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摘要：目的：通过观察p53基因在翼状胬肉组织中的表达，探讨翼状胬肉的发病与凋亡机制之间的关系。方法：选择25例翼状胬肉组织作为实验组，对照组选用正常眼鼻侧结膜组织，制作石蜡切片后常规HE染色和p53单克隆抗体免疫组化染色，实验数据进行秩和检验。结果：实验组中的p53蛋白含量显著高于对照组，两者差异有高度显著性（P<0.01）。结论：翼状胬肉病变发展的早期可能存在着p53基因的突变，从而使正常p53肿瘤抑制基因作用丧失，导致结膜组织过度增殖及胬肉纤维血管组织向角膜的侵袭。
关键词：翼状胬肉 基因 p53 免疫组织化学
Doi：10.3969/j.issn.1671-8801.2013.07.134
【中图分类号】R4 【文献标识码】B 【文章编号】1671-8801（2013）07-0125-01
翼状胬肉是一种临床上常见的眼表疾病，它以结膜下纤维血管组织呈三角形增生并向角膜侵犯为特征，多见于鼻侧睑裂区，常双眼发病，术后易复发。发展到一定程度可引起散光、视力下降、眼部不适感及美容问题，影响患者的身心健康[1]。关于翼状胬肉的病因和发病机制仍未明确，目前认为日光中的紫外线是最重要的环境致病因素。在紫外线氧化应激引起的DNA损伤中，p53基因是最常见的被损伤的基因之一[2]。本研究通过观察p53基因在翼状胬肉组织中的表达，探讨翼状胬肉的发病与凋亡机制之间的关系，为明确翼状胬肉的病因和发病机制奠定基础。
1 资料与方法
1.1 一般资料。25例翼状胬肉组织标本（实验组）随机取自中山市南朗医院眼科病人，均为原发性翼状胬肉患者，胬肉位于鼻侧。其中男10例，女15例，年龄为47～76岁，平均53.9岁。5例对照组为正常眼鼻侧结膜组织，年龄为51～62岁，平均55.8岁。所有病例均无其他角膜、结膜疾病。各组在年龄、性别、病程方面经统计学处理差异无显著性（P>0.05），具有可比性。选取胬肉头颈部组织，包括表面结膜样组织，对照组选自正常眼鼻侧结膜组织，距角膜缘约1～2mm，组织大小约3～4mm。取材后即置入10%的甲醛溶液浸泡固定，常规脱水、石蜡包埋。
1.2 石蜡切片的制作。从10%甲醛溶液中取出组织，流水冲洗过夜，依次采用乙醇梯度脱水，70%乙醇15s，80%、90%、95%、100%乙醇各3h，二甲苯透明3次，每次10min，从低熔点石蜡到高熔点石蜡浸蜡，共3次，每次1h。包埋，4μm连续切片，每个石蜡块切4～5张。
1.3 HE染色。将组织切片依次放入二甲苯脱蜡和95%乙醇各2次，每次1min；蒸馏水冲洗2次，每次5min；苏木精染色液浸染10min；流水冲洗5min；0.5%伊红乙醇浸染2min；95%乙醇和无水乙醇脱水各2次，每次2min；滴中性树脂，加盖玻片，光镜下观察翼状胬肉组织的病理学改变。
1.4 免疫组化染色。切片脱蜡至水化，橼酸微波抗原修复15min，3%H2O2室温孵育10min，以消除内源性过氧化物酶活性。PBS浸泡3×5min，加入即用型鼠抗人p53单克隆抗体，4℃过夜，PBS冲洗3×5min，滴加生物素标记的二抗，室温孵育30min，PBS冲洗3×5min，每张切片滴加约50μl抗生物素-过氧化酶溶液，室温30min。PBS冲洗3×3min。滴加新鲜配制的DAB溶液显色3～10min。用自来水冲洗，苏木素复染，中性树胶封固。以PBS替代一抗作为阴性对照。阳性对照片由福州迈新公司提供。
1.5 结果判断标准。以细胞浆内出现棕色或棕黄色颗粒为阳性染色，每张切片在高倍显微镜下（200倍）随机选择5个视野，计算每个视野阳性细胞率，取平均值作为该标本的阳性细胞率。根据阳性细胞数占上皮细胞的比例判断结果：0～5%为阴性（-），5%～25%为弱阳性（+），25%～50%为中等阳性（++），>50%为强阳性（+++）。
1.6 统计学处理。采用SPSS11.0软件，将实验组与对照组的实验数据进行秩和检验。
2 结果
2.1 HE染色。
2.1.1 正常结膜的组织学表现。结膜分为上皮层和基质层。上皮层由3～5层细胞组成，表层为扁平细胞，中层为多边形细胞，基底层为立方形或柱形细胞。基质层为疏松结缔组织，其间有散在的毛细血管，少量成纤维细胞、淋巴细胞和中性粒细胞。
2.1.2 翼状胬肉组织的病理学表现。胬肉组织上皮层均可见不同程度的增生。上皮下组织可见成纤维细胞增生活跃、新生血管增多，在血管周围有大量炎性细胞浸润，有淋巴细胞、浆细胞和少量的中性粒细胞。
2.2 免疫组化染色。在翼状胬肉中，p53蛋白染色阳性细胞主要位于上皮细胞基底层。p53基因蛋白产物阳性反应呈棕黄色颗粒，在细胞核呈阳性表达。p53蛋白在两组中的表达，翼状胬肉中的p53蛋白含量较正常结膜高，两者差异具有高度显著性（P<0.01）。
3 讨论
翼状胬肉是一种组织增生性疾病，以新生的纤维血管组织自球结膜生长向角膜表面侵袭为其特点。目前，关于翼状胬肉的病因和发病机制仍未明确。翼状胬肉的临床表现为新生的组织不断生长、增厚，并逐渐侵入角膜，手术切除后易复发，治疗效果不甚理想[3]。此特点与肿瘤组织相似，肿瘤发生发展的重要原因是细胞异常增殖和凋亡失衡。翼状胬肉的发病可能代表着细胞增生和凋亡的异常。
目前，已发现的凋亡相关基因多达数十种，根据其功能的不同可分为三类：抑制凋亡基因，如Bcl-2、EIB等；促进凋亡基因，如p53、Bax、Fas等，双向调控基因；如c-myc、Bclx等。
p53基因参与细胞DNA的修复与合成，调节细胞的分化、凋亡，控制细胞的周期，是引起人类肿瘤发生最常见的突变基因。翼状胬肉的发生、发展与许多环境因素相关，如紫外线刺激、慢性充血和炎症等。其中，紫外线是最重要的环境致病因素，户外工作者（接受紫外线辐射较多）的p53蛋白表达较户内工作者明显增多，提示紫外线可能引起p53蛋白的异常表达[4]。
p53作为抑癌基因，主要的生物学作用是调控细胞周期和诱导细胞凋亡，维持基因组和细胞稳定，抑制肿瘤生长。p53基因定位于17P13.1，长度约20kb，由11个外显子和10个内含子组成，人p53蛋白由393个氨基酸组成，分子量为53×103。p53分为野生型和突变型，野生型为肿瘤抑制基因，可抑制在培养过程中有其他癌基因作用的细胞的转化和生长。而当p53基因发生丢失或突变时，改变原有的功能引起细胞生长的失控及转录即为突变型p53。突变型p53基因不仅引起p53抑癌活性的丧失，而且具有促进恶性转化的活性。野生型p53其蛋白产物半衰期较短，免疫组化法难以检测，p53基因突变可使该蛋白失活，在组织中堆积，通过免疫组化方法可以检测到。
细胞增殖活跃是翼状胬肉生长和复发的重要基础。具有增殖活性的变性结膜上皮细胞侵入角膜，在多种细胞因子作用下，增生的球结膜进展性肥厚，成纤维细胞增殖和新生血管产生。本实验中翼状胬肉组织HE染色上皮层均可见不同程度的增生，最厚者可达20余层。上皮下组织可见成纤维细胞增生活跃、新生血管增多。本实验结果发现翼状胬肉组织p53蛋白表达较正常结膜增多（P<0.01），阳性表达呈细胞核型。我们推测翼状胬肉病变发展的早期可能存在着p53基因的突变，从而使正常p53肿瘤抑制基因作用丧失，导致结膜组织过度增殖及胬肉纤维血管组织向角膜侵袭。
参考文献
[1] 徐锦堂，孙秉基，方海州.眼表疾病的基础理论和临床[M].天津：天津科学技术出版社，2002：287
[2] 喻谦，柳林.翼状胬肉发病机制研究进展[J].眼科研究，2008，26（9）：713-716
[3] 姚艳娇，刘新.翼状胬肉的治疗进展[J].国际眼科杂志，2008，8（9）：1898-1901
[4] 张梅，刘祖国，李永平，等.翼状胬肉上皮细胞p53蛋白的表达及其功能状态的研究[J].中华眼科杂志，2002，38（2）：115-117
关键词：翼状胬肉 基因 p53 免疫组织化学
Doi：10.3969/j.issn.1671-8801.2013.07.134
【中图分类号】R4 【文献标识码】B 【文章编号】1671-8801（2013）07-0125-01
翼状胬肉是一种临床上常见的眼表疾病，它以结膜下纤维血管组织呈三角形增生并向角膜侵犯为特征，多见于鼻侧睑裂区，常双眼发病，术后易复发。发展到一定程度可引起散光、视力下降、眼部不适感及美容问题，影响患者的身心健康[1]。关于翼状胬肉的病因和发病机制仍未明确，目前认为日光中的紫外线是最重要的环境致病因素。在紫外线氧化应激引起的DNA损伤中，p53基因是最常见的被损伤的基因之一[2]。本研究通过观察p53基因在翼状胬肉组织中的表达，探讨翼状胬肉的发病与凋亡机制之间的关系，为明确翼状胬肉的病因和发病机制奠定基础。
1 资料与方法
1.1 一般资料。25例翼状胬肉组织标本（实验组）随机取自中山市南朗医院眼科病人，均为原发性翼状胬肉患者，胬肉位于鼻侧。其中男10例，女15例，年龄为47～76岁，平均53.9岁。5例对照组为正常眼鼻侧结膜组织，年龄为51～62岁，平均55.8岁。所有病例均无其他角膜、结膜疾病。各组在年龄、性别、病程方面经统计学处理差异无显著性（P>0.05），具有可比性。选取胬肉头颈部组织，包括表面结膜样组织，对照组选自正常眼鼻侧结膜组织，距角膜缘约1～2mm，组织大小约3～4mm。取材后即置入10%的甲醛溶液浸泡固定，常规脱水、石蜡包埋。
1.2 石蜡切片的制作。从10%甲醛溶液中取出组织，流水冲洗过夜，依次采用乙醇梯度脱水，70%乙醇15s，80%、90%、95%、100%乙醇各3h，二甲苯透明3次，每次10min，从低熔点石蜡到高熔点石蜡浸蜡，共3次，每次1h。包埋，4μm连续切片，每个石蜡块切4～5张。
1.3 HE染色。将组织切片依次放入二甲苯脱蜡和95%乙醇各2次，每次1min；蒸馏水冲洗2次，每次5min；苏木精染色液浸染10min；流水冲洗5min；0.5%伊红乙醇浸染2min；95%乙醇和无水乙醇脱水各2次，每次2min；滴中性树脂，加盖玻片，光镜下观察翼状胬肉组织的病理学改变。
1.4 免疫组化染色。切片脱蜡至水化，橼酸微波抗原修复15min，3%H2O2室温孵育10min，以消除内源性过氧化物酶活性。PBS浸泡3×5min，加入即用型鼠抗人p53单克隆抗体，4℃过夜，PBS冲洗3×5min，滴加生物素标记的二抗，室温孵育30min，PBS冲洗3×5min，每张切片滴加约50μl抗生物素-过氧化酶溶液，室温30min。PBS冲洗3×3min。滴加新鲜配制的DAB溶液显色3～10min。用自来水冲洗，苏木素复染，中性树胶封固。以PBS替代一抗作为阴性对照。阳性对照片由福州迈新公司提供。
1.5 结果判断标准。以细胞浆内出现棕色或棕黄色颗粒为阳性染色，每张切片在高倍显微镜下（200倍）随机选择5个视野，计算每个视野阳性细胞率，取平均值作为该标本的阳性细胞率。根据阳性细胞数占上皮细胞的比例判断结果：0～5%为阴性（-），5%～25%为弱阳性（+），25%～50%为中等阳性（++），>50%为强阳性（+++）。
1.6 统计学处理。采用SPSS11.0软件，将实验组与对照组的实验数据进行秩和检验。
2 结果
2.1 HE染色。
2.1.1 正常结膜的组织学表现。结膜分为上皮层和基质层。上皮层由3～5层细胞组成，表层为扁平细胞，中层为多边形细胞，基底层为立方形或柱形细胞。基质层为疏松结缔组织，其间有散在的毛细血管，少量成纤维细胞、淋巴细胞和中性粒细胞。
2.1.2 翼状胬肉组织的病理学表现。胬肉组织上皮层均可见不同程度的增生。上皮下组织可见成纤维细胞增生活跃、新生血管增多，在血管周围有大量炎性细胞浸润，有淋巴细胞、浆细胞和少量的中性粒细胞。
2.2 免疫组化染色。在翼状胬肉中，p53蛋白染色阳性细胞主要位于上皮细胞基底层。p53基因蛋白产物阳性反应呈棕黄色颗粒，在细胞核呈阳性表达。p53蛋白在两组中的表达，翼状胬肉中的p53蛋白含量较正常结膜高，两者差异具有高度显著性（P<0.01）。
3 讨论
翼状胬肉是一种组织增生性疾病，以新生的纤维血管组织自球结膜生长向角膜表面侵袭为其特点。目前，关于翼状胬肉的病因和发病机制仍未明确。翼状胬肉的临床表现为新生的组织不断生长、增厚，并逐渐侵入角膜，手术切除后易复发，治疗效果不甚理想[3]。此特点与肿瘤组织相似，肿瘤发生发展的重要原因是细胞异常增殖和凋亡失衡。翼状胬肉的发病可能代表着细胞增生和凋亡的异常。
目前，已发现的凋亡相关基因多达数十种，根据其功能的不同可分为三类：抑制凋亡基因，如Bcl-2、EIB等；促进凋亡基因，如p53、Bax、Fas等，双向调控基因；如c-myc、Bclx等。
p53基因参与细胞DNA的修复与合成，调节细胞的分化、凋亡，控制细胞的周期，是引起人类肿瘤发生最常见的突变基因。翼状胬肉的发生、发展与许多环境因素相关，如紫外线刺激、慢性充血和炎症等。其中，紫外线是最重要的环境致病因素，户外工作者（接受紫外线辐射较多）的p53蛋白表达较户内工作者明显增多，提示紫外线可能引起p53蛋白的异常表达[4]。
p53作为抑癌基因，主要的生物学作用是调控细胞周期和诱导细胞凋亡，维持基因组和细胞稳定，抑制肿瘤生长。p53基因定位于17P13.1，长度约20kb，由11个外显子和10个内含子组成，人p53蛋白由393个氨基酸组成，分子量为53×103。p53分为野生型和突变型，野生型为肿瘤抑制基因，可抑制在培养过程中有其他癌基因作用的细胞的转化和生长。而当p53基因发生丢失或突变时，改变原有的功能引起细胞生长的失控及转录即为突变型p53。突变型p53基因不仅引起p53抑癌活性的丧失，而且具有促进恶性转化的活性。野生型p53其蛋白产物半衰期较短，免疫组化法难以检测，p53基因突变可使该蛋白失活，在组织中堆积，通过免疫组化方法可以检测到。
细胞增殖活跃是翼状胬肉生长和复发的重要基础。具有增殖活性的变性结膜上皮细胞侵入角膜，在多种细胞因子作用下，增生的球结膜进展性肥厚，成纤维细胞增殖和新生血管产生。本实验中翼状胬肉组织HE染色上皮层均可见不同程度的增生，最厚者可达20余层。上皮下组织可见成纤维细胞增生活跃、新生血管增多。本实验结果发现翼状胬肉组织p53蛋白表达较正常结膜增多（P<0.01），阳性表达呈细胞核型。我们推测翼状胬肉病变发展的早期可能存在着p53基因的突变，从而使正常p53肿瘤抑制基因作用丧失，导致结膜组织过度增殖及胬肉纤维血管组织向角膜侵袭。
参考文献
[1] 徐锦堂，孙秉基，方海州.眼表疾病的基础理论和临床[M].天津：天津科学技术出版社，2002：287
[2] 喻谦，柳林.翼状胬肉发病机制研究进展[J].眼科研究，2008，26（9）：713-716
[3] 姚艳娇，刘新.翼状胬肉的治疗进展[J].国际眼科杂志，2008，8（9）：1898-1901
[4] 张梅，刘祖国，李永平，等.翼状胬肉上皮细胞p53蛋白的表达及其功能状态的研究[J].中华眼科杂志，2002，38（2）：115-117