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[摘要] 目的 探讨阿霉素加热化疗对人肝癌细胞HHCC及HepG2的抑制作用。方法 选择体外培养对数生长期HHCC及HepG2细胞为研究对象，采用10%胎牛血清培养液配制成细胞密度5×104/mL的单细胞悬液，接种于50mL的培养瓶中，细胞分为3组，分别进行单纯加热、单纯化疗、加热化疗处理；采用MTT法检测细胞增殖抑制率，采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。 结果 HHCC及HepG2细胞增殖抑制率3组间比较，差异有统计学意义（P<0.05）；加热化疗组细胞增殖抑制率明显高于单纯加热组及单纯化疗组（P<0.05）；HHCC及HepG2细胞凋亡率三组间差异有统计学意义（P<0.05），加热化疗组细胞凋亡率明显高于单纯加热组及单纯化疗组（P<0.05）。 结论 加热化疗可明显增强阿霉素对人肝癌细胞HHCC及HepG2的增殖抑制作用，对临床治疗有借鉴意义。
[关键词] 阿霉素；热化疗；人肝癌细胞；细胞增殖
[中图分类号] R735.7 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2014）12-11-03
原发性肝癌是我国常见的恶肿瘤之一，在恶性
肿瘤死亡顺位中占第2位，其致死率在城市人群中仅次于肺癌；农村人群中仅次于胃癌。但是原发性肝癌早期症状不明显，临床出现典型症状时大多处于晚期，且病情进展较快，治疗难度较大，术后容易复发，或丧失手术机会，患者短期内死亡[1]。因此提高肝癌尤其是晚期肝癌的药物治疗水平对改善患者病情，延长患者生存期有重要意义。热疗是近年兴起的一种新的肿瘤治疗方法，大量临床研究显示热疗对化疗或放疗有明显的增效作用，部分肿瘤患者热化疗后其完全缓解率可提高1倍左右[2]。本文研究加热化疗对人肝癌细胞HHCC及HepG2的抑制作用，为肝癌的临床治疗提供参考。
1 资料与方法
1.1 实验材料
肝癌HHCC及HepG2细胞由本院肿瘤实验室提供，采用含10%牛血清的培养液保存。阿霉素购自辉瑞制药有限公司，多孔细胞培养板购自上海研拓生物科技有限公司，电热恒温水浴箱购自苏州珀西瓦尔实验设备有限公司，Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 HHCC及HepG2细胞均采用含10%牛血清的DMEM培养液培养，取对数生长期细胞进行试验，用10%胎牛血清培养液配制成细胞密度5×104/mL的单细胞悬液，接种于50mL培养瓶中。根据相关文献研究显示阿霉素作用于HHCC细胞及HepG2细胞时24h IC50的药物浓度分别为7.0mg/L，2.0mg/L[3]，本文以此浓度为实验浓度。热化疗组及化疗组HHCC及HepG2细胞培养瓶中加入对应浓度的阿霉素，单纯热疗组培养瓶加入等量空白对照液；化疗组放入37℃，5%CO2培养箱中继续培养，而热化疗组及单纯热疗组放入电热恒温水浴箱进行加热，温度设定为43℃，上下浮动不超过0.1℃，加热时间为60min，加热后继续放入培养箱中培养24h。
1.2.2 细胞增殖抑制率测定（MTT法） 取常规对数生长期细胞（对照组）及经过上述处理的细胞（实验组），制成单细胞悬液，调整细胞密度为2.5×105/mL，接种于96孔培养板中，每孔200μL，每孔加入MTT 20μL，继续培养4h后取出培养板，弃MTT液，每孔加入DMSO 150μL，微量震荡后，将培养板置于全自动酶标仪，测定每孔OD值，以（对照组OD值-实验组OD值）/对照组OD值测定细胞增殖抑制率。
1.2.3 细胞凋亡率测定 各组细胞经处理后，取样，配置细胞悬液，细胞密度5×105/mL，取1mL，采用PBS溶液洗涤2次后加入Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂，避光保存1h后，采用流式细胞仪检测细胞数，以Cell quest软件计算细胞凋亡率。
1.3 统计学方法
数据采用SPSS17.0软件进行统计学分析，数据以（）表示，组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
3 讨论
热疗是近年兴起的一种新的肿瘤治疗方法，大量临床研究显示热疗对化疗或放疗有明显的增效作用，部分肿瘤患者热化疗后其完全缓解率可提高1倍左右。德国医学专家2009年的一项研究结果表明，在治疗癌症患者时使用热疗和化疗相结合的方法比单一接受化疗效果更好，无瘤期更长[4]。但是加热与化疗联合作用的具体机制尚未完全明确，加热本身会影响药物代谢动力学及肿瘤局部血流分布情况，并且不同加热温度及化疗剂量会对肿瘤细胞生长造成不同影响[5]。
目前研究认为热疗对肿瘤细胞的抑制作用与热疗稳定及作用时间有关，而化疗对肿瘤的抑制作用主要与药物剂量有关。对于某种特定的药物而言，热疗与化疗的协同作用主要体现在以下几个方面：（1）热疗能够肿瘤内部血流灌注，同时损害肿瘤细胞膜的稳定性，导致肿瘤内部血液内药物含量增加，同时由于细胞膜稳定性降低，药物更容易进入肿瘤细胞内，发挥杀灭作用[6]。（2）热疗能够改变肿瘤细胞外部环境，使外部pH降低，肿瘤细胞对化疗的敏感性增加，并且pH降低利于化疗药物对肿瘤细胞的直接损伤[7-8]；（3）对于部分热敏感性细胞，热疗能直接导致一部分肿瘤细胞DNA或RNA损伤。
阿霉素是一种抗肿瘤抗生素，可抑制RNA和DNA的合成，抗瘤谱较广，对多种肿瘤均有作用，属周期非特异性药物，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用；其主要机制是抑制肿瘤细胞DNA复制过程，导致细胞死亡或分裂停滞[9-14]。本研究结果显示单纯化疗或热疗对肝癌HHCC及HepG2细胞均有一定程度的抑制作用，但是加热化疗组HHCC及HepG2细胞增殖抑制率、凋亡率明显高于上述两组，说明热疗与化疗在抑制HHCC及HepG2细胞增殖方面有明显的协同作用。 综上所述，加热化疗可明显增强阿霉素对人肝癌细胞HHCC及HepG2的增殖抑制作用，对临床治疗有借鉴意义；但是如何选择最佳加热温度与化疗药物剂量的选择使患者受益最大还需要进一步研究。
[参考文献]
[1] 张洪新，刘燕，王执民，等.阿霉素加热化疗对抗人肝癌耐药细胞多药耐药性的实验研究[J].肿瘤防治研究，2001，28（3）：170-172.
[2] 仲飞，向美焕，杨静.阿霉素热化疗对肝癌细胞及其耐药株凋亡的影响与机制[J].实用癌症杂志，2006，21（6）：570-572，593.
[3] 刘宝瑞，杨觅.恶性肿瘤的热化疗与热靶化疗[J].实用临床医药杂志，2005，9（5）：1.
[4] 张蓓，刘志苏，孙权，等.全身性热化疗诱导肝癌细胞凋亡及其机制的探讨[J].临床外科杂志，2005，13（4）：226-227.
[5] 刘宝瑞，钱晓萍.肿瘤热化疗的基础与临床研究进展[J].国外医学（肿瘤学分册），2004，31（1）：34.
[6] 张力，龚明玉，李毅学，等.放疗联合热疗诱导肝癌HepG2细胞凋亡及其与Bcl-2和Bax蛋白表达关系的研究[J].中国全科医学，2011，14（6）：126.
[7] 魏红梅，郭坤元，梅家转，等.热化疗对Raji细胞体外增敏作用的实验研究[J].南方医科大学学报，2007，27（5）：709-711.
[8] 王倩荣，史正华，马骥，等.阿霉素热化疗对肝癌细胞增殖和凋亡的影响[J].现代肿瘤医学，2011，19（10）：1918-1922.
[9] 张洪新，郭卫平，王执民，等.阿霉素化疗与热化疗对人肝癌细胞耐药模型作用的比较[J].第四军医大学学报，2000，21（8）：964-967.
[10] 张显忠，郭爱军，廉立慧，等.PI3K/mTOR抑制剂BEZ235抑制HepG2细胞增殖及与阿霉素的协同效应[J].中国药理学通报，2012，28（2）：185-189.
[11] 王章桂，孙国平，徐淑萍，等.丹皮酚联合阿霉素对HepG2细胞株的增殖抑制作用[J].肿瘤防治研究，2008，35（6）：386-389.
[12] 史卫红，卞勇华，宋祥和，等.索拉菲尼联合阿霉素对人肝癌细胞株HepG2的抑制作用[J].现代生物医学进展，2011，11（24）：4845-4848
[13] 邓立力，吕慧芳，王文秀，等.阿霉素联合TRAIL对人肝癌细胞增殖与TRAIL受体表达的影响[J].临床肿瘤学杂志，2012，17（2）：102-106
[14] 蒋杰，宋春明，李建华，等.芦荟大黄素、阿霉素联合应用对肝癌HepG2细胞增殖的影响[J].湖北民族学院学报（医学版），2009，26（4）：17-19
（收稿日期：2014-03-30）
[关键词] 阿霉素；热化疗；人肝癌细胞；细胞增殖
[中图分类号] R735.7 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2014）12-11-03
原发性肝癌是我国常见的恶肿瘤之一，在恶性
肿瘤死亡顺位中占第2位，其致死率在城市人群中仅次于肺癌；农村人群中仅次于胃癌。但是原发性肝癌早期症状不明显，临床出现典型症状时大多处于晚期，且病情进展较快，治疗难度较大，术后容易复发，或丧失手术机会，患者短期内死亡[1]。因此提高肝癌尤其是晚期肝癌的药物治疗水平对改善患者病情，延长患者生存期有重要意义。热疗是近年兴起的一种新的肿瘤治疗方法，大量临床研究显示热疗对化疗或放疗有明显的增效作用，部分肿瘤患者热化疗后其完全缓解率可提高1倍左右[2]。本文研究加热化疗对人肝癌细胞HHCC及HepG2的抑制作用，为肝癌的临床治疗提供参考。
1 资料与方法
1.1 实验材料
肝癌HHCC及HepG2细胞由本院肿瘤实验室提供，采用含10%牛血清的培养液保存。阿霉素购自辉瑞制药有限公司，多孔细胞培养板购自上海研拓生物科技有限公司，电热恒温水浴箱购自苏州珀西瓦尔实验设备有限公司，Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 HHCC及HepG2细胞均采用含10%牛血清的DMEM培养液培养，取对数生长期细胞进行试验，用10%胎牛血清培养液配制成细胞密度5×104/mL的单细胞悬液，接种于50mL培养瓶中。根据相关文献研究显示阿霉素作用于HHCC细胞及HepG2细胞时24h IC50的药物浓度分别为7.0mg/L，2.0mg/L[3]，本文以此浓度为实验浓度。热化疗组及化疗组HHCC及HepG2细胞培养瓶中加入对应浓度的阿霉素，单纯热疗组培养瓶加入等量空白对照液；化疗组放入37℃，5%CO2培养箱中继续培养，而热化疗组及单纯热疗组放入电热恒温水浴箱进行加热，温度设定为43℃，上下浮动不超过0.1℃，加热时间为60min，加热后继续放入培养箱中培养24h。
1.2.2 细胞增殖抑制率测定（MTT法） 取常规对数生长期细胞（对照组）及经过上述处理的细胞（实验组），制成单细胞悬液，调整细胞密度为2.5×105/mL，接种于96孔培养板中，每孔200μL，每孔加入MTT 20μL，继续培养4h后取出培养板，弃MTT液，每孔加入DMSO 150μL，微量震荡后，将培养板置于全自动酶标仪，测定每孔OD值，以（对照组OD值-实验组OD值）/对照组OD值测定细胞增殖抑制率。
1.2.3 细胞凋亡率测定 各组细胞经处理后，取样，配置细胞悬液，细胞密度5×105/mL，取1mL，采用PBS溶液洗涤2次后加入Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂，避光保存1h后，采用流式细胞仪检测细胞数，以Cell quest软件计算细胞凋亡率。
1.3 统计学方法
数据采用SPSS17.0软件进行统计学分析，数据以（）表示，组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
3 讨论
热疗是近年兴起的一种新的肿瘤治疗方法，大量临床研究显示热疗对化疗或放疗有明显的增效作用，部分肿瘤患者热化疗后其完全缓解率可提高1倍左右。德国医学专家2009年的一项研究结果表明，在治疗癌症患者时使用热疗和化疗相结合的方法比单一接受化疗效果更好，无瘤期更长[4]。但是加热与化疗联合作用的具体机制尚未完全明确，加热本身会影响药物代谢动力学及肿瘤局部血流分布情况，并且不同加热温度及化疗剂量会对肿瘤细胞生长造成不同影响[5]。
目前研究认为热疗对肿瘤细胞的抑制作用与热疗稳定及作用时间有关，而化疗对肿瘤的抑制作用主要与药物剂量有关。对于某种特定的药物而言，热疗与化疗的协同作用主要体现在以下几个方面：（1）热疗能够肿瘤内部血流灌注，同时损害肿瘤细胞膜的稳定性，导致肿瘤内部血液内药物含量增加，同时由于细胞膜稳定性降低，药物更容易进入肿瘤细胞内，发挥杀灭作用[6]。（2）热疗能够改变肿瘤细胞外部环境，使外部pH降低，肿瘤细胞对化疗的敏感性增加，并且pH降低利于化疗药物对肿瘤细胞的直接损伤[7-8]；（3）对于部分热敏感性细胞，热疗能直接导致一部分肿瘤细胞DNA或RNA损伤。
阿霉素是一种抗肿瘤抗生素，可抑制RNA和DNA的合成，抗瘤谱较广，对多种肿瘤均有作用，属周期非特异性药物，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用；其主要机制是抑制肿瘤细胞DNA复制过程，导致细胞死亡或分裂停滞[9-14]。本研究结果显示单纯化疗或热疗对肝癌HHCC及HepG2细胞均有一定程度的抑制作用，但是加热化疗组HHCC及HepG2细胞增殖抑制率、凋亡率明显高于上述两组，说明热疗与化疗在抑制HHCC及HepG2细胞增殖方面有明显的协同作用。 综上所述，加热化疗可明显增强阿霉素对人肝癌细胞HHCC及HepG2的增殖抑制作用，对临床治疗有借鉴意义；但是如何选择最佳加热温度与化疗药物剂量的选择使患者受益最大还需要进一步研究。
[参考文献]
[1] 张洪新，刘燕，王执民，等.阿霉素加热化疗对抗人肝癌耐药细胞多药耐药性的实验研究[J].肿瘤防治研究，2001，28（3）：170-172.
[2] 仲飞，向美焕，杨静.阿霉素热化疗对肝癌细胞及其耐药株凋亡的影响与机制[J].实用癌症杂志，2006，21（6）：570-572，593.
[3] 刘宝瑞，杨觅.恶性肿瘤的热化疗与热靶化疗[J].实用临床医药杂志，2005，9（5）：1.
[4] 张蓓，刘志苏，孙权，等.全身性热化疗诱导肝癌细胞凋亡及其机制的探讨[J].临床外科杂志，2005，13（4）：226-227.
[5] 刘宝瑞，钱晓萍.肿瘤热化疗的基础与临床研究进展[J].国外医学（肿瘤学分册），2004，31（1）：34.
[6] 张力，龚明玉，李毅学，等.放疗联合热疗诱导肝癌HepG2细胞凋亡及其与Bcl-2和Bax蛋白表达关系的研究[J].中国全科医学，2011，14（6）：126.
[7] 魏红梅，郭坤元，梅家转，等.热化疗对Raji细胞体外增敏作用的实验研究[J].南方医科大学学报，2007，27（5）：709-711.
[8] 王倩荣，史正华，马骥，等.阿霉素热化疗对肝癌细胞增殖和凋亡的影响[J].现代肿瘤医学，2011，19（10）：1918-1922.
[9] 张洪新，郭卫平，王执民，等.阿霉素化疗与热化疗对人肝癌细胞耐药模型作用的比较[J].第四军医大学学报，2000，21（8）：964-967.
[10] 张显忠，郭爱军，廉立慧，等.PI3K/mTOR抑制剂BEZ235抑制HepG2细胞增殖及与阿霉素的协同效应[J].中国药理学通报，2012，28（2）：185-189.
[11] 王章桂，孙国平，徐淑萍，等.丹皮酚联合阿霉素对HepG2细胞株的增殖抑制作用[J].肿瘤防治研究，2008，35（6）：386-389.
[12] 史卫红，卞勇华，宋祥和，等.索拉菲尼联合阿霉素对人肝癌细胞株HepG2的抑制作用[J].现代生物医学进展，2011，11（24）：4845-4848
[13] 邓立力，吕慧芳，王文秀，等.阿霉素联合TRAIL对人肝癌细胞增殖与TRAIL受体表达的影响[J].临床肿瘤学杂志，2012，17（2）：102-106
[14] 蒋杰，宋春明，李建华，等.芦荟大黄素、阿霉素联合应用对肝癌HepG2细胞增殖的影响[J].湖北民族学院学报（医学版），2009，26（4）：17-19
（收稿日期：2014-03-30）