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【摘要】目的:研究低氧时小鼠肺组织中C-myc癌基因及血管内皮生长因子(VEGF)表达的变化,探讨低氧时C-myc癌基因与血管新生的关系。方法将雄性昆明小鼠98只,分为低氧组与对照组,低氧仓浓度分别为10%,7%和5%。低氧时间分别为3天,6天和9天。用免疫组织化学技术检测小鼠在低氧条件下肺组织中的C-myc癌基因和VEGF蛋白表达的变化及微血管密度(MVD)。 结果低氧组C-myc癌基因和VEGF蛋白表达均增加,并且随低氧时间的延长及低氧浓度的降低而增强,而对照组C-myc和VEGF有少量表达(P<0. 05);低氧组的MVD也高于对照组;VEGF、MVD的表达均与C-myc癌基因表达呈正相关(r分别为0.730与0.691)。结论低氧可引起小鼠肺组织C-myc癌基因与VEGF蛋白表达增强,C-myc癌基因的激活参与了低氧致小鼠肺组织血管新生的过程。
【关键词】血管生成;低氧; C-myc;VEGF
【中图分类号】R645【文献标识码】B【文章编号】1005-0515(2010)009-0126-02
目前认为,血管内皮生长因子(VEGF)是肿瘤诱导产生新生血管的最主要的细胞因子之一。已经表明,低氧能有效刺激VEGF的表达,HIF-1在其中起关键作用,然而,Mizukami.Y等研究发现,当HIF-1被抑制时,低氧仍能引起VEGF的过表达。这表明有不依赖HIF-1的其他调节途径诱导VEGF的增加[1]。近来,研究者发现癌基因C-myc也是血管生成的重要调节者。本实验通过观察小鼠在低氧条件下肺组织中的C-myc癌基因和VEGF蛋白表达的变化, 并用血管内皮细胞的特异性标记CD34抗体标记MVD,进一步探讨低氧与血管新生的关系及C-myc癌基因对血管生成的调节作用。
1 材料与方法
1.1 材料:选用雄性昆明小鼠98只,体重18-25g,抽出56只随机分为4组:10%低氧组、7%低氧组、5%低氧组和对照组各14只;另外42只随机分为3组:10%低氧3天组、10%低氧6天组、10%低氧9天组各14只;鼠抗鼠VEGF、C-myc、CD34单克隆抗体均购于美国Santa Cruze公司;PowerVision免疫组化检测试剂及SP试剂盒购于北京中衫金桥生物技术有限公司。
1.2常压低氧模型:用有机玻璃制成3个低氧仓,体积均为40cm×40cm×40cm,有机玻璃厚4mm,三氯甲烷封其侧面,石蜡封底面,仓体上面开一直径为1cm的出气孔,侧面开一直径为1cm的进气孔,进气孔通过三通管分别接氮气和压缩空气,用减压器调节气体压力,用玻璃转子流量计控制流量,用测氧仪监测仓内氧浓度,用数字湿度仪监测仓内湿度,仓内温度控制在22～28℃,湿度控制在50%～60%。
1.3 方法。
1.3.1 实验条件的设置和实验动物的处理:3个低氧仓保持仓内氧浓度分别为10%(N2及O2各为110ml/min)、7%(N2为140 ml/min,O2为70ml/min);5%(N2为170ml/min,O2为55ml/min)。按低氧浓度不同分成的4组小鼠均在第4天取出处死;按处理时间不同分成的3组小鼠分别在第4天、第7天、第10天取出处死。仓内的小鼠取出后,立即10%乌拉坦(7ml/kg)麻醉,进行取材。
1.3.2 免疫组织化学实验步骤:按两步法试剂盒说明书。C-myc、VEGF单克隆抗体的工作浓度均为1∶100。CD34一抗的工作浓度为1∶50。
1.4 结果判定:C-myc和VEGF表达的判断根据阳性细胞所占比例及着色强度综合制定免疫组化半定量记分标准为:<1%,0分;1%～10%,1分;11%～50%,2分;51%～80%,3分;>80%,4分。着色强度计分:弱,1分;中,2分;强,3分。两个分值相加为最终判定结果:1分(-); 2～3分(+);4～5分(++);6～7分(+++)。任何被CD34抗体染成棕黄色孤立的内皮细胞或内皮细胞簇团,只要与邻近微血管、肿瘤细胞或其他结缔组织分开,就将其作为一个微血管;只要结构不相连,其分支结构也视为一血管。微血管密度(MVD)计数参照Weidner[2]报道的方法,以X±s表示。
1.5 统计学分析:采用SPSS13.0统计软件对所得数据进行χ2检验、t检验和Spearman等级相关分析。P<0.05定为差异有显著性。
2 结果
2.1 低氧浓度与C-myc、VEGF的表达的关系:C-myc抗原阳性染色位于细胞核, VEGF阳性信号主要位于细胞质,血管内皮细胞也可见表达。对照组 C-myc和VEGF有少量表达,而低氧组C-myc和VEGF蛋白表达均增加,并且在10%、7%、5%低氧浓度下随低氧浓度的降低而表达增强,P<0.05。如表1所示。
2.2 低氧时间与C-myc、VEGF的表达的关系:如表2所示,在10%低氧浓度下, C-myc、VEGF在低氧3天、6天、9天时的表达呈现递增趋势,随低氧时间的延长而表达增强,P<0.05,有统计学意义。
2.3 低氧与微血管密度(MVD)的关系:MVD对照组为11.83±3.88,10%低氧组为17.67±3.52,7%低氧组为21.39±3.18,5%低氧组为28.66±4.24,低氧组的MVD高于对照组,并且随着氧浓度的降低MVD的值升高,各组间比较P<0.05,有统计学意义。
2.4 C-myc与VEGF、MVD的关系:Spearman等级相关分析结果显示, 10%低氧浓度下小鼠肺组织中的C-myc蛋白的表达与VEGF、MVD表达之间呈显著正相关(分别为r=0.730,P=0.007和r=0.691,P=0.037)。
3 讨论
研究发现,低氧状态诱导一系列特异性的与血管新生、能量代谢、肿瘤转移等密切相关的基因,帮助自身调节和适应缺氧微环境。血管内皮生长因子(vascular endothelial cell growth factor ,VEGF)是最关键的血管生长促进因子,在肿瘤的血管新生中起着重要作用,其基因表达受多种细胞因子、癌基因、抑癌基因产物及缺氧等因素的调控[3]。VEGF在促进血管内皮细胞增殖和增加血管通透性方面的作用恰是肿瘤血管新生所必须的。本研究结果显示:低氧条件下VEGF蛋白表达增加,并且随低氧时间的延长及低氧浓度的降低而增强,表明低氧是VEGF表达的有力刺激因素。
C-myc是原癌基因myc家族中的一员,其蛋白产物是细胞增殖、静止、分化、凋亡的中心调节因子。组织细胞的缺血、缺氧损伤可诱导C-myc的表达[4]。各种刺激肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖的因素如缺氧、机械张力、生长因子等通过细胞内信息传导的共同通路诱导C-myc的快速短暂转录和表达,促进与DNA相关蛋白的合成及PASMC的增殖。本实验对缺氧小鼠肺组织内C-myc蛋白的研究表明,在正常氧浓度时C-myc有少量表达,随氧浓度的降低和缺氧时间的延长,该蛋白表达有增多的趋势,并且随着氧浓度的降低MVD的值也升高。
近年来,研究者发现C-myc活化时不仅在细胞的增生与生长方面发挥重要作用,而且还是血管生成的重要调节者。Baudino等[5]发现,C-myc-/-的胚胎干细胞和卵黄囊内皮细胞VEGF表达减少,C-myc-/-的胚胎有明显的血管生成障碍,并且C-myc的肿瘤细胞移植到SCID鼠后,形成的肿瘤明显减小。此外,C-myc-/-的小鼠的表型与VEGF或其受体Flk-1缺失的小鼠相似,并且加入VEGF能恢复C-myc-/-的卵黄囊内皮细胞的生长缺陷。Pelengaris等[6]发现C-myc活化的转化细胞在恶变成癌时,能更早的形成血管及发生转移。刘智敏等[7]观察了30例胆囊癌的标本,发现C-myc表达者VEGF均表达,VEGF表达与C-myc的表达呈非常显著的相关性。Ulrike等[8]也报道缺氧时C-myc可通过VEGF途径引起血管生成,在活体组织,单独激活C-myc能引起VEGF蛋白的释放,联合低氧环境,C-myc的激活进一步增加了VEGF的蛋白水平。Liu等[9]的研究最早表明缺氧导致肿瘤高表达VEGF主要是通过HIF-1的调节。然而,已有研究表明,当HIF-1a沉默时,仍存在低氧诱导的VEGF的表达。Mizukami Y等研究发现在人类结肠癌中,由低氧诱导VEGF表达的另一种机制,即不依赖HIF-1a而需要PI3K/Rho/ROCK和C-myc的激活。
在本研究结果中,C-myc与VEGF、MVD之间均呈显著正相关,这与以上报道结果一致,表明C-myc癌基因对低氧致小鼠肺组织血管新生中的重要作用。随着分子生物学技术的发展,人们已经认识到C-myc癌基因在肿瘤血管新生中所起的重要作用,相信随着这方面研究的不断深入,在不远的将来,以缺氧和C-myc为靶点的抗肿瘤治疗必将有更大的突破。
参考文献
[1]Mizukami Y, Fujiki K,Hypoxic regulation of vascular endothelial growth factor through the induction of phosphatidylinositol 3-kinase/Rho/ROCK and c-Myc. J Biol Chem. 2006 May 19;281(20):13957-63
[2] Weidner N. Intratumoral microvessel densityasa prognosic factor incancer [J]. AmJ Pathol , 1995,147(1):9-19
[3] NeufeldJ,CohenT,GengrinovitchS,etal.Vascular endothe lia growth factor and its receptors [J].FASEBJ,1999,13(1):9-22
[4]陶清国,张珍样.肺血管结构改建,平滑肌细胞增生与原癌基因 [J].国外医学呼吸系统分册.1997.17(1):22-24
[5] Baudino TA, McKay C, Pendeville-Samain H,et al. c-Myc is essential for vasculogenesis and angiogenesis during development and tumor progression. Genes Dev. 2002 Oct 1;16(19):2530-43
[6] Pelengaris S, Khan M, Evan GI.Suppression of Myc-induced apoptosis in beta cells exposes multiple oncogenic properties of Myc and triggers carcinogenic progression. Cell. 2002 May 3;109(3):321-34
[7] 刘智敏,严律南,赵永恒等.胆管癌组织中VEGF和c-myc的表达及其意义[J].中国普外基础与临床杂志.2004.2:139-141
[8] Ulrike E, Knies-Bamforth, Stephen B. Fox, et al. c-Myc Interacts with Hypoxia to Induce Angiogenesis In vivo by a Vascular Endothelial Growth Factor-Dependent MechanismCancer Research 64, 6563-6570, September 15, 2004
[9] LiuY,CoxSR,MoritaT,etal.Hypoxiaregulatesvascularendothelialgrowthfactorgeneexpressioninendothelialcells:i dentificationofa5 enhancer[J].CircRes,1995,77(3):638-643
【关键词】血管生成;低氧; C-myc;VEGF
【中图分类号】R645【文献标识码】B【文章编号】1005-0515(2010)009-0126-02
目前认为,血管内皮生长因子(VEGF)是肿瘤诱导产生新生血管的最主要的细胞因子之一。已经表明,低氧能有效刺激VEGF的表达,HIF-1在其中起关键作用,然而,Mizukami.Y等研究发现,当HIF-1被抑制时,低氧仍能引起VEGF的过表达。这表明有不依赖HIF-1的其他调节途径诱导VEGF的增加[1]。近来,研究者发现癌基因C-myc也是血管生成的重要调节者。本实验通过观察小鼠在低氧条件下肺组织中的C-myc癌基因和VEGF蛋白表达的变化, 并用血管内皮细胞的特异性标记CD34抗体标记MVD,进一步探讨低氧与血管新生的关系及C-myc癌基因对血管生成的调节作用。
1 材料与方法
1.1 材料:选用雄性昆明小鼠98只,体重18-25g,抽出56只随机分为4组:10%低氧组、7%低氧组、5%低氧组和对照组各14只;另外42只随机分为3组:10%低氧3天组、10%低氧6天组、10%低氧9天组各14只;鼠抗鼠VEGF、C-myc、CD34单克隆抗体均购于美国Santa Cruze公司;PowerVision免疫组化检测试剂及SP试剂盒购于北京中衫金桥生物技术有限公司。
1.2常压低氧模型:用有机玻璃制成3个低氧仓,体积均为40cm×40cm×40cm,有机玻璃厚4mm,三氯甲烷封其侧面,石蜡封底面,仓体上面开一直径为1cm的出气孔,侧面开一直径为1cm的进气孔,进气孔通过三通管分别接氮气和压缩空气,用减压器调节气体压力,用玻璃转子流量计控制流量,用测氧仪监测仓内氧浓度,用数字湿度仪监测仓内湿度,仓内温度控制在22～28℃,湿度控制在50%～60%。
1.3 方法。
1.3.1 实验条件的设置和实验动物的处理:3个低氧仓保持仓内氧浓度分别为10%(N2及O2各为110ml/min)、7%(N2为140 ml/min,O2为70ml/min);5%(N2为170ml/min,O2为55ml/min)。按低氧浓度不同分成的4组小鼠均在第4天取出处死;按处理时间不同分成的3组小鼠分别在第4天、第7天、第10天取出处死。仓内的小鼠取出后,立即10%乌拉坦(7ml/kg)麻醉,进行取材。
1.3.2 免疫组织化学实验步骤:按两步法试剂盒说明书。C-myc、VEGF单克隆抗体的工作浓度均为1∶100。CD34一抗的工作浓度为1∶50。
1.4 结果判定:C-myc和VEGF表达的判断根据阳性细胞所占比例及着色强度综合制定免疫组化半定量记分标准为:<1%,0分;1%～10%,1分;11%～50%,2分;51%～80%,3分;>80%,4分。着色强度计分:弱,1分;中,2分;强,3分。两个分值相加为最终判定结果:1分(-); 2～3分(+);4～5分(++);6～7分(+++)。任何被CD34抗体染成棕黄色孤立的内皮细胞或内皮细胞簇团,只要与邻近微血管、肿瘤细胞或其他结缔组织分开,就将其作为一个微血管;只要结构不相连,其分支结构也视为一血管。微血管密度(MVD)计数参照Weidner[2]报道的方法,以X±s表示。
1.5 统计学分析:采用SPSS13.0统计软件对所得数据进行χ2检验、t检验和Spearman等级相关分析。P<0.05定为差异有显著性。
2 结果
2.1 低氧浓度与C-myc、VEGF的表达的关系:C-myc抗原阳性染色位于细胞核, VEGF阳性信号主要位于细胞质,血管内皮细胞也可见表达。对照组 C-myc和VEGF有少量表达,而低氧组C-myc和VEGF蛋白表达均增加,并且在10%、7%、5%低氧浓度下随低氧浓度的降低而表达增强,P<0.05。如表1所示。
2.2 低氧时间与C-myc、VEGF的表达的关系:如表2所示,在10%低氧浓度下, C-myc、VEGF在低氧3天、6天、9天时的表达呈现递增趋势,随低氧时间的延长而表达增强,P<0.05,有统计学意义。
2.3 低氧与微血管密度(MVD)的关系:MVD对照组为11.83±3.88,10%低氧组为17.67±3.52,7%低氧组为21.39±3.18,5%低氧组为28.66±4.24,低氧组的MVD高于对照组,并且随着氧浓度的降低MVD的值升高,各组间比较P<0.05,有统计学意义。
2.4 C-myc与VEGF、MVD的关系:Spearman等级相关分析结果显示, 10%低氧浓度下小鼠肺组织中的C-myc蛋白的表达与VEGF、MVD表达之间呈显著正相关(分别为r=0.730,P=0.007和r=0.691,P=0.037)。
3 讨论
研究发现,低氧状态诱导一系列特异性的与血管新生、能量代谢、肿瘤转移等密切相关的基因,帮助自身调节和适应缺氧微环境。血管内皮生长因子(vascular endothelial cell growth factor ,VEGF)是最关键的血管生长促进因子,在肿瘤的血管新生中起着重要作用,其基因表达受多种细胞因子、癌基因、抑癌基因产物及缺氧等因素的调控[3]。VEGF在促进血管内皮细胞增殖和增加血管通透性方面的作用恰是肿瘤血管新生所必须的。本研究结果显示:低氧条件下VEGF蛋白表达增加,并且随低氧时间的延长及低氧浓度的降低而增强,表明低氧是VEGF表达的有力刺激因素。
C-myc是原癌基因myc家族中的一员,其蛋白产物是细胞增殖、静止、分化、凋亡的中心调节因子。组织细胞的缺血、缺氧损伤可诱导C-myc的表达[4]。各种刺激肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖的因素如缺氧、机械张力、生长因子等通过细胞内信息传导的共同通路诱导C-myc的快速短暂转录和表达,促进与DNA相关蛋白的合成及PASMC的增殖。本实验对缺氧小鼠肺组织内C-myc蛋白的研究表明,在正常氧浓度时C-myc有少量表达,随氧浓度的降低和缺氧时间的延长,该蛋白表达有增多的趋势,并且随着氧浓度的降低MVD的值也升高。
近年来,研究者发现C-myc活化时不仅在细胞的增生与生长方面发挥重要作用,而且还是血管生成的重要调节者。Baudino等[5]发现,C-myc-/-的胚胎干细胞和卵黄囊内皮细胞VEGF表达减少,C-myc-/-的胚胎有明显的血管生成障碍,并且C-myc的肿瘤细胞移植到SCID鼠后,形成的肿瘤明显减小。此外,C-myc-/-的小鼠的表型与VEGF或其受体Flk-1缺失的小鼠相似,并且加入VEGF能恢复C-myc-/-的卵黄囊内皮细胞的生长缺陷。Pelengaris等[6]发现C-myc活化的转化细胞在恶变成癌时,能更早的形成血管及发生转移。刘智敏等[7]观察了30例胆囊癌的标本,发现C-myc表达者VEGF均表达,VEGF表达与C-myc的表达呈非常显著的相关性。Ulrike等[8]也报道缺氧时C-myc可通过VEGF途径引起血管生成,在活体组织,单独激活C-myc能引起VEGF蛋白的释放,联合低氧环境,C-myc的激活进一步增加了VEGF的蛋白水平。Liu等[9]的研究最早表明缺氧导致肿瘤高表达VEGF主要是通过HIF-1的调节。然而,已有研究表明,当HIF-1a沉默时,仍存在低氧诱导的VEGF的表达。Mizukami Y等研究发现在人类结肠癌中,由低氧诱导VEGF表达的另一种机制,即不依赖HIF-1a而需要PI3K/Rho/ROCK和C-myc的激活。
在本研究结果中,C-myc与VEGF、MVD之间均呈显著正相关,这与以上报道结果一致,表明C-myc癌基因对低氧致小鼠肺组织血管新生中的重要作用。随着分子生物学技术的发展,人们已经认识到C-myc癌基因在肿瘤血管新生中所起的重要作用,相信随着这方面研究的不断深入,在不远的将来,以缺氧和C-myc为靶点的抗肿瘤治疗必将有更大的突破。
参考文献
[1]Mizukami Y, Fujiki K,Hypoxic regulation of vascular endothelial growth factor through the induction of phosphatidylinositol 3-kinase/Rho/ROCK and c-Myc. J Biol Chem. 2006 May 19;281(20):13957-63
[2] Weidner N. Intratumoral microvessel densityasa prognosic factor incancer [J]. AmJ Pathol , 1995,147(1):9-19
[3] NeufeldJ,CohenT,GengrinovitchS,etal.Vascular endothe lia growth factor and its receptors [J].FASEBJ,1999,13(1):9-22
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[6] Pelengaris S, Khan M, Evan GI.Suppression of Myc-induced apoptosis in beta cells exposes multiple oncogenic properties of Myc and triggers carcinogenic progression. Cell. 2002 May 3;109(3):321-34
[7] 刘智敏,严律南,赵永恒等.胆管癌组织中VEGF和c-myc的表达及其意义[J].中国普外基础与临床杂志.2004.2:139-141
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[9] LiuY,CoxSR,MoritaT,etal.Hypoxiaregulatesvascularendothelialgrowthfactorgeneexpressioninendothelialcells:i dentificationofa5 enhancer[J].CircRes,1995,77(3):638-643