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摘要：目的：本实验建立运动病模型，观察地芬尼多对运动病大鼠脑组织中三种酶活性的变化，并探讨其对运动病产生治疗作用的机制。方法：雄性SD大鼠40只，随机分5组，每天按实验方法刺激，实验第7天刺激结束后迅速断头处死，取大脑皮质、小脑皮质和脑干前庭区组织，放入液氮，转入-80℃冰箱备用。采用组织化学定位和图像定量分析方法，检测各组大鼠三部位脑组织中碱性磷酸酶（ALP）、K+-Na+-ATP酶及细胞色素氧化酶（CCO）活性。结果：运动病大鼠三部位脑组织中ALP活性显著升高、K+-Na+-ATP酶及CCO活性明显减低。使用地芬尼多后运动病大鼠三部位脑组织中ALP活性显著减低、而K+-Na+-ATP酶及CCO活性明显升高。结论：地芬尼多可能使脑血管紧张度降低，改善脑血流的分布，增加脑血流，调整脑细胞内CCO、ALP、K+-Na+-ATPase等酶的活性，增强脑细胞的兴奋性，减轻缺血再灌注性脑水肿，起到抗运动病的作用。
关键词：地芬尼多;大鼠;运动病
地芬尼多又名眩晕停，产品名称盐酸地芬尼多。本品能增加椎基底动脉血流量、调节前庭系统、抑制呕吐中枢，有抗眩晕及镇吐作用，可用于各种原因引起的眩晕症，如椎基底动脉供血不全、美尼尔病、植物神经功能紊乱、晕车运动病等。但是其对脑组织各种生化指标的影响尚未见任何报道。现在，应用增溶的专利技术（已申请中国专利及国际专利），先将地芬尼多制成水溶性超分子配合物，再加适宜的辅料制成口含片，可迅速发挥抗眩晕及镇吐作用，提高生物利用度等。本实验主要建立运动病模型，观察地芬尼多对运动病动物脑组织几种生化指标的变化，探讨地芬尼多对运动病产生治疗作用的机理
1材料和方法
1.1动物及分组
雄性SD大鼠40只、体质量200g±10g，购自湖北省实验动物中心，动物合格证号：SYXK（鄂）2003-0007，检疫后备用。单笼饲养，自由摄食水，饲养一周后开始实验。随机分5组，1个正常组（A组）、1个模型组（B组）和3个实验组（高、中、低剂量各1组，C组、D组、E组）
1.2药品与材料
地芬尼多湖南千金药业生产（国药准字H43020325）。碱性磷酸酶试剂盒（批号：060101）、Na+-K+-ATP酶试剂盒（批号：060101）、细胞色素氧化酶试剂盒（批号：060101）均购自南京建成生物工程研究所
1.3实验仪器
低温高速离心机（Backman）;电热恒温水温箱（上海医疗器械七厂）;721分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）
1.4实验性运动病模型的建立
参照文献方法[1]造模：将大鼠无束缚地放入旋转装置中的有机玻璃笼内，先顺时针方向加速度从16 o/S2加速至120o/S2，然后立即以45o/S2减速至0，马上逆时针再以16 o/S2加速至120o/S2，然后以45o/S2减速至0，如此反复。旋转时间分别为2h，除A组不接受旋转刺激外，其它各组处理相同，旋转刺激完成后动物放回饲养笼中
1.5实验性运动病模型大鼠模型
模型组和实验组大鼠腹腔注射，给药30min后给予2h的运动病刺激，连续3d，正常组不接受运动病刺激。每天观察动物接受刺激后的反应情况，第3d刺激结束后取动物迅速断头处死，冰上迅速分离脑组织，取出大鼠三部位脑组织，放入液氮，转入-80℃冰箱备用。
1.6酶细胞化学反应
将组织用2%多聚甲醛-0.5%戊二醛固定液（由pH1.40.1mol/L二甲砷酸纳缓冲液配成）于4℃固定1 h。二甲砷酸纳缓冲液洗后，液氮冷冻后两组样品并列放在一起，恒冷箱冷冻切片为10μm，分别进行Na+-K+-AT-Pase、ALP和CCO反应。用1%锇酸后固定1h，EPON812包埋，LKB超薄片机切片，不进行电子染色，直接在HITACHI-H300型电镜下观察。
1.7酶活性定量分析
采用XY-540型彩色图像分析系统定量分析，128×128像素点，每张切片随机测5次，酶切片反应至少测30次，以阳性反应面积（单位为?m2）作为酶反应强度的参数，取其平均值。
1.8统计学处理 实验数据以x±s表示，应用SPSS12.0统计软件进行方差分析。
2结果
2.1对大鼠大脑皮质三种酶活性影响
运动病大鼠大脑皮质Na+-K+-ATP酶、CCO阳性反应面积明显减小，ALP阳性反应面积增大;地芬尼多使运动病大鼠大脑皮质中Na+-K+-ATP酶、细胞色素氧化酶阳性反应面积明显增大，ALP阳性反应面积减小（表1）。
表1 大鼠大脑皮质三种酶活性的图像定量分析（x±s）
注：与正常组比较 ▲P<0.05 ▲▲P<0.01与运动病组相比*P<0.05 **P<0.01
2.2对大鼠脑干前庭区三种酶活性的影响
运动病大鼠脑干前庭区中Na+-K+-ATP酶、CCO阳性反应面积明显减小，ALP阳性反应面积增大;地芬尼多使运动病大鼠脑干前庭区中ALP、Na+-K+-ATP酶、细胞色素氧化酶阳性反应面积明显增大，ALP阳性反应面积减小（表2）。
表2大鼠脑干前庭区三种酶活性的图像定量分析（x±s）
注：与正常组比较 ▲P<0.05 ▲▲P<0.01与运动病组相比*P<0.05 **P<0.01
2.3对大鼠小脑皮质三种酶活性的影响
运动病大鼠小脑皮质中Na+-K+-ATP酶、CCO阳性反应面积明显减小，ALP阳性反应面积增大;地芬尼多使运动病大鼠小脑皮质区中ALP、Na+-K+-ATP酶、细胞色素氧化酶阳性反应面积明显增大，ALP阳性反应面积减小（表3）。
表3大鼠小脑皮质三种酶活性的图像定量分析（x±s）
注：与正常组比较 ▲P<0.05 ▲▲P<0.01与运动病组相比 *P<0.05**P<0.01
3讨论
运动病的发病机制迄今仍未完全明了，它的发作与大脑、血液、各级中枢的氧供及中枢神经递质功能状态有一定相关性，大脑和小脑皮质及脑干前庭区等中枢对运动病的发病有很大作用。ALP和Na+-K+-ATP酶反应产物主要定位于以上三部位细胞膜毛细血管内皮细胞膜上，也呈阳性反应。CCO反应产物主要定位于以上三部位脑细胞线粒体膜上。
旋转刺激可引起神经细胞膜Na+-K+-ATP酶活性下降，ALP活性上升，线粒体CCO活性下降。这可能表明旋转刺激引起Na+-K+泵效率明显下降，导致细胞膜外K+浓度上升，高浓度K+可打开神经细胞膜上电压依赖性Ca2+通道，导致Ca2+内流。神经细胞膜外高K+和细胞内高Na+浓度梯度是引起Ca2+内流和神经细胞兴奋性降低的一个重要因素，ALP活性上升可能与膜的通透性增加有关，同Ca2+内流亦相关。CCO活性降低同有氧代谢水平降低有关，这可能是脑血流量减少的一个重要因素[2]。
本实验应用组织化学定位方法和图像定量分析方法，研究表明，旋转刺激可引起大脑和小脑皮质及脑干前庭区神经细胞Na+-K+-ATP酶活性下降，ALP活性上升，線粒体CCO活性下降。用地芬尼多后，运动病大鼠三种脑组织ALP活性显著减低、Na+ - K+ -ATP酶及CCO活性明显升高。
综上所述，地芬尼多可能通过改善脑血流分布，调整细胞内CCO、ALP、Na+-K+-AT酶和ALP等一系列酶活性，增强脑细胞的兴奋性，从而保持中枢神经系统兴奋性，起到抗运动病的作用。
参考文献：
[1]姜正林，沈洪妹，杨凯等.大鼠运动病模型-条件性厌食症的建立[J].中国航海医学杂志，2000，7（2）：97-100
[2]王琰，徐根兴，董文度等.模拟运动病Ca2+内流机制探讨[J].中国航海医学杂志，2002，12（4）：197-200
关键词：地芬尼多;大鼠;运动病
地芬尼多又名眩晕停，产品名称盐酸地芬尼多。本品能增加椎基底动脉血流量、调节前庭系统、抑制呕吐中枢，有抗眩晕及镇吐作用，可用于各种原因引起的眩晕症，如椎基底动脉供血不全、美尼尔病、植物神经功能紊乱、晕车运动病等。但是其对脑组织各种生化指标的影响尚未见任何报道。现在，应用增溶的专利技术（已申请中国专利及国际专利），先将地芬尼多制成水溶性超分子配合物，再加适宜的辅料制成口含片，可迅速发挥抗眩晕及镇吐作用，提高生物利用度等。本实验主要建立运动病模型，观察地芬尼多对运动病动物脑组织几种生化指标的变化，探讨地芬尼多对运动病产生治疗作用的机理
1材料和方法
1.1动物及分组
雄性SD大鼠40只、体质量200g±10g，购自湖北省实验动物中心，动物合格证号：SYXK（鄂）2003-0007，检疫后备用。单笼饲养，自由摄食水，饲养一周后开始实验。随机分5组，1个正常组（A组）、1个模型组（B组）和3个实验组（高、中、低剂量各1组，C组、D组、E组）
1.2药品与材料
地芬尼多湖南千金药业生产（国药准字H43020325）。碱性磷酸酶试剂盒（批号：060101）、Na+-K+-ATP酶试剂盒（批号：060101）、细胞色素氧化酶试剂盒（批号：060101）均购自南京建成生物工程研究所
1.3实验仪器
低温高速离心机（Backman）;电热恒温水温箱（上海医疗器械七厂）;721分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）
1.4实验性运动病模型的建立
参照文献方法[1]造模：将大鼠无束缚地放入旋转装置中的有机玻璃笼内，先顺时针方向加速度从16 o/S2加速至120o/S2，然后立即以45o/S2减速至0，马上逆时针再以16 o/S2加速至120o/S2，然后以45o/S2减速至0，如此反复。旋转时间分别为2h，除A组不接受旋转刺激外，其它各组处理相同，旋转刺激完成后动物放回饲养笼中
1.5实验性运动病模型大鼠模型
模型组和实验组大鼠腹腔注射，给药30min后给予2h的运动病刺激，连续3d，正常组不接受运动病刺激。每天观察动物接受刺激后的反应情况，第3d刺激结束后取动物迅速断头处死，冰上迅速分离脑组织，取出大鼠三部位脑组织，放入液氮，转入-80℃冰箱备用。
1.6酶细胞化学反应
将组织用2%多聚甲醛-0.5%戊二醛固定液（由pH1.40.1mol/L二甲砷酸纳缓冲液配成）于4℃固定1 h。二甲砷酸纳缓冲液洗后，液氮冷冻后两组样品并列放在一起，恒冷箱冷冻切片为10μm，分别进行Na+-K+-AT-Pase、ALP和CCO反应。用1%锇酸后固定1h，EPON812包埋，LKB超薄片机切片，不进行电子染色，直接在HITACHI-H300型电镜下观察。
1.7酶活性定量分析
采用XY-540型彩色图像分析系统定量分析，128×128像素点，每张切片随机测5次，酶切片反应至少测30次，以阳性反应面积（单位为?m2）作为酶反应强度的参数，取其平均值。
1.8统计学处理 实验数据以x±s表示，应用SPSS12.0统计软件进行方差分析。
2结果
2.1对大鼠大脑皮质三种酶活性影响
运动病大鼠大脑皮质Na+-K+-ATP酶、CCO阳性反应面积明显减小，ALP阳性反应面积增大;地芬尼多使运动病大鼠大脑皮质中Na+-K+-ATP酶、细胞色素氧化酶阳性反应面积明显增大，ALP阳性反应面积减小（表1）。
表1 大鼠大脑皮质三种酶活性的图像定量分析（x±s）
注：与正常组比较 ▲P<0.05 ▲▲P<0.01与运动病组相比*P<0.05 **P<0.01
2.2对大鼠脑干前庭区三种酶活性的影响
运动病大鼠脑干前庭区中Na+-K+-ATP酶、CCO阳性反应面积明显减小，ALP阳性反应面积增大;地芬尼多使运动病大鼠脑干前庭区中ALP、Na+-K+-ATP酶、细胞色素氧化酶阳性反应面积明显增大，ALP阳性反应面积减小（表2）。
表2大鼠脑干前庭区三种酶活性的图像定量分析（x±s）
注：与正常组比较 ▲P<0.05 ▲▲P<0.01与运动病组相比*P<0.05 **P<0.01
2.3对大鼠小脑皮质三种酶活性的影响
运动病大鼠小脑皮质中Na+-K+-ATP酶、CCO阳性反应面积明显减小，ALP阳性反应面积增大;地芬尼多使运动病大鼠小脑皮质区中ALP、Na+-K+-ATP酶、细胞色素氧化酶阳性反应面积明显增大，ALP阳性反应面积减小（表3）。
表3大鼠小脑皮质三种酶活性的图像定量分析（x±s）
注：与正常组比较 ▲P<0.05 ▲▲P<0.01与运动病组相比 *P<0.05**P<0.01
3讨论
运动病的发病机制迄今仍未完全明了，它的发作与大脑、血液、各级中枢的氧供及中枢神经递质功能状态有一定相关性，大脑和小脑皮质及脑干前庭区等中枢对运动病的发病有很大作用。ALP和Na+-K+-ATP酶反应产物主要定位于以上三部位细胞膜毛细血管内皮细胞膜上，也呈阳性反应。CCO反应产物主要定位于以上三部位脑细胞线粒体膜上。
旋转刺激可引起神经细胞膜Na+-K+-ATP酶活性下降，ALP活性上升，线粒体CCO活性下降。这可能表明旋转刺激引起Na+-K+泵效率明显下降，导致细胞膜外K+浓度上升，高浓度K+可打开神经细胞膜上电压依赖性Ca2+通道，导致Ca2+内流。神经细胞膜外高K+和细胞内高Na+浓度梯度是引起Ca2+内流和神经细胞兴奋性降低的一个重要因素，ALP活性上升可能与膜的通透性增加有关，同Ca2+内流亦相关。CCO活性降低同有氧代谢水平降低有关，这可能是脑血流量减少的一个重要因素[2]。
本实验应用组织化学定位方法和图像定量分析方法，研究表明，旋转刺激可引起大脑和小脑皮质及脑干前庭区神经细胞Na+-K+-ATP酶活性下降，ALP活性上升，線粒体CCO活性下降。用地芬尼多后，运动病大鼠三种脑组织ALP活性显著减低、Na+ - K+ -ATP酶及CCO活性明显升高。
综上所述，地芬尼多可能通过改善脑血流分布，调整细胞内CCO、ALP、Na+-K+-AT酶和ALP等一系列酶活性，增强脑细胞的兴奋性，从而保持中枢神经系统兴奋性，起到抗运动病的作用。
参考文献：
[1]姜正林，沈洪妹，杨凯等.大鼠运动病模型-条件性厌食症的建立[J].中国航海医学杂志，2000，7（2）：97-100
[2]王琰，徐根兴，董文度等.模拟运动病Ca2+内流机制探讨[J].中国航海医学杂志，2002，12（4）：197-200