosis of latent tuberculosis infection： an update[J]. Ann Intern Med，2008，149（ 3） ： 177 -84.
[7] 樂 军，梁 莉，李苏辉，等. 酶联免疫斑点试验快速诊断结核分枝杆菌感染的临床应用价值[J]. 中华检验医学杂志，2006， 29（ 11） ： 1005 - 8.
[8] 张 瑛，孙亚蒙，徐欣晖，等. 结核感染 T 细胞斑点试验在结核性疾病中的诊断价值[J]. 中华临床医师杂志，2010，4（ 12） ： 2431 - 5.