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摘要：目的：建立HPLC/MS方法，快速定性定量检测保健食品中非法添加的硝苯地平。方法：采用高效液相色谱串联三重四级杆质谱仪。色谱条件：Agilent Eclipse Plus C18（4.6mm×100mm，3.5μm）色谱柱。柱温：30OC。流动相：乙腈：0.2%甲酸水溶液=71：29。流速为0.6mL/min。质谱条件：ESI源，多反应监测（MRM）。以保留时间及定性离子对之间的相对丰度定性。以定量离子对峰面积定量。结果：硝苯地平在1.083～108.3ng/mL范围内呈现良好的线性关系（r>0.9998）。平均加样回收率：99.44%。定量限为216.6pg 结论：本方法定性可靠、定量准确，且快速简便。可用于保健食品中非法添加硝苯地平的检测。
关键词：硝苯地平 非法添加 定性 定量 HPLC/MS
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2015）02-0011-02
硝苯地平是第一代钙拮抗剂，为抗高血压、防治心绞痛药物，适用于各种类型的高血压，对顽固性、重度高血压也有较好疗效，是20世纪80年代中期世界畅销的药物之一。该药的特点是：起效快，峰/谷比值高，导致了神经体液活化，经多年临床使用，该药的疗效得到了肯定。硝苯地平在价格上也占据了强有力的优势。但药效时间短，血压波动大，尚有负性肌力和负性传导作用，增加冠心病患者的死亡率[1]。一些不法商贩，在一些宣称具有降压疗效的保健食品中非法添加使用，由于非法添加的化学药物，剂量上无从把握，有些患者在不知情的情况下使用，无意中增加了风险性，造成不良反应，严重的更是威胁自己的生命[2]，所以，急需对此类非法添加行为建立检验检测方法，严厉打击。之前已有不少研究者用不同的一起监测中成药制剂中添加降压药物此保健品已报道的只有樊磊磊等的定量检测非法添加物利血平，因怀疑其中不止混有利血平，还有其他降压化学药品，本文采用超高效液相色谱串联三重四级杆质谱仪，检测出其还混有硝苯地平，并进行首次定性定量同步检测。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
高效液相色谱串联三重四级杆质谱联用仪（Agilent 6460 安捷伦公司）；色谱柱Eclipse Plus C18（4.6mm×100mm，3.5μm） （安捷伦公司）；滤膜0.8μm（上海半岛实业有限公司净化器材厂）；SK5210HO超声清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；BT124S电子分析天平（北京赛多利斯公司）；BP211D电子分析天平（北京赛多利斯公司）。硝苯地平对照品（供含量测定用，批号：100338-200502中国药品生物制品检定所），清脑保心康胶囊（国药准字Z20002158 药品安全专项整治行动送检样品）；乙腈；甲醇均为色谱纯（Merck公司），水为超纯水。
1.2 HPLC/MS条件
HPLC条件：色谱柱：Eclipse Plus C18（4.6mm×100mm，3.5μm） ，柱温：30OC，进样量：2μl，乙腈：0.2%甲酸水溶液=71：29；流速：0.6mL/min。MS条件：ESI源（+），毛细管电压：3.5kV，离子源温度：100，干燥气温度：350 OC，干燥气流速：10L/min，雾化器压力：50psi。监测方式：MRM，监测离子对（m/z）：347.1>315.1；347.1>254.1；347.1>195.1；347.1>194.1。
1.3 对照品溶液的制备
避光条件下， 精密称取硝苯地平标准对照品10.83mg，置棕色容量瓶中，加甲醇定量稀释制成浓度为10.83ug/L的标准贮备液，2～8℃冷藏保存，备用。
1.4 供试品溶液的制备
避光条件下，取样品内容物适量，混匀后，取一次性服用量样品（4粒，约1g），精密称定后，置50ml容量瓶中，加甲醇40ml，超声处理15min，冷至室温，用甲醇稀释至刻度，摇匀，稀释2000倍后，过0.8μm微孔滤膜，即得[3]。
1.5 空白溶液制备
直接取稀释溶剂即得。
2 结果
2.1 定性分析
取标准贮备液，稀释制成216.6ng/ml的对照品溶液，进样2μl，记录所得质谱MRM色谱图。统计并分析对照品溶液所得图谱中硝苯地平的色谱保留时间（RT=2.6min）及定性离子碎片存在有（m/z：347.1>315.1；347.1>254.1；347.1>195.1；347.1>194.1）。见图1。
取供试品溶液，进样2μl，记录所得质谱MRM色谱图。统计并分析供试品溶液苏哦的图谱，如检测硝苯地平的质谱MRM离子通道中有色谱峰出现，先与对照品中峰的保留时间对比（供试品峰RT=2.6min的±2.5%允许误差范围内），此一致，再对比定性离子碎片是否跟对照品一致，也一致，如判断供试品溶液中含有此化学药品。见图2。
2.2 定量分析
对判定供试品溶液中含有硝苯地平的供试品，则按其定量离子对（m/z）：347.1>315.1的峰面积进行含量计算。含量测定方法研究如下：
（1）线性考察和定量限配制系列浓度的对照品溶液，进样测定，以浓度为横坐标，以离子对的峰面积为纵坐标进行线性回归，结果表明硝苯地平在1.083～108.3ng/ml范围内线性方程为Y=43.673782X-2.777850（r=0.9999），呈良好的线性关系，进样量为2μl，硝苯地平的定量限为216.6pg。
（2）精密度试验取对照品溶液1份，连续进样6次，硝苯地平定量离子对峰面积的RSD为1.68%。
（3）重复性试验取此阳性样品6份，按供试品溶液制备方法制备，依次进样测定。硝苯地平含量的RSD为：1.26%。 （4）稳定性试验取2.2.3重复性试验项下所制备的同一供试品溶液，分别在2、4、8、16h，进样测定，结果硝苯地平的峰面积RSD为1.18%，表明供试品溶液在制备后的16h内稳定性良好。
（5）回收率试验取一次性服用量的阳性样品6份，分别置于50ml容量瓶中，各精密加入10.83ug/ml的标准贮备液甲醇2.5ml，超声处理15min，冷至室温，用甲醇稀释至刻度，摇匀，稀释2000倍后，过0.8μm微孔滤膜，进行测定。平均回收率为：99.44%，RSD为：0.94%。见表1。
（6） 样品测定取供试品溶液，进样测定，以所监测的MRM色谱图中定量离子对（m/z）：347.1>315.1的峰面积计算，样品中含硝苯地平：5.1mg/g。
2.3 讨论
在试验中选择流动相时，曾比较过液质联用仪常用到的乙腈-水溶液、乙腈-0.2%甲酸的水溶液，发现采用乙腈-0.2%甲酸的水溶液作为流动相，所得的硝苯地平的离子信号明显增强，这与其结构中所含的带N的碱性基团，在酸性条件下有利于其离子化有关。
3 结语
清脑保心康胶囊以具有降压功效的纯中药制剂保健食品的形式，非法添加化学药品硝苯地平销售，其成分复杂，干扰因素较多，采用其他检测方法难度颇大，但采用串联四级杆质谱MRM监测方式，选择性好，并能有效排除其他干扰，无需对样品进行复杂的前处理，避免了因前处理可能带来的误差，采用相对保留时间及离子碎片进行定性，定性结果更为准确，且灵敏度也极高。采用HPLC分析样品，在3min内即可完成样品的检测，两者结合轻易实现了快速的定性定量监测，故此，HPLC/MS法明显优于简单的HPLC法[4]。
参考文献
[1]王玲.高血压病降压药物的合理应用[J]广西中医学院学报，2000，17（1）：55-56.
[2]周兰坤.谈降压药物的不良反应[J]中外医疗，2009，29（15）：90.
[3]刘吉金.降压保健品及中成药中非法添加化学成分的快速检测方法研究[J]中成药，2008，30（1）：144.
[4]刘吉金，杨敏，李军等.HPLC同时检测保健品及中成药中非法添加9种抗高血压化学药物的研究[J]中国现在应用药学杂志，2008，25（8）：717.
关键词：硝苯地平 非法添加 定性 定量 HPLC/MS
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2015）02-0011-02
硝苯地平是第一代钙拮抗剂，为抗高血压、防治心绞痛药物，适用于各种类型的高血压，对顽固性、重度高血压也有较好疗效，是20世纪80年代中期世界畅销的药物之一。该药的特点是：起效快，峰/谷比值高，导致了神经体液活化，经多年临床使用，该药的疗效得到了肯定。硝苯地平在价格上也占据了强有力的优势。但药效时间短，血压波动大，尚有负性肌力和负性传导作用，增加冠心病患者的死亡率[1]。一些不法商贩，在一些宣称具有降压疗效的保健食品中非法添加使用，由于非法添加的化学药物，剂量上无从把握，有些患者在不知情的情况下使用，无意中增加了风险性，造成不良反应，严重的更是威胁自己的生命[2]，所以，急需对此类非法添加行为建立检验检测方法，严厉打击。之前已有不少研究者用不同的一起监测中成药制剂中添加降压药物此保健品已报道的只有樊磊磊等的定量检测非法添加物利血平，因怀疑其中不止混有利血平，还有其他降压化学药品，本文采用超高效液相色谱串联三重四级杆质谱仪，检测出其还混有硝苯地平，并进行首次定性定量同步检测。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
高效液相色谱串联三重四级杆质谱联用仪（Agilent 6460 安捷伦公司）；色谱柱Eclipse Plus C18（4.6mm×100mm，3.5μm） （安捷伦公司）；滤膜0.8μm（上海半岛实业有限公司净化器材厂）；SK5210HO超声清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；BT124S电子分析天平（北京赛多利斯公司）；BP211D电子分析天平（北京赛多利斯公司）。硝苯地平对照品（供含量测定用，批号：100338-200502中国药品生物制品检定所），清脑保心康胶囊（国药准字Z20002158 药品安全专项整治行动送检样品）；乙腈；甲醇均为色谱纯（Merck公司），水为超纯水。
1.2 HPLC/MS条件
HPLC条件：色谱柱：Eclipse Plus C18（4.6mm×100mm，3.5μm） ，柱温：30OC，进样量：2μl，乙腈：0.2%甲酸水溶液=71：29；流速：0.6mL/min。MS条件：ESI源（+），毛细管电压：3.5kV，离子源温度：100，干燥气温度：350 OC，干燥气流速：10L/min，雾化器压力：50psi。监测方式：MRM，监测离子对（m/z）：347.1>315.1；347.1>254.1；347.1>195.1；347.1>194.1。
1.3 对照品溶液的制备
避光条件下， 精密称取硝苯地平标准对照品10.83mg，置棕色容量瓶中，加甲醇定量稀释制成浓度为10.83ug/L的标准贮备液，2～8℃冷藏保存，备用。
1.4 供试品溶液的制备
避光条件下，取样品内容物适量，混匀后，取一次性服用量样品（4粒，约1g），精密称定后，置50ml容量瓶中，加甲醇40ml，超声处理15min，冷至室温，用甲醇稀释至刻度，摇匀，稀释2000倍后，过0.8μm微孔滤膜，即得[3]。
1.5 空白溶液制备
直接取稀释溶剂即得。
2 结果
2.1 定性分析
取标准贮备液，稀释制成216.6ng/ml的对照品溶液，进样2μl，记录所得质谱MRM色谱图。统计并分析对照品溶液所得图谱中硝苯地平的色谱保留时间（RT=2.6min）及定性离子碎片存在有（m/z：347.1>315.1；347.1>254.1；347.1>195.1；347.1>194.1）。见图1。
取供试品溶液，进样2μl，记录所得质谱MRM色谱图。统计并分析供试品溶液苏哦的图谱，如检测硝苯地平的质谱MRM离子通道中有色谱峰出现，先与对照品中峰的保留时间对比（供试品峰RT=2.6min的±2.5%允许误差范围内），此一致，再对比定性离子碎片是否跟对照品一致，也一致，如判断供试品溶液中含有此化学药品。见图2。
2.2 定量分析
对判定供试品溶液中含有硝苯地平的供试品，则按其定量离子对（m/z）：347.1>315.1的峰面积进行含量计算。含量测定方法研究如下：
（1）线性考察和定量限配制系列浓度的对照品溶液，进样测定，以浓度为横坐标，以离子对的峰面积为纵坐标进行线性回归，结果表明硝苯地平在1.083～108.3ng/ml范围内线性方程为Y=43.673782X-2.777850（r=0.9999），呈良好的线性关系，进样量为2μl，硝苯地平的定量限为216.6pg。
（2）精密度试验取对照品溶液1份，连续进样6次，硝苯地平定量离子对峰面积的RSD为1.68%。
（3）重复性试验取此阳性样品6份，按供试品溶液制备方法制备，依次进样测定。硝苯地平含量的RSD为：1.26%。 （4）稳定性试验取2.2.3重复性试验项下所制备的同一供试品溶液，分别在2、4、8、16h，进样测定，结果硝苯地平的峰面积RSD为1.18%，表明供试品溶液在制备后的16h内稳定性良好。
（5）回收率试验取一次性服用量的阳性样品6份，分别置于50ml容量瓶中，各精密加入10.83ug/ml的标准贮备液甲醇2.5ml，超声处理15min，冷至室温，用甲醇稀释至刻度，摇匀，稀释2000倍后，过0.8μm微孔滤膜，进行测定。平均回收率为：99.44%，RSD为：0.94%。见表1。
（6） 样品测定取供试品溶液，进样测定，以所监测的MRM色谱图中定量离子对（m/z）：347.1>315.1的峰面积计算，样品中含硝苯地平：5.1mg/g。
2.3 讨论
在试验中选择流动相时，曾比较过液质联用仪常用到的乙腈-水溶液、乙腈-0.2%甲酸的水溶液，发现采用乙腈-0.2%甲酸的水溶液作为流动相，所得的硝苯地平的离子信号明显增强，这与其结构中所含的带N的碱性基团，在酸性条件下有利于其离子化有关。
3 结语
清脑保心康胶囊以具有降压功效的纯中药制剂保健食品的形式，非法添加化学药品硝苯地平销售，其成分复杂，干扰因素较多，采用其他检测方法难度颇大，但采用串联四级杆质谱MRM监测方式，选择性好，并能有效排除其他干扰，无需对样品进行复杂的前处理，避免了因前处理可能带来的误差，采用相对保留时间及离子碎片进行定性，定性结果更为准确，且灵敏度也极高。采用HPLC分析样品，在3min内即可完成样品的检测，两者结合轻易实现了快速的定性定量监测，故此，HPLC/MS法明显优于简单的HPLC法[4]。
参考文献
[1]王玲.高血压病降压药物的合理应用[J]广西中医学院学报，2000，17（1）：55-56.
[2]周兰坤.谈降压药物的不良反应[J]中外医疗，2009，29（15）：90.
[3]刘吉金.降压保健品及中成药中非法添加化学成分的快速检测方法研究[J]中成药，2008，30（1）：144.
[4]刘吉金，杨敏，李军等.HPLC同时检测保健品及中成药中非法添加9种抗高血压化学药物的研究[J]中国现在应用药学杂志，2008，25（8）：717.