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摘要：肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我国常见的恶性肿瘤，其死亡率位居第二。肝细胞癌的发生、发展是多因素、多步骤的复杂过程。寻找肝细胞癌发生、发展的相关基因，了解肝细胞癌的分子遗传学机制从而为肝细胞癌的诊断、治疗提供理论基础为目前的研究热点。近期的研究发现，miRNA具有癌基因和抑癌基因的作用，在肿瘤的发生和发展中起着重要的作用。已发现若干miRNA直接参与肝细胞癌的发生和发展，miRNA表达谱与肝细胞癌的诊断、分期、进展和预后等相关。作为一类新的分子靶标，miRNA应用于肝细胞癌的诊断和生物治疗具有广阔的前景。
关键词：微小RNA 肝细胞癌 功能研究
Doi：10.3969/j.issn.1671-8801.2013.08.065
【中图分类号】R-0 【文献标识码】B 【文章编号】1671-8801（2013）08-0069-01
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我国常见的恶性肿瘤，其死亡率位居第二。肝细胞癌的发生、发展是多因素、多步骤的复杂过程。寻找肝细胞癌发生、发展的相关基因，了解肝细胞癌的分子遗传学机制从而为肝细胞癌的诊断、治疗提供理论基础为目前的研究热点。
1 微小RNA与肝细胞癌的发生和发展关系
微小RNA（microRNA，miRNA）是一类长度为二十几个核苷酸的内源性非编码调控RNA，通过序列特异性翻译抑制或mRNA裂解来调控基因表达，参与细胞发育、增殖、分化、凋亡等一系列重要生物学进程。近期的研究发现，miRNA具有癌基因和抑癌基因的作用，在肿瘤的发生和发展中起着重要的作用。已发现若干miRNA直接参与肝细胞癌的发生和发展，miRNA表达谱与肝细胞癌的诊断、分期、进展和预后等相关。作为一类新的分子靶标，miRNA应用于肝细胞癌的诊断和生物治疗具有广阔的前景。
2 miRNA-21在肝细胞癌中的研究进展
2.1 miRNA-21的定位与表达。miRNA-21的编码基因定位于17q23.2，即液泡膜蛋白基因（vacuole membrane protein-1，VMP1）编码区，VMP1基因的第十内含子。VMP1也被称为跨膜蛋白49（transmembrane protein-49，TMEM-49）。有文献报道了miRNA是如何从编码区转录、如何经过剪切加工而形成有功能的成熟体。值得注意的是，17q23.2同样是人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）容易发生整合的区域。根据文献报道，多种肿瘤标本以及细胞系都检测出miRNA-21表达水平异常升高，包括乳腺癌、子宫颈癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、大肠癌、胶质瘤和胆管癌等，因此miRNA-21是一个公认的致癌性miRNA。
2.2 miRNA-21对靶基因的调控。虽然有很多文献都报道了miRNA-21在肿瘤细胞中表达水平显著升高，具有致癌基因活性，但因miRNA在理论上有数个乃至数十个靶基因，故miRNA-21调控的基因及通路下游引起的细胞生物学行为变化机制尚未完全阐明。
（1）PTEN：人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因（phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten，PTEN）位于人类染色体10q23.3，其编码的磷酸酶调控Akt蛋白表达及Akt通路下游基因的活性。有文献报导在肝癌细胞中miRNA-21对PTEN基因表达进行调控。有学者将miRNA-21的表达进行抑制后检测肿瘤细胞各种生物学行为，证实miRNA-21对肝癌细胞生长、侵袭和迁移有促进作用。这一结果是由于PTEN基因及其下游Akt通路受到miRNA-21表达变化的调节。相关文献报道首次证明了下调miRNA-21可以不通过PTEN而发挥抑制EGFR-Akt通路活性的作用。他们所选择的胶质瘤细胞系是PTEN野生型（LN229）和PTEN突变型（U251）。在这两种PTEN基因表达情况不同的胶质瘤细胞中，敲低内源性miRNA-21表达后检测到EGFR、p-Akt的表达变化却是一致的。该作者指出AS-miRNA-21（antisense-miRNA-21）抑制胶质瘤生长的作用仅部分依赖PTEN，还有一些复杂的机制等待被验证。
（2）TPM：原肌球蛋白（Tropomyosin，TPM）是肌肉收缩过程中重要的调节蛋白质，广泛分布于各种真核细胞中。原肌球蛋白1（Tropomyosin 1，TPM1）属于这一家族中较相对分子量高的一类，是肌肉收缩过程中重要的调节蛋白质。TPM可与肌动蛋白肌丝相结合而使肌动蛋白稳定于聚合状态。TPM在调节细胞能动性、形态学发生、胞浆移动和诱导内皮细胞凋亡等方面均有重要作用。有学者报告了TPM1基因序列中miRNA-21潜在结合位点的序列，验证了TPM1是miRNA-21的作用靶点，miRNA-21在转录后水平抑制TPM1表达。作者指出，由于TPM1已经被证实发挥着抑制肿瘤细胞恶性表型的作用，所以验证TPM1是miRNA-21靶点之一。
（3）PDCD4和FasL：有学者报道程序性细胞凋亡因子4（programmed cell death 4，PDCD4）mRNA的3’端非翻译区存在一个功能性miRNA-21结合位点。首次用四种不同的计算机预测方法从100多个候选基因中筛选出来8个miRNA-21的预测靶点。在293T细胞系中，下调内源性miRNA-21的表达，进一步确定PDCD4和RAS激活蛋白（RAS p21 protein activator 1，RASA1）可能是miRNA-21的作用靶点。PDCD4是与细胞周期相关的抑癌基因，抑制细胞的增殖和转化，促进细胞的凋亡。把这个基因的3’端非翻译区的全长序列，以及替换突变和缺失突变序列分别插入到PGL-3报告载体的下游，以插入无义序列的PGL-3作为对照，敲低内源性miRNA-21表达后检测荧光强度。实验结果证实miRNA-21可以抑制PDCD4的表达。不仅如此，这个研究小组还通过凝胶电泳和Western Blot的方法证明PDCD4的表达是在翻译水平被抑制。其他学者同样也证实了miRNA-21对PDCD4表达的抑制是在翻译过程，并且指出miRNA-21在结肠直肠癌中促进细胞侵袭，血管内渗和转移。除此之外，他们还首次确定了PDCD4的3’非翻译区228-249nt是miRNA-21的作用位点，通过对比人类、类人猿、恒河猴、牛等七个物种之间的这一段序列，证明了该段序列具有高度的进化保守性。据最新的文献报道，另一个凋亡相关蛋白FasL的表达也受到了miRNA-21的调控。作者指出FasL是新验证的miRNA-21的靶基因；Foxo3a通过miRNA-21来调控FsaL的表达。该研究小组对miRNA-21编码基因启动子区域的序列进行分析发现转录因子Foxo3a两个最佳的结合位点，染色体免疫共沉淀实验证明在阿霉素处理的A549细胞系，Foxo3a与其中一个结合位点的结合加强。Foxo3a在阿霉素的介导下可以降低miRNA-21启动子的活性。研究还对FasL 3’非翻译区的进行了分析。荧光素酶实验结果显示miRNA-21可以抑制FasL转录活性。在阿霉素作用下Foxo3a可以负调控miRNA-21表达，进而促进miRNA-21的靶基因FasL表达升高，提高外源性凋亡通路的活性。 2.3 miRNA-21与肿瘤药物敏感性。miRNA-21在肿瘤对化疗药物敏感性和药物抵抗方面也有一定作用。有学者改变不同肿瘤细胞系内miRNA-21表达水平后观察细胞药物敏感性的变化。该研究首先评价13个结构不同的具有已知抗癌活性的复合物生长抑制效能，通过给A549、OVCAR-3、SNB-19这三个细胞系分别转染anti-miRNA-21抑制剂，miRNA-21的前体以及作为对照的低聚物来改变miRNA-21的表达水平，然后检测不同miRNA-21表达水平的同一细胞系对不同化疗药物的反应。结果显示，不同miRNA-21表达水平改变抗癌复合物效能的结果是可能使其增加或者降低，而这一结果要取决于抗癌药物本身的种类。Blower PE等人指出miRNA-21与肿瘤的化疗敏感性密切相关，并且不同的机制决定了药物的毒性和保护效应。另有文献报道miRNA-21表达量与紫杉醇化疗效果相关。miRNA-21抑制剂与紫杉醇联合处理后胶质瘤细胞半数抑制浓度比单独使用紫杉醇处理组显著降低。该研究所选择的是PTEN突变型和PTEN野生型的胶质瘤细胞系。该研究结果再次验证了miRNA-21抑制剂可以不依赖PTEN而阻断EGFR通路。5-氟脲嘧啶（5-FU）是抗代谢类化疗药物。miRNA-21抑制剂与5-FU具有协同抗肿瘤作用。研究证明单独转染miRNA-21抑制剂与单独给药组的细胞存活率都显著高于联合处理组。
参考文献
[1] 张勇，郑启昌，卢昕，等.转染RECK基因对肝癌细胞生物学行为的影响[J].中国普外基础与临床杂志，2006，13（2）：150-153
[2] 吴印涛，李韧，刘卫辉，等.大鼠肝癌细胞与胚胎肝细胞microRNA差异表达谱的研究[J].中华肝胆外科杂志，2009，15（12）：917-920
[3] Ladeiro Y， Couchy G， Balabaud C， et al. MicroRNA profiling in hepatocellular tumors is associated with clinical features and oncogene/tumor suppressor gene mutations [J]. Hepatology， 2008， 47（6）： 1955-1963
关键词：微小RNA 肝细胞癌 功能研究
Doi：10.3969/j.issn.1671-8801.2013.08.065
【中图分类号】R-0 【文献标识码】B 【文章编号】1671-8801（2013）08-0069-01
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我国常见的恶性肿瘤，其死亡率位居第二。肝细胞癌的发生、发展是多因素、多步骤的复杂过程。寻找肝细胞癌发生、发展的相关基因，了解肝细胞癌的分子遗传学机制从而为肝细胞癌的诊断、治疗提供理论基础为目前的研究热点。
1 微小RNA与肝细胞癌的发生和发展关系
微小RNA（microRNA，miRNA）是一类长度为二十几个核苷酸的内源性非编码调控RNA，通过序列特异性翻译抑制或mRNA裂解来调控基因表达，参与细胞发育、增殖、分化、凋亡等一系列重要生物学进程。近期的研究发现，miRNA具有癌基因和抑癌基因的作用，在肿瘤的发生和发展中起着重要的作用。已发现若干miRNA直接参与肝细胞癌的发生和发展，miRNA表达谱与肝细胞癌的诊断、分期、进展和预后等相关。作为一类新的分子靶标，miRNA应用于肝细胞癌的诊断和生物治疗具有广阔的前景。
2 miRNA-21在肝细胞癌中的研究进展
2.1 miRNA-21的定位与表达。miRNA-21的编码基因定位于17q23.2，即液泡膜蛋白基因（vacuole membrane protein-1，VMP1）编码区，VMP1基因的第十内含子。VMP1也被称为跨膜蛋白49（transmembrane protein-49，TMEM-49）。有文献报道了miRNA是如何从编码区转录、如何经过剪切加工而形成有功能的成熟体。值得注意的是，17q23.2同样是人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）容易发生整合的区域。根据文献报道，多种肿瘤标本以及细胞系都检测出miRNA-21表达水平异常升高，包括乳腺癌、子宫颈癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、大肠癌、胶质瘤和胆管癌等，因此miRNA-21是一个公认的致癌性miRNA。
2.2 miRNA-21对靶基因的调控。虽然有很多文献都报道了miRNA-21在肿瘤细胞中表达水平显著升高，具有致癌基因活性，但因miRNA在理论上有数个乃至数十个靶基因，故miRNA-21调控的基因及通路下游引起的细胞生物学行为变化机制尚未完全阐明。
（1）PTEN：人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因（phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten，PTEN）位于人类染色体10q23.3，其编码的磷酸酶调控Akt蛋白表达及Akt通路下游基因的活性。有文献报导在肝癌细胞中miRNA-21对PTEN基因表达进行调控。有学者将miRNA-21的表达进行抑制后检测肿瘤细胞各种生物学行为，证实miRNA-21对肝癌细胞生长、侵袭和迁移有促进作用。这一结果是由于PTEN基因及其下游Akt通路受到miRNA-21表达变化的调节。相关文献报道首次证明了下调miRNA-21可以不通过PTEN而发挥抑制EGFR-Akt通路活性的作用。他们所选择的胶质瘤细胞系是PTEN野生型（LN229）和PTEN突变型（U251）。在这两种PTEN基因表达情况不同的胶质瘤细胞中，敲低内源性miRNA-21表达后检测到EGFR、p-Akt的表达变化却是一致的。该作者指出AS-miRNA-21（antisense-miRNA-21）抑制胶质瘤生长的作用仅部分依赖PTEN，还有一些复杂的机制等待被验证。
（2）TPM：原肌球蛋白（Tropomyosin，TPM）是肌肉收缩过程中重要的调节蛋白质，广泛分布于各种真核细胞中。原肌球蛋白1（Tropomyosin 1，TPM1）属于这一家族中较相对分子量高的一类，是肌肉收缩过程中重要的调节蛋白质。TPM可与肌动蛋白肌丝相结合而使肌动蛋白稳定于聚合状态。TPM在调节细胞能动性、形态学发生、胞浆移动和诱导内皮细胞凋亡等方面均有重要作用。有学者报告了TPM1基因序列中miRNA-21潜在结合位点的序列，验证了TPM1是miRNA-21的作用靶点，miRNA-21在转录后水平抑制TPM1表达。作者指出，由于TPM1已经被证实发挥着抑制肿瘤细胞恶性表型的作用，所以验证TPM1是miRNA-21靶点之一。
（3）PDCD4和FasL：有学者报道程序性细胞凋亡因子4（programmed cell death 4，PDCD4）mRNA的3’端非翻译区存在一个功能性miRNA-21结合位点。首次用四种不同的计算机预测方法从100多个候选基因中筛选出来8个miRNA-21的预测靶点。在293T细胞系中，下调内源性miRNA-21的表达，进一步确定PDCD4和RAS激活蛋白（RAS p21 protein activator 1，RASA1）可能是miRNA-21的作用靶点。PDCD4是与细胞周期相关的抑癌基因，抑制细胞的增殖和转化，促进细胞的凋亡。把这个基因的3’端非翻译区的全长序列，以及替换突变和缺失突变序列分别插入到PGL-3报告载体的下游，以插入无义序列的PGL-3作为对照，敲低内源性miRNA-21表达后检测荧光强度。实验结果证实miRNA-21可以抑制PDCD4的表达。不仅如此，这个研究小组还通过凝胶电泳和Western Blot的方法证明PDCD4的表达是在翻译水平被抑制。其他学者同样也证实了miRNA-21对PDCD4表达的抑制是在翻译过程，并且指出miRNA-21在结肠直肠癌中促进细胞侵袭，血管内渗和转移。除此之外，他们还首次确定了PDCD4的3’非翻译区228-249nt是miRNA-21的作用位点，通过对比人类、类人猿、恒河猴、牛等七个物种之间的这一段序列，证明了该段序列具有高度的进化保守性。据最新的文献报道，另一个凋亡相关蛋白FasL的表达也受到了miRNA-21的调控。作者指出FasL是新验证的miRNA-21的靶基因；Foxo3a通过miRNA-21来调控FsaL的表达。该研究小组对miRNA-21编码基因启动子区域的序列进行分析发现转录因子Foxo3a两个最佳的结合位点，染色体免疫共沉淀实验证明在阿霉素处理的A549细胞系，Foxo3a与其中一个结合位点的结合加强。Foxo3a在阿霉素的介导下可以降低miRNA-21启动子的活性。研究还对FasL 3’非翻译区的进行了分析。荧光素酶实验结果显示miRNA-21可以抑制FasL转录活性。在阿霉素作用下Foxo3a可以负调控miRNA-21表达，进而促进miRNA-21的靶基因FasL表达升高，提高外源性凋亡通路的活性。 2.3 miRNA-21与肿瘤药物敏感性。miRNA-21在肿瘤对化疗药物敏感性和药物抵抗方面也有一定作用。有学者改变不同肿瘤细胞系内miRNA-21表达水平后观察细胞药物敏感性的变化。该研究首先评价13个结构不同的具有已知抗癌活性的复合物生长抑制效能，通过给A549、OVCAR-3、SNB-19这三个细胞系分别转染anti-miRNA-21抑制剂，miRNA-21的前体以及作为对照的低聚物来改变miRNA-21的表达水平，然后检测不同miRNA-21表达水平的同一细胞系对不同化疗药物的反应。结果显示，不同miRNA-21表达水平改变抗癌复合物效能的结果是可能使其增加或者降低，而这一结果要取决于抗癌药物本身的种类。Blower PE等人指出miRNA-21与肿瘤的化疗敏感性密切相关，并且不同的机制决定了药物的毒性和保护效应。另有文献报道miRNA-21表达量与紫杉醇化疗效果相关。miRNA-21抑制剂与紫杉醇联合处理后胶质瘤细胞半数抑制浓度比单独使用紫杉醇处理组显著降低。该研究所选择的是PTEN突变型和PTEN野生型的胶质瘤细胞系。该研究结果再次验证了miRNA-21抑制剂可以不依赖PTEN而阻断EGFR通路。5-氟脲嘧啶（5-FU）是抗代谢类化疗药物。miRNA-21抑制剂与5-FU具有协同抗肿瘤作用。研究证明单独转染miRNA-21抑制剂与单独给药组的细胞存活率都显著高于联合处理组。
参考文献
[1] 张勇，郑启昌，卢昕，等.转染RECK基因对肝癌细胞生物学行为的影响[J].中国普外基础与临床杂志，2006，13（2）：150-153
[2] 吴印涛，李韧，刘卫辉，等.大鼠肝癌细胞与胚胎肝细胞microRNA差异表达谱的研究[J].中华肝胆外科杂志，2009，15（12）：917-920
[3] Ladeiro Y， Couchy G， Balabaud C， et al. MicroRNA profiling in hepatocellular tumors is associated with clinical features and oncogene/tumor suppressor gene mutations [J]. Hepatology， 2008， 47（6）： 1955-1963