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摘 要：利用谷子基因组序列开发出SSR引物205对，其中171对可以稳定扩增出目的条带，149对有多态性。利用30个多态性SSR标记对41份谷子种质资源进行遗传多样性分析，共检测出291个等位变异，平均每个位点9.7个。谷子地方品种基因多样性指数平均为0.7907，育成品种基因多样性指数平均为0.7571。对41个谷子品种进行聚类，在遗传相似系数为0.164时聚为6组，与生态型基本一致。
关键词：谷子；SSR标记；遗传多样性；聚类分析
中图分类号：S515.032文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）03-0033-07
谷子[Setaria italica （L.） Beauv.]起源于我国，是世界上最古老的粮食作物之一[1]。谷子具有耐旱、耐盐、耐瘠薄、高光合作用效率等特性，在我国北方旱作农业和食品消费多元化需求方面占有重要地位。谷子是二倍体自花授粉作物， 基因组较小，约490 Mb，与水稻基因组结构存在明显的共线性，是进行基因组研究的理想作物[2]。近年来，基于DNA序列所开发的RFLP、RAPD、AFLP等分子标记的发展为谷子的遗传研究提供了有力工具[3～5]。SSR标记具有分析简便、重复性好、多态性高等优点，是谷子遗传多样性、品种鉴定和QTL定位等研究的有效标记[6]。然而现有的谷子SSR标记数量少，不能满足谷子多方面研究的需要，大量开发覆盖全基因组的SSR标记仍是目前谷子研究的重要工作之一。本研究通过对谷子基因组序列进行SSR位点的搜索，开发出一批SSR标记，对一批不同生态类型的谷子种质资源进行了初步的遗传多样性研究。
1 材料与方法
1.1 供试材料
从谷子核心种质材料中选取41份有代表性的地方品种和育成品种，共涉及东北平原、华北平原、淮河以南、黄土高原、内蒙古高原及西北内陆6个生态区（表1）。将这些材料发芽培养，两叶一心期时，采用CTAB法[7]提取DNA。
1.2 SSR标记开发
从数据库Phytozome下载谷子基因组序列，利用SSRHunter 1.3软件[8]进行SSR位点的搜索，设置重复次数至少为5、构成重复基元的核苷酸数最多是6个。选取重复次数在20以上或者重复碱基数在40个以上的SSR位点，利用重复序列两端的保守侧翼序列，用Primer 5.0设计引物。引物设计的条件是：PCR产物长度为100～350 bp；退火温度（Tm）为50～70℃，保证两引物间Tm值相差不超过4℃；GC（%）含量为40%～65%；引物长度为18～28 bp。为了保证引物的特异性，用于设计引物的保守侧翼序列与微卫星位点至少间隔20～30个碱基。引物设计后由上海生工生物工程有限公司合成。
1.3 PCR扩增及等位变异检测
PCR体系（12.5 μl）包括10×Taq Buffer 1.25 μl，25 mmol/L Mg2+0.75 μl，10 mmol/L dNTP0.3125 μl，上下游引物（5 μmol/L）各1μl，0.5单位Taq酶和DNA模板20～50 ng。PCR程序为：94℃预变性4 min；94℃ 45 s，退火温度45 s，72℃ 45 s，共35个循环；72℃延伸10 min；4℃保存。扩增产物采用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。
1.4 遗传结构和遗传多样性分析
根据DNA分子量标准和引物的迁移率记录结果，迁移率最大（分子量最小）的条带记为1，迁移率次之的记为2，依次类推，无条带记为0，建立供试材料SSR基因型信息数据库。利用PowerMarker V 3.25[9]计算引物的等位基因数（Na）、基因多样性指数（He）。利用NTSYSpc V 2.10e[10]计算品种间的遗传相似系数，用UPGMA法进行聚类分析，绘制树状图。
2 结果与分析
2.1 引物开发
利用Phytozome数据库提供的谷子基因组序列，共设计出205对引物，其中171对引物能够扩增出稳定的目的条带，149对引物表现出多态性。
2.2 遗传多样性分析
选取均匀分布在谷子基因组中的30个多态性标记，对41份谷子种质资源进行分析。30对引物共检测到291个等位变异，每个位点检测出的等位变异数为4～16个，平均每个位点9.7个。其中，地方品种和育成品种检测到的等位变异数分别为8.5和6.5个。地方品种基因多样性指数为0.5728～0.8926，平均为0.7907，育成品种基因多样性指数为0.5455～0.8750，平均为0.7571，谷子地方品种遗传多样性高于育成品种（表2）。分析各生态区资源的遗传多样性，发现东北平原品种基因多样性指数最高，其次是华北平原，淮河以南的最低（表3）。图1为引物S226在41份谷子品种中检测到的多态性。
2.3 谷子品种聚类分析
利用NTSYS软件计算出的41份谷子品种间遗传相似系数（GS）值变动于0.0328～0.5614之间。其中来自辽宁的红苗老来变和山东的鲁谷5号、河南的绳头黄谷和张家口的坝低1之间的遗传相似系数最小，为0.0328，表明它们之间的亲缘关系最远；来自河北的冀谷20和山东的鲁谷5号之间的遗传相似系数最大，为0.5614，说明其亲缘关系最近。
对41个谷子品种进行聚类分析（图2），当遗传相似系数为0.14时，所有品种可以聚成两大
组。第一组主要是来自黄土高原、西北内陆和内蒙高原的材料，第二组主要是来自华北平原和东北平原的材料。当遗传相似系数为0.164时，所有品种可以分成六组：第一组包括黑龙江的老来变和黑谷2号，甘肃的永昌小白谷；第二组包括11个材料，分别是吉林的鸭子嘴、长扩1，河北的鸭子嘴，雁北的早二白谷，张家口的二黄米，山西的腰谷、爬坡糙，陕西的老来变，宁夏的狼尾巴，青海的黄袍谷，新疆的吐鲁番谷子，代表了内蒙高原、黄土高原和西北内陆生态区。第三组是四份育成品种，分别是嫩选15、坝低1、陇谷5号和大凉州谷。第四组是山西的红杆谷、内蒙古的金香玉以及3份育成品种。第五组包括17份材料，其中7份来源于华北平原，3份来源于东北平原，2份来源于淮河以南。第六组为河北的黑谷。聚类分析表明，来自同一生态区的谷子品种基本聚合在一起。
图2 41份谷子种质资源的聚类分析
3 讨论 Jia等（2009）[11]用（GA）n和（CA）n两个富集文库开发出269对谷子SSR引物。Li等（2008）[12]建立了 （AC）15、（AT）15、（AG）12、（TG）12和（TC）12 5个微卫星文库，设计了393对引物。Jia等（2007）[6]从1 213条EST序列中搜索到30个SSR位点，设计出26对引物。本研究直接利用谷子基因组序列开发的SSR引物，可以更全面地反映谷子DNA水平上的遗传变异。与EST-SSR相比，基因组SSR 引物多态率高，等位变异丰富，可以有效应用于谷子品种鉴定和遗传多样性研究。
本研究用30个多态性SSR标记在41份谷子初级核心种质中检测到291个等位变异，每个位点4～16个，平均9.7个，每个位点的基因多样性指数在0.6151～0.8977之间，平均为0.8074，表明本研究开发的引物能够揭示丰富的等位基因变异。此结果与Ma等（2007）[13]的研究结果不一致，与Wang等（2012）[14]的研究结果相似，原因可能是本研究利用的是谷子初级核心种质，选材更具代表性，因此可以全面反映谷子种质资源的多样性。地方品种和育成品种检测到的等位变异数分别为8.5个和6.5个，地方品种基因多样性指数为0.5728～0.8926，平均为0.7907，育成品种基因多样性指数为0.5455～0.8750，平均为0.7571，谷子地方品种遗传多样性高于育成品种。利用NTSYS计算41份谷子品种间的遗传相似系数，并进行聚类分析，多数材料遗传相似系数较小，表明我国有丰富的谷子资源类型，有很高的育种潜力。
关键词：谷子；SSR标记；遗传多样性；聚类分析
中图分类号：S515.032文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）03-0033-07
谷子[Setaria italica （L.） Beauv.]起源于我国，是世界上最古老的粮食作物之一[1]。谷子具有耐旱、耐盐、耐瘠薄、高光合作用效率等特性，在我国北方旱作农业和食品消费多元化需求方面占有重要地位。谷子是二倍体自花授粉作物， 基因组较小，约490 Mb，与水稻基因组结构存在明显的共线性，是进行基因组研究的理想作物[2]。近年来，基于DNA序列所开发的RFLP、RAPD、AFLP等分子标记的发展为谷子的遗传研究提供了有力工具[3～5]。SSR标记具有分析简便、重复性好、多态性高等优点，是谷子遗传多样性、品种鉴定和QTL定位等研究的有效标记[6]。然而现有的谷子SSR标记数量少，不能满足谷子多方面研究的需要，大量开发覆盖全基因组的SSR标记仍是目前谷子研究的重要工作之一。本研究通过对谷子基因组序列进行SSR位点的搜索，开发出一批SSR标记，对一批不同生态类型的谷子种质资源进行了初步的遗传多样性研究。
1 材料与方法
1.1 供试材料
从谷子核心种质材料中选取41份有代表性的地方品种和育成品种，共涉及东北平原、华北平原、淮河以南、黄土高原、内蒙古高原及西北内陆6个生态区（表1）。将这些材料发芽培养，两叶一心期时，采用CTAB法[7]提取DNA。
1.2 SSR标记开发
从数据库Phytozome下载谷子基因组序列，利用SSRHunter 1.3软件[8]进行SSR位点的搜索，设置重复次数至少为5、构成重复基元的核苷酸数最多是6个。选取重复次数在20以上或者重复碱基数在40个以上的SSR位点，利用重复序列两端的保守侧翼序列，用Primer 5.0设计引物。引物设计的条件是：PCR产物长度为100～350 bp；退火温度（Tm）为50～70℃，保证两引物间Tm值相差不超过4℃；GC（%）含量为40%～65%；引物长度为18～28 bp。为了保证引物的特异性，用于设计引物的保守侧翼序列与微卫星位点至少间隔20～30个碱基。引物设计后由上海生工生物工程有限公司合成。
1.3 PCR扩增及等位变异检测
PCR体系（12.5 μl）包括10×Taq Buffer 1.25 μl，25 mmol/L Mg2+0.75 μl，10 mmol/L dNTP0.3125 μl，上下游引物（5 μmol/L）各1μl，0.5单位Taq酶和DNA模板20～50 ng。PCR程序为：94℃预变性4 min；94℃ 45 s，退火温度45 s，72℃ 45 s，共35个循环；72℃延伸10 min；4℃保存。扩增产物采用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。
1.4 遗传结构和遗传多样性分析
根据DNA分子量标准和引物的迁移率记录结果，迁移率最大（分子量最小）的条带记为1，迁移率次之的记为2，依次类推，无条带记为0，建立供试材料SSR基因型信息数据库。利用PowerMarker V 3.25[9]计算引物的等位基因数（Na）、基因多样性指数（He）。利用NTSYSpc V 2.10e[10]计算品种间的遗传相似系数，用UPGMA法进行聚类分析，绘制树状图。
2 结果与分析
2.1 引物开发
利用Phytozome数据库提供的谷子基因组序列，共设计出205对引物，其中171对引物能够扩增出稳定的目的条带，149对引物表现出多态性。
2.2 遗传多样性分析
选取均匀分布在谷子基因组中的30个多态性标记，对41份谷子种质资源进行分析。30对引物共检测到291个等位变异，每个位点检测出的等位变异数为4～16个，平均每个位点9.7个。其中，地方品种和育成品种检测到的等位变异数分别为8.5和6.5个。地方品种基因多样性指数为0.5728～0.8926，平均为0.7907，育成品种基因多样性指数为0.5455～0.8750，平均为0.7571，谷子地方品种遗传多样性高于育成品种（表2）。分析各生态区资源的遗传多样性，发现东北平原品种基因多样性指数最高，其次是华北平原，淮河以南的最低（表3）。图1为引物S226在41份谷子品种中检测到的多态性。
2.3 谷子品种聚类分析
利用NTSYS软件计算出的41份谷子品种间遗传相似系数（GS）值变动于0.0328～0.5614之间。其中来自辽宁的红苗老来变和山东的鲁谷5号、河南的绳头黄谷和张家口的坝低1之间的遗传相似系数最小，为0.0328，表明它们之间的亲缘关系最远；来自河北的冀谷20和山东的鲁谷5号之间的遗传相似系数最大，为0.5614，说明其亲缘关系最近。
对41个谷子品种进行聚类分析（图2），当遗传相似系数为0.14时，所有品种可以聚成两大
组。第一组主要是来自黄土高原、西北内陆和内蒙高原的材料，第二组主要是来自华北平原和东北平原的材料。当遗传相似系数为0.164时，所有品种可以分成六组：第一组包括黑龙江的老来变和黑谷2号，甘肃的永昌小白谷；第二组包括11个材料，分别是吉林的鸭子嘴、长扩1，河北的鸭子嘴，雁北的早二白谷，张家口的二黄米，山西的腰谷、爬坡糙，陕西的老来变，宁夏的狼尾巴，青海的黄袍谷，新疆的吐鲁番谷子，代表了内蒙高原、黄土高原和西北内陆生态区。第三组是四份育成品种，分别是嫩选15、坝低1、陇谷5号和大凉州谷。第四组是山西的红杆谷、内蒙古的金香玉以及3份育成品种。第五组包括17份材料，其中7份来源于华北平原，3份来源于东北平原，2份来源于淮河以南。第六组为河北的黑谷。聚类分析表明，来自同一生态区的谷子品种基本聚合在一起。
图2 41份谷子种质资源的聚类分析
3 讨论 Jia等（2009）[11]用（GA）n和（CA）n两个富集文库开发出269对谷子SSR引物。Li等（2008）[12]建立了 （AC）15、（AT）15、（AG）12、（TG）12和（TC）12 5个微卫星文库，设计了393对引物。Jia等（2007）[6]从1 213条EST序列中搜索到30个SSR位点，设计出26对引物。本研究直接利用谷子基因组序列开发的SSR引物，可以更全面地反映谷子DNA水平上的遗传变异。与EST-SSR相比，基因组SSR 引物多态率高，等位变异丰富，可以有效应用于谷子品种鉴定和遗传多样性研究。
本研究用30个多态性SSR标记在41份谷子初级核心种质中检测到291个等位变异，每个位点4～16个，平均9.7个，每个位点的基因多样性指数在0.6151～0.8977之间，平均为0.8074，表明本研究开发的引物能够揭示丰富的等位基因变异。此结果与Ma等（2007）[13]的研究结果不一致，与Wang等（2012）[14]的研究结果相似，原因可能是本研究利用的是谷子初级核心种质，选材更具代表性，因此可以全面反映谷子种质资源的多样性。地方品种和育成品种检测到的等位变异数分别为8.5个和6.5个，地方品种基因多样性指数为0.5728～0.8926，平均为0.7907，育成品种基因多样性指数为0.5455～0.8750，平均为0.7571，谷子地方品种遗传多样性高于育成品种。利用NTSYS计算41份谷子品种间的遗传相似系数，并进行聚类分析，多数材料遗传相似系数较小，表明我国有丰富的谷子资源类型，有很高的育种潜力。