论文部分内容阅读
摘要随着现代分子生物学与免疫学技术的快速发展与应用，牛病毒性腹泻病毒新型抗原抗体检测方法不断发展和完善对近年来对牛病毒性腹泻病毒的RTPCR、荧光定量RTPCR、RTLAMP、ELISA和胶体金技术等抗原抗体检测方法进行综述，以期为不同实验室寻找适合的诊断方法以及发展新型诊断方法提供参考，为我国牛病毒性腹泻病的综合防控提供合理的科学依据。
关键词牛病毒性腹泻病毒；抗原；抗体；分子生物学；免疫学；检测方法；研究进展
中图分类号S852.65+3文献标识码A文章编号0517-6611（2014）18-05876-03
牛病毒性腹泻（Bovine viral diarrhea，BVD）是由牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）引起的以牛发热、粘膜糜烂溃疡、腹泻、咳嗽、母牛流产、繁殖障碍为主要特征的持续性感染病，是导致牛生产性能下降的主要疫病之一，呈世界性分布，给全球养牛业带来巨大的经济损失，我国养牛比较发达地区几乎都存在该病的感染[1-4]。BVDV为黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestivirus）的代表种，根据其5’端非翻译区核酸序列分为基因I型和II型[5]。BVDVI和BVDVII所引起的临床症状、发病特点及致病性明显不同，BVDVI常引起过性发热、下痢和急慢性粘膜病[6]；BVDVII在临床上常表现为发烧、腹泻、出血、呼吸失调、可引起怀孕母牛流产、死胎和新生小牛的先天畸形，对牛的致死率较高，危害性更为严重[7]。我国BVDV的主要流行毒株为BVDVI型，但近年来分离与鉴定到BVDVII型的报道逐渐增多[8-9]。只有研制快速、准确、灵敏和特异的BVDV检测方法并将其推广应用，才能更好地诊断和控制该病。BVDV的常用诊断方法有病毒分离、电镜检查、中和试验、琼脂扩散试验和免疫荧光等，这些方法不仅操作繁琐、复杂耗时、难以实现快速诊断，而且敏感性均较低，对处于免疫耐受和持续性感染牛容易出现漏检。随着现代分子生物学与免疫学技术的快速发展与应用，BVDV新型抗原抗体检测方法不断发展和完善。笔者就近年来针对BVDV的RTPCR、荧光定量RTPCR、RTLAMP、ELISA和胶体金技术等抗原抗体新型检测方法进行了综述，以期为不同实验室寻找适合的诊断方法以及发展新型诊断方法提供参考，为我国牛病毒性腹泻病的综合防控提供合理的科学依据。
1牛病毒性腹泻病毒的抗原检测方法
1.1RTPCR
1.1.1通用性RTPCR及套式RTPCR。王伟利等根据BVDV 5’端非编码区（5’UTR）设计合成l对特异性引物，建立检测BVDV的RTPCR方法，该方法对3株BVDV毒株的检测均为阳性，对牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）、猪瘟病毒（CSFV）、牛轮状病毒（BRV）、牛冠状病毒（BCV）的检测结果均呈阴性，与病毒分离试验的符合率达100%[10]。该方法特异性强，敏感性高，可以用于临床BVDV的检测及流行病学调查。郭春娟等建立了检测BVDV I型和Ⅱ型抗原的通用RTPCR方法，该方法检测BVDV I型和II型标准毒株均呈阳性，检测IBRV、CSFV、蓝舌病病毒（BTV）、口蹄疫病毒（FMDV）、MDBK细胞均呈阴性，检测的灵敏度为10-1TCID50/ml，检测400份临床样品，阳性检出率为10.75%[11]，明显高于ELISA检测结果。该方法具有特异、灵敏、高效、快速、重复性好等特点，为BVDV的检疫、诊断及流行病学调查提供了一种有效的技术手段。Bachofen C等根据BVDV 5’UTR设计引物，建立了从牛的血清中进行BVDV检测一步RTPCR方法[12]，该方法放在1个96孔进行PCR扩增，提高了检测速度，降低成本、操作时间和潜在的污染，具有高通量、低成本等优点，值得推广应用。
祖立闯等根据BVDV 5' 非编码区，设计2对特异性引物，建立了检测BVDV的套式RTPCR方法，检测CSFV、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、MDBK 细胞、IBRV、猪伪狂犬病毒（PRV）均呈阴性，第1轮RTPCR检测灵敏度为1 pg，而套式RTPCR检测灵敏度达到0.1 pg。在临床51份样品的检测中，第1轮RTPCR 检测出阳性样品11份，而套式RTPCR检测出阳性样品22份[13]。套式RTPCR极大地提高了常规RTPCR检测方法的特异性和敏感性，可以准确快速检测出极低含量的BVDV，为BVDV的早期感染和持续感染提供了简单、实用的有效诊断方法。
1.1.2基因分型RTPCR。熊浩等比较并分析了BVDV I型和II型5’UTR，分别设计合成2对针对基因I型和II型的特异性检测引物，通过对RTPCR反应条件的优化建立了在同一反应体系中同时检测BVDV基因I型和Ⅱ型的双重RTPCR方法，该方法对2个基因型的病毒检测灵敏度均为2 TCID50，只比单重PCR的灵敏度降低了10倍，但具有较好的特异性和可重复性，对新疆5个不同牛场的175份流产牛全血和组织样品进行检测，共6份BVDVI型阳性，没有检测到BVDVII型[14]。王克栋等根据BVDV I型和II型5’UTR分别设计合成2对引物，根据牛3磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）基因设计合成1对引物，以牛GAPDH基因为内标建立了牛病毒性腹泻病毒分型与内标三重RTPCR检测方法，该方法的灵敏度为100 TCID50，与不加内标检测灵敏度相当[15]，经临床样品检测验证具有较好的特异性和重复性，可用来对牛病毒性腹泻病毒分型进行快速准确检测。多重PCR方法可在同一个体系中同时对BVDV I型和II型基因进行扩增，实现了对2个基因型的BVDV进行同步分型检测，大大节省了检测时间和检测成本，为临床中BVDVI和BVDVII的鉴别诊断和流行病学调查等研究提供了有效技术支持。
1.2荧光定量RTPCR任艳等以BVDV 5’UTR为参考，设计并优化1对特异的荧光定量PCR引物，建立一种快速、定量检测BVDV的荧光定量RTPCR方法，该方法的灵敏性比常规PCR高10倍，检测变异系数低于1%，检测25份不同地区采集的临床症状疑似BVDV感染的牛粪样品，阳性检出率为72%[16]。与病毒分离培养和电检观察相比，该方法具有快速、灵敏、特异、重复性好和能定量检测等优点，为实验室快速、准确检测BVDV奠定了基础。陈其兵等根据BVDV 5’UTR设计合成了1对特异性引物和1条TaqMan荧光探针，通过对反应条件和反应体系的优化建立了一种能快速定量检测BVDV的荧光定量RTPCR方法，该方法检测CSFV、PRRSV、MDBK细胞均呈阴性，病毒含量的最低检测限为103～104拷贝/ml，具有快速、特异、灵敏、重复性好等特点，可用于临床及科研中对BVDV的快速定量检测和肉类食品进出口检疫[17]。荧光定量RTPCR方法表现出更高的敏感性。荧光定量PCR检测方法与RTPCR检测方法相比其敏感性与特异性更高，可以对BVDV进行早期诊断，及时发现病源，且可以实现定量检测，具有广阔的开发应用前景。 1.3RTLAMP方法环介导等温扩增（Loopmediated isothermal amplification，LAMP）检测技术是在PCR方法上发展起来的新兴核酸检测技术，可在恒温条件下方便、快速、灵敏、特异的检测核酸，具有较高的临床实用性。范晴等根据BVDV5’UTR，在保守区的8个位点设计LAMP特异性引物，对反应条件和试剂浓度进行优化，建立BVDV的RTLAMP快速检测方法，该方法在63.5 ℃的恒温条件下65 min内即可完成检测，可通过观察浑浊度或加入染料后直接判定扩增结果。经检测发现牛结核杆菌、BRV、CSFV、IBRV均为阴性，灵敏度可以达到1拷贝/μl，是常规RTPCR的105倍[18]。Fan Q等建立了BVDV RTLAMP快速检测方法，该检测与其他牛病毒没有交叉反应，与荧光定量RTPCR方法同时检测88份临床样品，RTLAMP方法检测出阳性38份，荧光定量RTPCR方法检测出阳性39份，RTLAMP方法的灵敏度与荧光定量RTPCR方法相当，可用于基层BVDV临床病料的现场检测和快速诊断[19]。RTLAMP检测方法快速、成本低、特异性好、灵敏度高、尤其适用于基层和现场检测，为BVDV的检测提供了新的技术方法，对BVDV的有效防制具有重要意义。
1.4夹心ELISA方法蒋颖等将BVDV 890株（BVDVII型）病毒液浓缩并纯化后免疫BALB/c小鼠制备的单克隆抗体3D8为捕获抗体，单克隆抗体3F9经生物素标记后为检测抗体，建立检测BVDV的双抗体夹心ELISA方法，该方法检测BVDV 890株（BVDVII）、NADL株（BVDVI））、XJ04株（BVDVII）均呈阳性，检测CSFV、I型牛疱疹病毒（BHV1）、BRV均呈阴性，对BVDV抗原的最低检出量为84 ng/ml，检测35份临床病牛血清样品，检出阳性血清13份，与RTPCR的符合率达到94.29%[20]。该方法具有特异、灵敏、可靠、方便、快捷等特点，可广泛推广应用，为我国BVDV的监测提供了行之有效的技术手段。杨俊兴用纯化的BVDV作为抗原，经动物免疫、细胞融合、间接ELISA筛选和亚克隆，得到3株抗BVDV的单克隆抗体（2A6、2F4和5C9），选用2A6和5C9作为包被抗体，用辣根过氧化物酶（HRP）标记的单克隆抗体2F4作为夹心抗体，建立了检测发现BVDV的双单克隆抗体夹心ELISA方法，检测发现BVDV（I型和II型）呈阳性，检测CSFV、赤羽病病毒（AKV）、BRV、FMDV均呈阴性，该方法与RTPCR和商品化ELISA试剂盒的符合率分别为98.8%和99.0%[21]。该ELISA方法具有良好的特异性和敏感性，可以代替商品化ELISA试剂盒，可用于BVDV抗原快速检测和对大量样本的筛选。夹心ELISA检测方法将单克隆抗体的特异性和酶标记技术的敏感性有机地结合起来，能够在短时间内准确、快速、直接检测大批量样品中的BVDV抗原，明显优于病毒分离和免疫荧光等方法，而且具有半自动化的特点，更适合于各级兽医研究机构在大面积普查和流行病学调查中应用。
2牛病毒性腹泻病毒的抗体检测方法
2.1间接ELISA方法柴顺秀等用BVDV重组E2蛋白作为包被抗原，HRP标记葡萄球菌A蛋白（SPA）作为二抗，建立了检测BVDV血清抗体的E2PPAELISA方法，该方法检测CSFV、BCV、BRV阳性血清均呈阴性，灵敏度达1∶320，285份血清样本的阳性检出率为33.4%，与IDEXX ELISA试剂盒的检出率无明显差异[22]。该方法具有良好的重复性、敏感性和特异性，为BVDV的快速诊断和流行病学调查提供一种快速、简便的血清学诊断方法，适合规模化养牛场BVDV的抗体监测以及流行病学调查。Mayers J等建立了一种间接复合ELISA，可以同时检测BVDV、BHV1、牛副流感病毒3（BPV3）和牛呼吸道合胞体病毒（BRSV）抗体，减少了检测试剂的成本，并简化了试验操作[23]。Lanyon S R等对BVDV特异性抗体ELISA检测方法进行了临床应用和效果评价，采用ELISA和病毒中和试验同时检测125份牛血清样品，采用ELISA和AGP同时检测1 182份未免疫牛血清血清样品，ELISA方法与病毒中和试验的敏感性和特异性分别为967% 和97.1%，ELISA方法与琼扩试验相比，敏感性更高[24]。Gonda M G等利用BVDV ELISA抗体检测方法对BVDV疫苗免疫后的血清抗体效价进行了检测，结果表明ELISA方法可以用于BVDVI型和II型中和抗体的效价检测，评价疫苗免疫效果[25]。间接ELISA方法高通量、检测快速、操作简单，是目前常用的免疫学抗体诊断技术，可广泛用于BVDV的抗体检测和流行病学调查。
2.2胶体金方法张宁等利用BVDV标准毒株作为免疫原免疫健康家兔，制备抗BVDV高免血清，采用辛酸-硫酸胺法提纯免疫球蛋白IgG，同时采用鞣酸-柠檬酸三钠混合还原法制备5 nm胶体金颗粒。在电磁搅拌下，利用胶体金颗粒标记兔抗BVDV IgG制备金标抗体，采用双抗体夹心法建立了检测BVDV的斑点免疫金银染色方法（DotELISA），该方法检测CSFV、BRV、MDBK细胞、健康牛血样均为阴性，抗原最低检出量为0.335 μg/ml，该方法和AGP方法同时检测78份河北省不同地区采集腹泻奶牛血样品，DotIGSS和AGP的阳性检出率分别为58.97%和34.62%[26]，DotIGSS方法的阳性检出率明显高于AGP方法。胶体金标记技术具有快速、方便、简单、不需要昂贵仪器和专业人员、肉眼判读、试验结果易保存等优点，特别适合于基层兽医部门和养殖场推广应用，具有广阔的发展和推广应用前景，具有高度敏感性，非常适用于临床诊断和检疫。
3小结
牛病毒性腹泻是危害我国养牛业健康发展的主要疫病之一，加强其诊断技术研究与监测工作对BVDV综合防控措施的制定具有重要意义。对BVDV的检测要力争做到快速、敏感、准确，这对于感染动物的隔离与治疗以及对未感染动物快速采取预防措施都十分重要。目前，BVDV敏感、快速、特异的检测技术主要有针对病毒DNA的抗原检测技术和针对病毒产生抗体的抗体检测技术，抗体检测可以了解BVDV感染与发生进程，但动物在BVDV感染一定时间后才会产生抗体，因此抗体检测存在一定的滞后性和局限性。分子生物学等抗原检测方法可以敏感、特异地检测出病毒核酸，其中荧光定量RTPCR方法较RTPCR方法更加敏感，但该方法对试验试剂与机器要求较高，难以在普通实验室普及应用。RTLAMP方法操作简单、不需要特殊仪器设备，肉眼判读、特别适合于基层实验室应用。ELISA检测方法检测快速、高通量，适合用于大批量样品检测和大面积流行病学调查。总而言之，BVDV的各种抗原抗体检测方法均有优缺点，可根据检测实际选择2种或2种以上方法进行使用，相信随着分子生物学与免疫学技术的进一步发展与应用，牛病毒性腹泻病毒新型抗原抗体检测方法还会不断完善，从而为我国牛病毒性腹泻病的综合防控提供更加合理依据。 安徽农业科学2014年参考文献
[1] ALMEIDA L L，MIRANDA I C，HEIN H E，et al.Herdlevel risk factors for bovine viral diarrhea virus infection in dairy herds from Southern Brazil[J].Res Vet Sci，2013，95（3）：901-907.
[2] BACHOFEN C，BOLLINGER B，PETERHANS E，et al.Diagnostic gap in Bovine viral diarrhea virus serology during the periparturient period in cattle[J].J Vet Diagn Invest，2013，25（5）：655-661.
[3] KARAKAYA E，ALPAY G，YILMAZBASMECITOGLU G，et al.Perosomus elumbis in a Holstein calf infected with bovine viral diarrhea virus[J].Tierarztl Prax Ausg G Grosstiere Nutztiere，2013，41（6）：387-391.
[4] 王建领，付彤，刘杰，等.牛病毒性腹泻分子及血清流行病学研究进展[J].河南农业科学，2012，41（3）：7-11.
[5] RATTA B，YADAV B S，POKHRIYAL M，et al.Microarray chip based identification of a mixed infection of bovine herpesvirus 1 and bovine viral diarrhea 2 from Indian cattle[J].Curr Microbiol，2014，68（1）：127-131.
[6] KUTA A，POLAK M P，LARSKA M，et al.Predominance of bovine viral diarrhea virus 1b and 1d subtypes during eight years of survey in Poland[J].Vet Microbiol，2013，166（3/4）：639-644.
[7] DOWNEY E D，TAIT R G JR，MAYES M S，et al.An evaluation of circulating bovine viral diarrhea virus type 2 maternal antibody level and response to vaccination in Angus calves[J].J Anim Sci，2013，91（9）：4440-4450.
[8] ZHU L Q，REN M，LIN Y Q.Identification of a bovine viral diarrhea virus 2 isolated from cattle in China[J].Acta Virol，2009，53（2）：131-134.
[9] 聂兆晶，田夫林，姜世金.一株2型牛病毒性腹泻病毒的分离鉴定及其在MDBK细胞上的克隆纯化[J].西北农业学报，2012，21（1）：21-25.
[10] 王伟利，肖成蕊，孟日增，等.牛病毒性腹泻病毒一步法RTPCR检测方法的建立[J].中国预防兽医学报，2007，29（10）：806-809.
[11] 郭春娟，吴星星，王璐，等.牛病毒性腹泻病毒通用型RTPCR检测方法的建立[J].新疆农业大学学报，2012，35（3）：217-221.
[12] BACHOFEN C，WILLOUGHBY K，ZADOKS R，et al.Direct RTPCR from serum enables fast and costeffective phylogenetic analysis of bovine viral diarrhoea virus[J].J Virol Methods，2013，190（1/2）：1-3.
[13] 祖立闯，王金良，李娇，等.牛病毒性腹泻病毒套式RTPCR检测方法的建立及初步应用[J].中国兽医学报，2010，32（12）：1598-1601.
[14] 熊浩，季新成，王克栋，等.牛病毒性腹泻病毒基因分型双重RTPCR方法的建立[J].中国动物检疫，2013，30（4）：39-42.
[15] 王克栋，熊浩，季新成，等.牛病毒性腹泻病毒1型和2型双重RTPCR检测方法的建立[J].动物医学进展，2013，34（10）：21-25.
[16] 任艳，陈创夫，乔军，等.牛病毒性腹泻病毒实时定量RTPCR检测技术的建立及初步应用[J].畜牧兽医杂志，2010，29（5）：4-7.
[17] 陈其兵，薛霜，漆世华，等.牛病毒性腹泻-粘膜病病毒TaqMan荧光定量RTPCR检测方法的建立及初步应用[J].中国兽药杂志，2012，46（4）：4-6.
[18] 范晴，谢芝勋，刘加波，等.牛病毒性腹泻病毒RTLAMP检测方法的建立[J].生物技术通讯，2010，21（4）：248-251.
[19] FAN Q，XIE Z，XIE L，et al.A reverse transcription loopmediated isothermal amplification method for rapid detection of bovine viral diarrhea virus[J].J Virol Methods，2012，186（1/2）：43-48. [20] 蒋颖，林燕清，陶洁，等.抗牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体的制备及双抗夹心ELISA检测方法的建立[J].中国预防兽医学报，2012，34（12）：972-975.
[21] 杨俊兴，曹琛福，曾少灵，等.牛病毒性腹泻病毒双单克隆抗体夹心ELISA检测方法的建立及初步应用[J].动物医学进展，2013，29（5）：11-16.
[22] 柴顺秀，马花，韩英，等.牛病毒性腹泻病毒重组E2蛋白PPAELISA方法的建立及临床应用[J].动物医学进展，2013，30（6）：106-110.
[23] MAYERS J，SAWYER J.Development and evaluation of a multiplex enzymelinked immunosorbent assay for the detection of antibodies to bovine respiratory diseases on the Meso Scale Discovery platform[J].J Vet Diagn Invest，2012，24（4）：725-729.
[24] LANYON S R，ANDERSON M L，BERGMAN E，et al.Validation and evaluation of a commercially available ELISA for the detection of antibodies specific to bovine viral diarrhoea virus （bovine pestivirus）[J].Aust Vet J，2013，91（1/2）：52-56.
[25] GONDA M G，FANG X，PERRY G A，et al.Measuring bovine viral diarrhea virus vaccine response：using a commercially available ELISA as a surrogate for serum neutralization assays[J].Vaccine，2012，30（46）：6559-6563.
[26] 张宁，秦建华，赵博伟，等.牛病毒性腹泻一黏膜病病毒斑点免疫金银染色检测法的建立[J].中国兽医杂志，2009，45（1）：26-27.
关键词牛病毒性腹泻病毒；抗原；抗体；分子生物学；免疫学；检测方法；研究进展
中图分类号S852.65+3文献标识码A文章编号0517-6611（2014）18-05876-03
牛病毒性腹泻（Bovine viral diarrhea，BVD）是由牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）引起的以牛发热、粘膜糜烂溃疡、腹泻、咳嗽、母牛流产、繁殖障碍为主要特征的持续性感染病，是导致牛生产性能下降的主要疫病之一，呈世界性分布，给全球养牛业带来巨大的经济损失，我国养牛比较发达地区几乎都存在该病的感染[1-4]。BVDV为黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestivirus）的代表种，根据其5’端非翻译区核酸序列分为基因I型和II型[5]。BVDVI和BVDVII所引起的临床症状、发病特点及致病性明显不同，BVDVI常引起过性发热、下痢和急慢性粘膜病[6]；BVDVII在临床上常表现为发烧、腹泻、出血、呼吸失调、可引起怀孕母牛流产、死胎和新生小牛的先天畸形，对牛的致死率较高，危害性更为严重[7]。我国BVDV的主要流行毒株为BVDVI型，但近年来分离与鉴定到BVDVII型的报道逐渐增多[8-9]。只有研制快速、准确、灵敏和特异的BVDV检测方法并将其推广应用，才能更好地诊断和控制该病。BVDV的常用诊断方法有病毒分离、电镜检查、中和试验、琼脂扩散试验和免疫荧光等，这些方法不仅操作繁琐、复杂耗时、难以实现快速诊断，而且敏感性均较低，对处于免疫耐受和持续性感染牛容易出现漏检。随着现代分子生物学与免疫学技术的快速发展与应用，BVDV新型抗原抗体检测方法不断发展和完善。笔者就近年来针对BVDV的RTPCR、荧光定量RTPCR、RTLAMP、ELISA和胶体金技术等抗原抗体新型检测方法进行了综述，以期为不同实验室寻找适合的诊断方法以及发展新型诊断方法提供参考，为我国牛病毒性腹泻病的综合防控提供合理的科学依据。
1牛病毒性腹泻病毒的抗原检测方法
1.1RTPCR
1.1.1通用性RTPCR及套式RTPCR。王伟利等根据BVDV 5’端非编码区（5’UTR）设计合成l对特异性引物，建立检测BVDV的RTPCR方法，该方法对3株BVDV毒株的检测均为阳性，对牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）、猪瘟病毒（CSFV）、牛轮状病毒（BRV）、牛冠状病毒（BCV）的检测结果均呈阴性，与病毒分离试验的符合率达100%[10]。该方法特异性强，敏感性高，可以用于临床BVDV的检测及流行病学调查。郭春娟等建立了检测BVDV I型和Ⅱ型抗原的通用RTPCR方法，该方法检测BVDV I型和II型标准毒株均呈阳性，检测IBRV、CSFV、蓝舌病病毒（BTV）、口蹄疫病毒（FMDV）、MDBK细胞均呈阴性，检测的灵敏度为10-1TCID50/ml，检测400份临床样品，阳性检出率为10.75%[11]，明显高于ELISA检测结果。该方法具有特异、灵敏、高效、快速、重复性好等特点，为BVDV的检疫、诊断及流行病学调查提供了一种有效的技术手段。Bachofen C等根据BVDV 5’UTR设计引物，建立了从牛的血清中进行BVDV检测一步RTPCR方法[12]，该方法放在1个96孔进行PCR扩增，提高了检测速度，降低成本、操作时间和潜在的污染，具有高通量、低成本等优点，值得推广应用。
祖立闯等根据BVDV 5' 非编码区，设计2对特异性引物，建立了检测BVDV的套式RTPCR方法，检测CSFV、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、MDBK 细胞、IBRV、猪伪狂犬病毒（PRV）均呈阴性，第1轮RTPCR检测灵敏度为1 pg，而套式RTPCR检测灵敏度达到0.1 pg。在临床51份样品的检测中，第1轮RTPCR 检测出阳性样品11份，而套式RTPCR检测出阳性样品22份[13]。套式RTPCR极大地提高了常规RTPCR检测方法的特异性和敏感性，可以准确快速检测出极低含量的BVDV，为BVDV的早期感染和持续感染提供了简单、实用的有效诊断方法。
1.1.2基因分型RTPCR。熊浩等比较并分析了BVDV I型和II型5’UTR，分别设计合成2对针对基因I型和II型的特异性检测引物，通过对RTPCR反应条件的优化建立了在同一反应体系中同时检测BVDV基因I型和Ⅱ型的双重RTPCR方法，该方法对2个基因型的病毒检测灵敏度均为2 TCID50，只比单重PCR的灵敏度降低了10倍，但具有较好的特异性和可重复性，对新疆5个不同牛场的175份流产牛全血和组织样品进行检测，共6份BVDVI型阳性，没有检测到BVDVII型[14]。王克栋等根据BVDV I型和II型5’UTR分别设计合成2对引物，根据牛3磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）基因设计合成1对引物，以牛GAPDH基因为内标建立了牛病毒性腹泻病毒分型与内标三重RTPCR检测方法，该方法的灵敏度为100 TCID50，与不加内标检测灵敏度相当[15]，经临床样品检测验证具有较好的特异性和重复性，可用来对牛病毒性腹泻病毒分型进行快速准确检测。多重PCR方法可在同一个体系中同时对BVDV I型和II型基因进行扩增，实现了对2个基因型的BVDV进行同步分型检测，大大节省了检测时间和检测成本，为临床中BVDVI和BVDVII的鉴别诊断和流行病学调查等研究提供了有效技术支持。
1.2荧光定量RTPCR任艳等以BVDV 5’UTR为参考，设计并优化1对特异的荧光定量PCR引物，建立一种快速、定量检测BVDV的荧光定量RTPCR方法，该方法的灵敏性比常规PCR高10倍，检测变异系数低于1%，检测25份不同地区采集的临床症状疑似BVDV感染的牛粪样品，阳性检出率为72%[16]。与病毒分离培养和电检观察相比，该方法具有快速、灵敏、特异、重复性好和能定量检测等优点，为实验室快速、准确检测BVDV奠定了基础。陈其兵等根据BVDV 5’UTR设计合成了1对特异性引物和1条TaqMan荧光探针，通过对反应条件和反应体系的优化建立了一种能快速定量检测BVDV的荧光定量RTPCR方法，该方法检测CSFV、PRRSV、MDBK细胞均呈阴性，病毒含量的最低检测限为103～104拷贝/ml，具有快速、特异、灵敏、重复性好等特点，可用于临床及科研中对BVDV的快速定量检测和肉类食品进出口检疫[17]。荧光定量RTPCR方法表现出更高的敏感性。荧光定量PCR检测方法与RTPCR检测方法相比其敏感性与特异性更高，可以对BVDV进行早期诊断，及时发现病源，且可以实现定量检测，具有广阔的开发应用前景。 1.3RTLAMP方法环介导等温扩增（Loopmediated isothermal amplification，LAMP）检测技术是在PCR方法上发展起来的新兴核酸检测技术，可在恒温条件下方便、快速、灵敏、特异的检测核酸，具有较高的临床实用性。范晴等根据BVDV5’UTR，在保守区的8个位点设计LAMP特异性引物，对反应条件和试剂浓度进行优化，建立BVDV的RTLAMP快速检测方法，该方法在63.5 ℃的恒温条件下65 min内即可完成检测，可通过观察浑浊度或加入染料后直接判定扩增结果。经检测发现牛结核杆菌、BRV、CSFV、IBRV均为阴性，灵敏度可以达到1拷贝/μl，是常规RTPCR的105倍[18]。Fan Q等建立了BVDV RTLAMP快速检测方法，该检测与其他牛病毒没有交叉反应，与荧光定量RTPCR方法同时检测88份临床样品，RTLAMP方法检测出阳性38份，荧光定量RTPCR方法检测出阳性39份，RTLAMP方法的灵敏度与荧光定量RTPCR方法相当，可用于基层BVDV临床病料的现场检测和快速诊断[19]。RTLAMP检测方法快速、成本低、特异性好、灵敏度高、尤其适用于基层和现场检测，为BVDV的检测提供了新的技术方法，对BVDV的有效防制具有重要意义。
1.4夹心ELISA方法蒋颖等将BVDV 890株（BVDVII型）病毒液浓缩并纯化后免疫BALB/c小鼠制备的单克隆抗体3D8为捕获抗体，单克隆抗体3F9经生物素标记后为检测抗体，建立检测BVDV的双抗体夹心ELISA方法，该方法检测BVDV 890株（BVDVII）、NADL株（BVDVI））、XJ04株（BVDVII）均呈阳性，检测CSFV、I型牛疱疹病毒（BHV1）、BRV均呈阴性，对BVDV抗原的最低检出量为84 ng/ml，检测35份临床病牛血清样品，检出阳性血清13份，与RTPCR的符合率达到94.29%[20]。该方法具有特异、灵敏、可靠、方便、快捷等特点，可广泛推广应用，为我国BVDV的监测提供了行之有效的技术手段。杨俊兴用纯化的BVDV作为抗原，经动物免疫、细胞融合、间接ELISA筛选和亚克隆，得到3株抗BVDV的单克隆抗体（2A6、2F4和5C9），选用2A6和5C9作为包被抗体，用辣根过氧化物酶（HRP）标记的单克隆抗体2F4作为夹心抗体，建立了检测发现BVDV的双单克隆抗体夹心ELISA方法，检测发现BVDV（I型和II型）呈阳性，检测CSFV、赤羽病病毒（AKV）、BRV、FMDV均呈阴性，该方法与RTPCR和商品化ELISA试剂盒的符合率分别为98.8%和99.0%[21]。该ELISA方法具有良好的特异性和敏感性，可以代替商品化ELISA试剂盒，可用于BVDV抗原快速检测和对大量样本的筛选。夹心ELISA检测方法将单克隆抗体的特异性和酶标记技术的敏感性有机地结合起来，能够在短时间内准确、快速、直接检测大批量样品中的BVDV抗原，明显优于病毒分离和免疫荧光等方法，而且具有半自动化的特点，更适合于各级兽医研究机构在大面积普查和流行病学调查中应用。
2牛病毒性腹泻病毒的抗体检测方法
2.1间接ELISA方法柴顺秀等用BVDV重组E2蛋白作为包被抗原，HRP标记葡萄球菌A蛋白（SPA）作为二抗，建立了检测BVDV血清抗体的E2PPAELISA方法，该方法检测CSFV、BCV、BRV阳性血清均呈阴性，灵敏度达1∶320，285份血清样本的阳性检出率为33.4%，与IDEXX ELISA试剂盒的检出率无明显差异[22]。该方法具有良好的重复性、敏感性和特异性，为BVDV的快速诊断和流行病学调查提供一种快速、简便的血清学诊断方法，适合规模化养牛场BVDV的抗体监测以及流行病学调查。Mayers J等建立了一种间接复合ELISA，可以同时检测BVDV、BHV1、牛副流感病毒3（BPV3）和牛呼吸道合胞体病毒（BRSV）抗体，减少了检测试剂的成本，并简化了试验操作[23]。Lanyon S R等对BVDV特异性抗体ELISA检测方法进行了临床应用和效果评价，采用ELISA和病毒中和试验同时检测125份牛血清样品，采用ELISA和AGP同时检测1 182份未免疫牛血清血清样品，ELISA方法与病毒中和试验的敏感性和特异性分别为967% 和97.1%，ELISA方法与琼扩试验相比，敏感性更高[24]。Gonda M G等利用BVDV ELISA抗体检测方法对BVDV疫苗免疫后的血清抗体效价进行了检测，结果表明ELISA方法可以用于BVDVI型和II型中和抗体的效价检测，评价疫苗免疫效果[25]。间接ELISA方法高通量、检测快速、操作简单，是目前常用的免疫学抗体诊断技术，可广泛用于BVDV的抗体检测和流行病学调查。
2.2胶体金方法张宁等利用BVDV标准毒株作为免疫原免疫健康家兔，制备抗BVDV高免血清，采用辛酸-硫酸胺法提纯免疫球蛋白IgG，同时采用鞣酸-柠檬酸三钠混合还原法制备5 nm胶体金颗粒。在电磁搅拌下，利用胶体金颗粒标记兔抗BVDV IgG制备金标抗体，采用双抗体夹心法建立了检测BVDV的斑点免疫金银染色方法（DotELISA），该方法检测CSFV、BRV、MDBK细胞、健康牛血样均为阴性，抗原最低检出量为0.335 μg/ml，该方法和AGP方法同时检测78份河北省不同地区采集腹泻奶牛血样品，DotIGSS和AGP的阳性检出率分别为58.97%和34.62%[26]，DotIGSS方法的阳性检出率明显高于AGP方法。胶体金标记技术具有快速、方便、简单、不需要昂贵仪器和专业人员、肉眼判读、试验结果易保存等优点，特别适合于基层兽医部门和养殖场推广应用，具有广阔的发展和推广应用前景，具有高度敏感性，非常适用于临床诊断和检疫。
3小结
牛病毒性腹泻是危害我国养牛业健康发展的主要疫病之一，加强其诊断技术研究与监测工作对BVDV综合防控措施的制定具有重要意义。对BVDV的检测要力争做到快速、敏感、准确，这对于感染动物的隔离与治疗以及对未感染动物快速采取预防措施都十分重要。目前，BVDV敏感、快速、特异的检测技术主要有针对病毒DNA的抗原检测技术和针对病毒产生抗体的抗体检测技术，抗体检测可以了解BVDV感染与发生进程，但动物在BVDV感染一定时间后才会产生抗体，因此抗体检测存在一定的滞后性和局限性。分子生物学等抗原检测方法可以敏感、特异地检测出病毒核酸，其中荧光定量RTPCR方法较RTPCR方法更加敏感，但该方法对试验试剂与机器要求较高，难以在普通实验室普及应用。RTLAMP方法操作简单、不需要特殊仪器设备，肉眼判读、特别适合于基层实验室应用。ELISA检测方法检测快速、高通量，适合用于大批量样品检测和大面积流行病学调查。总而言之，BVDV的各种抗原抗体检测方法均有优缺点，可根据检测实际选择2种或2种以上方法进行使用，相信随着分子生物学与免疫学技术的进一步发展与应用，牛病毒性腹泻病毒新型抗原抗体检测方法还会不断完善，从而为我国牛病毒性腹泻病的综合防控提供更加合理依据。 安徽农业科学2014年参考文献
[1] ALMEIDA L L，MIRANDA I C，HEIN H E，et al.Herdlevel risk factors for bovine viral diarrhea virus infection in dairy herds from Southern Brazil[J].Res Vet Sci，2013，95（3）：901-907.
[2] BACHOFEN C，BOLLINGER B，PETERHANS E，et al.Diagnostic gap in Bovine viral diarrhea virus serology during the periparturient period in cattle[J].J Vet Diagn Invest，2013，25（5）：655-661.
[3] KARAKAYA E，ALPAY G，YILMAZBASMECITOGLU G，et al.Perosomus elumbis in a Holstein calf infected with bovine viral diarrhea virus[J].Tierarztl Prax Ausg G Grosstiere Nutztiere，2013，41（6）：387-391.
[4] 王建领，付彤，刘杰，等.牛病毒性腹泻分子及血清流行病学研究进展[J].河南农业科学，2012，41（3）：7-11.
[5] RATTA B，YADAV B S，POKHRIYAL M，et al.Microarray chip based identification of a mixed infection of bovine herpesvirus 1 and bovine viral diarrhea 2 from Indian cattle[J].Curr Microbiol，2014，68（1）：127-131.
[6] KUTA A，POLAK M P，LARSKA M，et al.Predominance of bovine viral diarrhea virus 1b and 1d subtypes during eight years of survey in Poland[J].Vet Microbiol，2013，166（3/4）：639-644.
[7] DOWNEY E D，TAIT R G JR，MAYES M S，et al.An evaluation of circulating bovine viral diarrhea virus type 2 maternal antibody level and response to vaccination in Angus calves[J].J Anim Sci，2013，91（9）：4440-4450.
[8] ZHU L Q，REN M，LIN Y Q.Identification of a bovine viral diarrhea virus 2 isolated from cattle in China[J].Acta Virol，2009，53（2）：131-134.
[9] 聂兆晶，田夫林，姜世金.一株2型牛病毒性腹泻病毒的分离鉴定及其在MDBK细胞上的克隆纯化[J].西北农业学报，2012，21（1）：21-25.
[10] 王伟利，肖成蕊，孟日增，等.牛病毒性腹泻病毒一步法RTPCR检测方法的建立[J].中国预防兽医学报，2007，29（10）：806-809.
[11] 郭春娟，吴星星，王璐，等.牛病毒性腹泻病毒通用型RTPCR检测方法的建立[J].新疆农业大学学报，2012，35（3）：217-221.
[12] BACHOFEN C，WILLOUGHBY K，ZADOKS R，et al.Direct RTPCR from serum enables fast and costeffective phylogenetic analysis of bovine viral diarrhoea virus[J].J Virol Methods，2013，190（1/2）：1-3.
[13] 祖立闯，王金良，李娇，等.牛病毒性腹泻病毒套式RTPCR检测方法的建立及初步应用[J].中国兽医学报，2010，32（12）：1598-1601.
[14] 熊浩，季新成，王克栋，等.牛病毒性腹泻病毒基因分型双重RTPCR方法的建立[J].中国动物检疫，2013，30（4）：39-42.
[15] 王克栋，熊浩，季新成，等.牛病毒性腹泻病毒1型和2型双重RTPCR检测方法的建立[J].动物医学进展，2013，34（10）：21-25.
[16] 任艳，陈创夫，乔军，等.牛病毒性腹泻病毒实时定量RTPCR检测技术的建立及初步应用[J].畜牧兽医杂志，2010，29（5）：4-7.
[17] 陈其兵，薛霜，漆世华，等.牛病毒性腹泻-粘膜病病毒TaqMan荧光定量RTPCR检测方法的建立及初步应用[J].中国兽药杂志，2012，46（4）：4-6.
[18] 范晴，谢芝勋，刘加波，等.牛病毒性腹泻病毒RTLAMP检测方法的建立[J].生物技术通讯，2010，21（4）：248-251.
[19] FAN Q，XIE Z，XIE L，et al.A reverse transcription loopmediated isothermal amplification method for rapid detection of bovine viral diarrhea virus[J].J Virol Methods，2012，186（1/2）：43-48. [20] 蒋颖，林燕清，陶洁，等.抗牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体的制备及双抗夹心ELISA检测方法的建立[J].中国预防兽医学报，2012，34（12）：972-975.
[21] 杨俊兴，曹琛福，曾少灵，等.牛病毒性腹泻病毒双单克隆抗体夹心ELISA检测方法的建立及初步应用[J].动物医学进展，2013，29（5）：11-16.
[22] 柴顺秀，马花，韩英，等.牛病毒性腹泻病毒重组E2蛋白PPAELISA方法的建立及临床应用[J].动物医学进展，2013，30（6）：106-110.
[23] MAYERS J，SAWYER J.Development and evaluation of a multiplex enzymelinked immunosorbent assay for the detection of antibodies to bovine respiratory diseases on the Meso Scale Discovery platform[J].J Vet Diagn Invest，2012，24（4）：725-729.
[24] LANYON S R，ANDERSON M L，BERGMAN E，et al.Validation and evaluation of a commercially available ELISA for the detection of antibodies specific to bovine viral diarrhoea virus （bovine pestivirus）[J].Aust Vet J，2013，91（1/2）：52-56.
[25] GONDA M G，FANG X，PERRY G A，et al.Measuring bovine viral diarrhea virus vaccine response：using a commercially available ELISA as a surrogate for serum neutralization assays[J].Vaccine，2012，30（46）：6559-6563.
[26] 张宁，秦建华，赵博伟，等.牛病毒性腹泻一黏膜病病毒斑点免疫金银染色检测法的建立[J].中国兽医杂志，2009，45（1）：26-27.