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摘要 [目的]研究蒸蛋糕在貯藏过程中的微生物变化，探索延长其保质期的方法。[方法]采用基因测序的方法对蒸蛋糕贮藏过程中的微生物多样性和主要微生物菌群进行了分析，并研究了脱氢乙酸钠、丙酸钙和山梨酸钾3种防腐剂对蒸蛋糕保质期的影响。[结果]蒸蛋糕在贮藏过程中主要的腐败是表皮霉变，在蒸蛋糕的贮藏过程中主要的细菌为Staphylococcus和Kocuria；主要的霉菌为Penicillium、Cladosporium和Aspergillus；3种防腐剂都可以抑制微生物的繁殖速度，防霉变的能力大小依次为脱氢乙酸钠、丙酸钙、山梨酸钾。[结论]研究可为延长蒸蛋糕的保质期提供理论依据和技术参考。
关键词 蒸蛋糕；防腐保鲜；微生物菌群；分子生物学分析
中图分类号 TS201.3 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）18-0091-06
Abstract [Objective] The changes of microorganism were investigated for steamed cakes during storage， the method to extend the shelf life was explored.[Method] The diversitiy and major strains of microbial community were analyzed using gene sequencing biological methodolodgy， and the effects of three kinds of antiseptic on shelf life of steamed cake， such as dehydrogenation sodium acetate， calcium propionate and potassium sorbate， were studied.[Result] The spoilage of steamed cake mainly occurred in skin or outer surface of steamed cake product.The main strains of bacteria were found to be Staphylococcus and Kocuria.The main mold strains included Penicillium， Cladosporiumand， and Aspergillus， which were found to be predominate in steamed cake during storage.Three kinds of preservatives used could extend the shelf life of steamed cake， and the effect of dehydrogenation sodium acetic acid was best， then propionic acid calcium， potassium sorbate had the least effect.[Conclusion] This research can provide theoretical basis and technical reference for extending the shelf life of steamed cake.
Key words Steamed cake；Preservation；Microbial colony；Molecular biological analysis
蛋糕是一種传统的西点，其质地柔软、富有弹性、具浓郁香味、易消化，深受消费者的喜爱 [1]。随着人们生活水平的提高，消费市场对蛋糕提出了更高的要求，因此蛋糕的研究在国内外也已成热点，且主要集中在蛋糕配方[2-6]、品质[7-9]和保质期[9-12]等方面。
为了满足消费者的需求，近年来在我国市场上出现了具有我国传统特色的蛋糕——蒸蛋糕，因其组织细腻、弹性好、口感绵软、入口即化且采用蒸制工艺，所以广受现代人的追捧。但是蒸蛋糕含水量高达28%～30%，几乎是烤制蛋糕的2倍[13]，是糕点中最难贮存的品种之一，因此蒸蛋糕的防霉保鲜值得重视和深入研究。目前，国内外对于蒸蛋糕领域的研究报道极少[13-14]，对蒸蛋糕的微生物菌群进行分析，提高蒸蛋糕安全性的研究还鲜见报道。
笔者通过PCR分子生物学的方法探索蒸蛋糕中微生物的生长及菌群变化，通过添加丙酸钙、山梨酸钾和脱氢乙酸钠，寻找最适合蒸蛋糕防腐保鲜的添加剂，从而为蒸蛋糕保质期的研究提供理论依据，延长蒸蛋糕的保质期。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 原材料与主要试剂。
低筋粉，江苏省南顺食品有限公司；白砂糖和奶粉，福临门食品有限公司；鸡蛋和盐，均为市售食品级；植物油，金龙鱼葵花籽油；菱友TM MFC-68，三菱化学食品有限公司；糖醇和丙三醇，珠海市宏泰生物科技有限公司；泡打粉，焙乐道公司；丙酸钙、山梨酸钾和脱氢乙酸钠，泰州市荣昌食品添加剂有限公司；菌落总数计数培养基、孟加拉红培养基、甘油、无水乙醇、异丙醇、琼脂、氯化钠、琼脂糖，国药集团化学有限公司；快捷型植物基因组DNA提取系统、PCR试剂，天根生化科技（北京）有限公司；16S rDNA的通用引物27F和1492R、2616S rDNA的通用引物NL1A和NL4B，上海桑尼公司合成。
1.1.2 主要仪器设备。
KitchenAid 打蛋器；美的中式电蒸锅；SM-25搅拌机；苏州安泰净化工作台SW-CJ-2F，苏州安泰净化公司；APX-150C型恒温恒湿培养箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；JY20002型电子天平，上海良平仪器仪表有限公司；NanoDrop2000分光度计、Legend Micro17型离心机，Thermo公司；PCR仪（T100 Thermal Cycler）、Power pac核酸电泳仪、Geldoc 2000凝胶成像仪，Bio-Rad。 1.2 方法
1.2.1 蒸蛋糕的制作。根據表1中的配方准确称取各种原料，首先将除低筋粉、奶粉和植物油的所有原料搅拌均匀，然后加入低筋粉和奶粉高速打发，最后加入植物油搅拌均匀。将搅拌好的面糊分装到模具中在蒸锅中蒸熟即可。室温冷却2 h后装入塑封袋中，放置在恒温保湿箱中（温度30 ℃，湿度70%）贮藏待用[15]。
1.2.2 菌落总数和霉菌计数。
菌落总数的测定按GBT4789.2—2010《食品微生物学检验菌落总数测定》[16]。
无菌操作下取25 g蒸蛋糕，加入225 mL无菌水中，振荡器振荡30 min，再取1 mL稀释液加入9 mL无菌水中，依次稀释成10-1、10-2、10-3倍稀释液，分别取0.1 mL稀释液接种到菌落总数培养基和营养琼脂培养基上，每个处理3次重复，置于恒温培养箱中37 ℃培养48 h，计数并挑取不同形态的单菌落。无菌操作下取不同形态的细菌单菌落于营养琼脂培养基上划线纯化[17]，纯化后的单菌落用于显微镜镜检和分子鉴定。
依据GB7099—2003《糕点、面包卫生标准》，对于热加工蛋糕，菌落总数≤1 500 CFU/g[18]。
霉菌的计数按GBT4789.15—2010《食品微生物学检验霉菌和酵母计数》[19]。
无菌操作下取25 g蒸蛋糕，加入225 mL无菌水中，振荡器振荡30 min，再取1 mL稀释液加入9 mL无菌水中，依次稀释成10-1、10-2、10-3倍稀释液，分别取0.1 mL稀释液接种到YPD和孟加拉红培养基上，每个处理3 次重复，置于恒温培养箱中28 ℃培养5 d，计数并挑取不同形态的单菌落。无菌操作下取不同形态的真菌单菌落于YPD和孟加拉红培养基上划线纯化[20]，纯化后的单菌落用于显微镜镜检和分子鉴定。
依据GB7099—2003《糕点、面包卫生标准》，对于热加工蛋糕，霉菌总数≤100 CFU/g[18]。
1.2.3 菌株的分离、纯化和保藏。
根据菌落形态和镜检结果，挑选出的不同形态的纯单菌落，接种到相应的液体培养基中，先在28 ℃下振荡培养24 h后，再与60%的甘油以1∶1进行保存，放置于-80 ℃的冰箱中保藏[20]。
1.2.4 菌株的鉴定。
1.2.4.1 细菌的鉴定。
将之前保存的菌株进行活化，经过24 h的活化后，取 5 μL上述菌液作为PCR扩增的模板，反应体系为50 μL：5 μL 10×Buffer（含 Mg2+ ），4 μL dNTPs，0.5 μL Easy Taq DNA酶（2.5 U/μL），引物 27F 、1492R（序列详见表2）各1 μL，ddH2O补足至50 μL。
细菌 16S rRNA基因扩增条件为 95 ℃预变性 3 min 后进入 30 个循环：95 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，72 ℃延伸 5 min，12 ℃ 5 min。
用1%琼脂糖凝胶电泳检测上述得到 PCR产物的纯度。纯度达到要求的 PCR扩增产物寄至测序公司测序。 然后采用DNAstar软件对得到的序列进行拼接，将拼接好的序列与 GenBank中已知 16S rRNA序列进行同源性比对，同源性达到99%及以上的菌株可直接鉴定至种。
根据试验所得的比对结果，将相应菌株的模式菌株的序列下载，然后用MEGA 5.05软件构建分离菌株的系统发育树，对分离出的细菌与模式菌株的亲缘关系进行分析。
1.2.4.2 真菌的鉴定。
真菌采用玻璃珠法破壁[21]，并用真菌基因组试剂盒提取分离自蒸蛋糕中的酵母菌和霉菌DNA。用微量紫外分光光度计检测上述真菌的DNA原液的OD比值（A260 nm/A280 nm）及浓度，将合格者的DNA原液于-20 ℃保存待用。
取200～500 ng/μL上述真菌DNA原液作为PCR扩增的模板，反应体系为 50.0 μL：5.0 μL 10×Buffer（含 Mg2+ ），4.0 μL dNTPs，0.5 μL Easy Taq DNA酶（2.5 U/μL），引物NL1A、NL4B（序列详见表 2）各1.5 μL，ddH2O补足至50.0 μL。
真菌26S rDNA基因扩增条件为 94 ℃预变性 1 min 后进入 30 个循环：94 ℃ 1min，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，72 ℃延伸 7 min，12 ℃保持5 min。
用1%琼脂糖凝胶电泳检测上述得到PCR产物的纯度，纯度达到要求的PCR扩增产物寄至测序公司测序。然后采用DNAstar软件对得到的序列进行拼接，将拼接好的序列与GenBank中已知序列进行同源性比对，同源性达到 99%及以上的菌株可直接鉴定至种。
根据试验所得的比对结果，将相应菌株的模式菌株的序列下载，然后用MEGA 5.05软件构建分离菌株的系统发育树[22]，对分离出的细菌与模式菌株的亲缘关系进行分析。
1.2.5 防腐剂对蒸蛋糕的影响。
蒸蛋糕的制作如前所述，丙酸钙按照推荐使用量2.5 g/kg进行添加；脱氢乙酸钠按照推荐使用量0.5 g/kg进行添加；山梨酸钾按照推荐使用量1.0 g/kg进行添加，添加量都以低筋粉的量计算。添加方法是在调制面糊时，将添加剂直接添加到面粉中[23]。
1.3 数据分析
采用Excel 2010、MEGA 5.05软件和DNAstar软件对数据进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 蒸蛋糕贮藏过程中的微生物变化
在不添加防腐剂的情况下，蒸蛋糕贮藏过程中微生物的变化见表3。 從表3的数据分析可知，蒸蛋糕采用保鲜袋密封包装，在温度为30 ℃、湿度为70%条件下贮存时，蒸蛋糕的细菌数目和霉菌数目呈快速增长趋势，蒸蛋糕的细菌数目贮存第3天测定为25 700 CFU/g，超过GB7099—2003 中规定的热加工食品时细菌计数（<1 500 CFU/g）的标准；霉菌计数为100 CFU/g，达到GB7099—2003中规定的热加工食品时霉菌计数（≤100 CFU/g）的标准上限，蛋糕表面有霉点出现，但是蒸蛋糕内部并无霉菌或菌丝出现。由此可知，蒸蛋糕的主要腐败是发生在表皮，且以发霉变质为主。这与丘德生[24]报道的糕点中主要腐败是发霉变质的结果一致。
2.2 菌种鉴定
2.2.1 细菌的鉴定。
将分离的细菌进行16S rDNA特异性扩增，扩增所用引物为27F、1492R，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测其纯度，检测的部分结果见图1。由图1可见，泳道约1 500 bp的位置均出现1条亮带，且无弥散、拖尾和非特异性现象，符合下一步的测序要求。
将符合要求的扩增产物寄往测序公司进行测序，将测序结果拼接后，与基因库中序列进行同源性对比，对比得到与待测菌株同源性最为接近的已知种属的序列，同源性达到99%及以上的菌株可直接鉴定至种。其对比结果见表4。
由表4的数据分析可知，从蒸蛋糕中总共分离出7种细菌，依次为Staphylococcus warneri、Staphylococcus epidermidis、 Staphylococcus haemolyticus、Kocuriarhizophila、Bacillus tequilensis、Lactobacillus plantarum和Gluconobacter japonicas。其中Staphylococcus warneri和Staphylococcus epidermidis是蒸蛋糕在贮藏过程中的优势菌群，Kocuriarhizophila 次之，其他的几种菌株都非常少。在蒸蛋糕的贮藏过程中，刚开始的优势细菌是Staphylococcus warneri和Staphylococcus epidermidis，后期主要的细菌为Kocuriarhizophila，这与Ji等[25]对米糕的微生物特性的研究中，米糕在贮藏过程中刚开始的优势菌群是球菌，而后转化为杆菌的研究结果相一致。
根据 NCBI同源性比对结果，下载相应模式菌株的序列，从每个分离自蒸蛋糕的菌种中随机选取1株，用软件MEGA 5.05构建系统发育树（图 2），对分离菌株和模式菌株之间的亲缘关系进行研究 。
从图2中的系统发育树可以看出共检测到5个属：Staphylococcus、Kocuria、Bacillus、Gluconobacter和Lactobacillus。因此，Y9、Y10、Y11、Y13、B7、B8、B9、B16、W、Y和B21形成了第1个类群；Y3、B2和Y5各单独形成一个类群；Y2、B14、B15、B17和B22形成了一个类群。以上分离菌株与相对应的模式菌都聚在一起，且同源性都在 99%以上，说明细菌 16S rRNA 基因序列分析结果具有非常高的可信性 。
2.2.2 真菌的鉴定。
将分离的酵母菌和霉菌进行26S rDNA特异性扩增，扩增所用引物为NL1A、NL4B，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测其纯度，检测的部分结果见图3。由图3可见，泳道约600 bp的位置均出现1条亮带，且无弥散、拖尾和非特异性现象，符合下一步的测序要求。
将符合要求的扩增产物寄往测序公司进行测序，将测序结果拼接后，与基因库中序列进行同源性对比，对比得到与待测菌株同源性最为接近的已知种属的序列，同源性达到99%及以上的菌株可直接鉴定至种。其对比结果见表5。
由表5数据分析可知，从蒸蛋糕中总共分离出11种真菌：1种酵母，为Saccharomyces cerevisiae；10种霉菌，依次为Penicilliumcorylophilum、Penicilliumchrysogenum、Penicilliumbrevicompactum、Penicilliumoxalicum strain、Alternariaalternata、Aspergillus flavus、Aspergillus niger、Cladosporiumsphaerospermum、Aspergillus sydowii和Aspergillus versicolor。其中Penicillium和Aspergillus是蒸蛋糕在贮藏过程中的优势菌群。Legan等[26]发现，面包中的霉菌主要有Aspergillus、Eurotium、Penicillium、Cladosporium；Baek等[27]发现，Cladosporium、Neurospora和Penicillium是烘焙和米制品中的主要霉菌，这与笔者研究的结果基本吻合，说明烘焙食品中的主要腐败霉菌是大致相同的。Ji等[25]报道，P.citreoviride和P.citrinum是我国传统的米糕中主要的霉菌；Ryan 等[28]发现，青霉是面包霉变的主要霉菌。这些都与该试验的研究结果相一致，说明糕点类食品的主要霉变霉菌为青霉属。
根据 NCBI同源性比对结果，下载相应模式菌株的序列，从每个分离自蒸蛋糕的菌种中随机选取1株，用软件MEGA 5.05构建系统发育树（图4、5），对分离菌株和模式菌株之间的亲缘关系进行研究。
从图4中的系统发育树可以看出，共检测到1个属：Saccharomyces cerevisiae，因此Y6和Y18形成了一个类群。以上分离菌株与相对应的模式菌都聚在一起，且同源性都在 99% 以上，说明真菌26S rDNA 基因序列分析结果具有非常高的可信性 。 从图5中的系统发育树可以看出，共检测到4个属：Penicillium、 Alternaria、Aspergillus和Cladosporium。因此，D、SG和S6形成了一个类群；Y、S6、S17和H形成一个类群；B单独形成一个类群；S01和XH形成了一个类群；S3单独形成一个类群。以上分离菌株与相对应的模式菌都聚在一起，且同源性都在 99%以上，说明真菌26S rDNA 基因序列分析结果具有非常高的可信性。
2.3 防腐剂对蒸蛋糕的影响
2.3.1 细菌数的变化。
从表6的数据分析可知，第3天时空白和添加防腐剂的蒸蛋糕的菌落总数虽都已超过GB7099—2003 中规定的热加工食品时细菌计数（<1 500 CFU/g）的标准，但添加防腐剂的蒸蛋糕的细菌数都小于空白，说明防腐剂可以抑制蒸蛋糕中微生物的生长。第5天时添加防腐剂的蒸蛋糕的细菌数均大于空白，原因可能是由于空白的蒸蛋糕的霉菌的生长抑制了细菌的生长。
2.3.2 霉菌数的变化。
从表7的数据分析可知，添加防腐剂的蒸蛋糕的霉菌数都小于空白。第3天时空白的霉菌数超过GB7099—2003中规定的热加工食品时霉菌计数（≤100 CFU/g）的标准，而添加防腐剂的蒸蛋糕的霉菌均小于国标值。由此可见，3种防腐剂对蒸蛋糕的霉菌都有抑制作用，且3种防腐剂对蒸蛋糕霉变的影响大小依次为脱氢乙酸钠、丙酸钙、山梨酸钾。说明脱氢乙酸钠对蒸蛋糕的防霉变效果最好，这与林真等[29]对千层蛋糕的研究结果相一致。
3 结论
（1）该研究结果表明，蒸蛋糕主要是由于表皮霉变造成腐败的，初期主要的腐败霉菌是青霉菌和球孢枝孢，后期主要的腐败霉菌是黑曲霉和黄曲霉。
（2）应用分子测序技术对蒸蛋糕中的腐败微生物构成进行了初步分析，从蒸蛋糕中总共分析到细菌7种，真菌11种。
（3）分析结果表明，Staphylococcus和Kocuriarhizophila是蒸蛋糕腐败中的优势细菌，Penicillium、Aspergillus和Cladosporium是蒸蛋糕腐败中的优势霉菌。
（4）研究结果表明，脱氢乙酸钠对蒸蛋糕的防霉效果优于丙酸钙和山梨酸钾。
参考文献
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关键词 蒸蛋糕；防腐保鲜；微生物菌群；分子生物学分析
中图分类号 TS201.3 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）18-0091-06
Abstract [Objective] The changes of microorganism were investigated for steamed cakes during storage， the method to extend the shelf life was explored.[Method] The diversitiy and major strains of microbial community were analyzed using gene sequencing biological methodolodgy， and the effects of three kinds of antiseptic on shelf life of steamed cake， such as dehydrogenation sodium acetate， calcium propionate and potassium sorbate， were studied.[Result] The spoilage of steamed cake mainly occurred in skin or outer surface of steamed cake product.The main strains of bacteria were found to be Staphylococcus and Kocuria.The main mold strains included Penicillium， Cladosporiumand， and Aspergillus， which were found to be predominate in steamed cake during storage.Three kinds of preservatives used could extend the shelf life of steamed cake， and the effect of dehydrogenation sodium acetic acid was best， then propionic acid calcium， potassium sorbate had the least effect.[Conclusion] This research can provide theoretical basis and technical reference for extending the shelf life of steamed cake.
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笔者通过PCR分子生物学的方法探索蒸蛋糕中微生物的生长及菌群变化，通过添加丙酸钙、山梨酸钾和脱氢乙酸钠，寻找最适合蒸蛋糕防腐保鲜的添加剂，从而为蒸蛋糕保质期的研究提供理论依据，延长蒸蛋糕的保质期。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 原材料与主要试剂。
低筋粉，江苏省南顺食品有限公司；白砂糖和奶粉，福临门食品有限公司；鸡蛋和盐，均为市售食品级；植物油，金龙鱼葵花籽油；菱友TM MFC-68，三菱化学食品有限公司；糖醇和丙三醇，珠海市宏泰生物科技有限公司；泡打粉，焙乐道公司；丙酸钙、山梨酸钾和脱氢乙酸钠，泰州市荣昌食品添加剂有限公司；菌落总数计数培养基、孟加拉红培养基、甘油、无水乙醇、异丙醇、琼脂、氯化钠、琼脂糖，国药集团化学有限公司；快捷型植物基因组DNA提取系统、PCR试剂，天根生化科技（北京）有限公司；16S rDNA的通用引物27F和1492R、2616S rDNA的通用引物NL1A和NL4B，上海桑尼公司合成。
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1.2.1 蒸蛋糕的制作。根據表1中的配方准确称取各种原料，首先将除低筋粉、奶粉和植物油的所有原料搅拌均匀，然后加入低筋粉和奶粉高速打发，最后加入植物油搅拌均匀。将搅拌好的面糊分装到模具中在蒸锅中蒸熟即可。室温冷却2 h后装入塑封袋中，放置在恒温保湿箱中（温度30 ℃，湿度70%）贮藏待用[15]。
1.2.2 菌落总数和霉菌计数。
菌落总数的测定按GBT4789.2—2010《食品微生物学检验菌落总数测定》[16]。
无菌操作下取25 g蒸蛋糕，加入225 mL无菌水中，振荡器振荡30 min，再取1 mL稀释液加入9 mL无菌水中，依次稀释成10-1、10-2、10-3倍稀释液，分别取0.1 mL稀释液接种到菌落总数培养基和营养琼脂培养基上，每个处理3次重复，置于恒温培养箱中37 ℃培养48 h，计数并挑取不同形态的单菌落。无菌操作下取不同形态的细菌单菌落于营养琼脂培养基上划线纯化[17]，纯化后的单菌落用于显微镜镜检和分子鉴定。
依据GB7099—2003《糕点、面包卫生标准》，对于热加工蛋糕，菌落总数≤1 500 CFU/g[18]。
霉菌的计数按GBT4789.15—2010《食品微生物学检验霉菌和酵母计数》[19]。
无菌操作下取25 g蒸蛋糕，加入225 mL无菌水中，振荡器振荡30 min，再取1 mL稀释液加入9 mL无菌水中，依次稀释成10-1、10-2、10-3倍稀释液，分别取0.1 mL稀释液接种到YPD和孟加拉红培养基上，每个处理3 次重复，置于恒温培养箱中28 ℃培养5 d，计数并挑取不同形态的单菌落。无菌操作下取不同形态的真菌单菌落于YPD和孟加拉红培养基上划线纯化[20]，纯化后的单菌落用于显微镜镜检和分子鉴定。
依据GB7099—2003《糕点、面包卫生标准》，对于热加工蛋糕，霉菌总数≤100 CFU/g[18]。
1.2.3 菌株的分离、纯化和保藏。
根据菌落形态和镜检结果，挑选出的不同形态的纯单菌落，接种到相应的液体培养基中，先在28 ℃下振荡培养24 h后，再与60%的甘油以1∶1进行保存，放置于-80 ℃的冰箱中保藏[20]。
1.2.4 菌株的鉴定。
1.2.4.1 细菌的鉴定。
将之前保存的菌株进行活化，经过24 h的活化后，取 5 μL上述菌液作为PCR扩增的模板，反应体系为50 μL：5 μL 10×Buffer（含 Mg2+ ），4 μL dNTPs，0.5 μL Easy Taq DNA酶（2.5 U/μL），引物 27F 、1492R（序列详见表2）各1 μL，ddH2O补足至50 μL。
细菌 16S rRNA基因扩增条件为 95 ℃预变性 3 min 后进入 30 个循环：95 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，72 ℃延伸 5 min，12 ℃ 5 min。
用1%琼脂糖凝胶电泳检测上述得到 PCR产物的纯度。纯度达到要求的 PCR扩增产物寄至测序公司测序。 然后采用DNAstar软件对得到的序列进行拼接，将拼接好的序列与 GenBank中已知 16S rRNA序列进行同源性比对，同源性达到99%及以上的菌株可直接鉴定至种。
根据试验所得的比对结果，将相应菌株的模式菌株的序列下载，然后用MEGA 5.05软件构建分离菌株的系统发育树，对分离出的细菌与模式菌株的亲缘关系进行分析。
1.2.4.2 真菌的鉴定。
真菌采用玻璃珠法破壁[21]，并用真菌基因组试剂盒提取分离自蒸蛋糕中的酵母菌和霉菌DNA。用微量紫外分光光度计检测上述真菌的DNA原液的OD比值（A260 nm/A280 nm）及浓度，将合格者的DNA原液于-20 ℃保存待用。
取200～500 ng/μL上述真菌DNA原液作为PCR扩增的模板，反应体系为 50.0 μL：5.0 μL 10×Buffer（含 Mg2+ ），4.0 μL dNTPs，0.5 μL Easy Taq DNA酶（2.5 U/μL），引物NL1A、NL4B（序列详见表 2）各1.5 μL，ddH2O补足至50.0 μL。
真菌26S rDNA基因扩增条件为 94 ℃预变性 1 min 后进入 30 个循环：94 ℃ 1min，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，72 ℃延伸 7 min，12 ℃保持5 min。
用1%琼脂糖凝胶电泳检测上述得到PCR产物的纯度，纯度达到要求的PCR扩增产物寄至测序公司测序。然后采用DNAstar软件对得到的序列进行拼接，将拼接好的序列与GenBank中已知序列进行同源性比对，同源性达到 99%及以上的菌株可直接鉴定至种。
根据试验所得的比对结果，将相应菌株的模式菌株的序列下载，然后用MEGA 5.05软件构建分离菌株的系统发育树[22]，对分离出的细菌与模式菌株的亲缘关系进行分析。
1.2.5 防腐剂对蒸蛋糕的影响。
蒸蛋糕的制作如前所述，丙酸钙按照推荐使用量2.5 g/kg进行添加；脱氢乙酸钠按照推荐使用量0.5 g/kg进行添加；山梨酸钾按照推荐使用量1.0 g/kg进行添加，添加量都以低筋粉的量计算。添加方法是在调制面糊时，将添加剂直接添加到面粉中[23]。
1.3 数据分析
采用Excel 2010、MEGA 5.05软件和DNAstar软件对数据进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 蒸蛋糕贮藏过程中的微生物变化
在不添加防腐剂的情况下，蒸蛋糕贮藏过程中微生物的变化见表3。 從表3的数据分析可知，蒸蛋糕采用保鲜袋密封包装，在温度为30 ℃、湿度为70%条件下贮存时，蒸蛋糕的细菌数目和霉菌数目呈快速增长趋势，蒸蛋糕的细菌数目贮存第3天测定为25 700 CFU/g，超过GB7099—2003 中规定的热加工食品时细菌计数（<1 500 CFU/g）的标准；霉菌计数为100 CFU/g，达到GB7099—2003中规定的热加工食品时霉菌计数（≤100 CFU/g）的标准上限，蛋糕表面有霉点出现，但是蒸蛋糕内部并无霉菌或菌丝出现。由此可知，蒸蛋糕的主要腐败是发生在表皮，且以发霉变质为主。这与丘德生[24]报道的糕点中主要腐败是发霉变质的结果一致。
2.2 菌种鉴定
2.2.1 细菌的鉴定。
将分离的细菌进行16S rDNA特异性扩增，扩增所用引物为27F、1492R，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测其纯度，检测的部分结果见图1。由图1可见，泳道约1 500 bp的位置均出现1条亮带，且无弥散、拖尾和非特异性现象，符合下一步的测序要求。
将符合要求的扩增产物寄往测序公司进行测序，将测序结果拼接后，与基因库中序列进行同源性对比，对比得到与待测菌株同源性最为接近的已知种属的序列，同源性达到99%及以上的菌株可直接鉴定至种。其对比结果见表4。
由表4的数据分析可知，从蒸蛋糕中总共分离出7种细菌，依次为Staphylococcus warneri、Staphylococcus epidermidis、 Staphylococcus haemolyticus、Kocuriarhizophila、Bacillus tequilensis、Lactobacillus plantarum和Gluconobacter japonicas。其中Staphylococcus warneri和Staphylococcus epidermidis是蒸蛋糕在贮藏过程中的优势菌群，Kocuriarhizophila 次之，其他的几种菌株都非常少。在蒸蛋糕的贮藏过程中，刚开始的优势细菌是Staphylococcus warneri和Staphylococcus epidermidis，后期主要的细菌为Kocuriarhizophila，这与Ji等[25]对米糕的微生物特性的研究中，米糕在贮藏过程中刚开始的优势菌群是球菌，而后转化为杆菌的研究结果相一致。
根据 NCBI同源性比对结果，下载相应模式菌株的序列，从每个分离自蒸蛋糕的菌种中随机选取1株，用软件MEGA 5.05构建系统发育树（图 2），对分离菌株和模式菌株之间的亲缘关系进行研究 。
从图2中的系统发育树可以看出共检测到5个属：Staphylococcus、Kocuria、Bacillus、Gluconobacter和Lactobacillus。因此，Y9、Y10、Y11、Y13、B7、B8、B9、B16、W、Y和B21形成了第1个类群；Y3、B2和Y5各单独形成一个类群；Y2、B14、B15、B17和B22形成了一个类群。以上分离菌株与相对应的模式菌都聚在一起，且同源性都在 99%以上，说明细菌 16S rRNA 基因序列分析结果具有非常高的可信性 。
2.2.2 真菌的鉴定。
将分离的酵母菌和霉菌进行26S rDNA特异性扩增，扩增所用引物为NL1A、NL4B，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测其纯度，检测的部分结果见图3。由图3可见，泳道约600 bp的位置均出现1条亮带，且无弥散、拖尾和非特异性现象，符合下一步的测序要求。
将符合要求的扩增产物寄往测序公司进行测序，将测序结果拼接后，与基因库中序列进行同源性对比，对比得到与待测菌株同源性最为接近的已知种属的序列，同源性达到99%及以上的菌株可直接鉴定至种。其对比结果见表5。
由表5数据分析可知，从蒸蛋糕中总共分离出11种真菌：1种酵母，为Saccharomyces cerevisiae；10种霉菌，依次为Penicilliumcorylophilum、Penicilliumchrysogenum、Penicilliumbrevicompactum、Penicilliumoxalicum strain、Alternariaalternata、Aspergillus flavus、Aspergillus niger、Cladosporiumsphaerospermum、Aspergillus sydowii和Aspergillus versicolor。其中Penicillium和Aspergillus是蒸蛋糕在贮藏过程中的优势菌群。Legan等[26]发现，面包中的霉菌主要有Aspergillus、Eurotium、Penicillium、Cladosporium；Baek等[27]发现，Cladosporium、Neurospora和Penicillium是烘焙和米制品中的主要霉菌，这与笔者研究的结果基本吻合，说明烘焙食品中的主要腐败霉菌是大致相同的。Ji等[25]报道，P.citreoviride和P.citrinum是我国传统的米糕中主要的霉菌；Ryan 等[28]发现，青霉是面包霉变的主要霉菌。这些都与该试验的研究结果相一致，说明糕点类食品的主要霉变霉菌为青霉属。
根据 NCBI同源性比对结果，下载相应模式菌株的序列，从每个分离自蒸蛋糕的菌种中随机选取1株，用软件MEGA 5.05构建系统发育树（图4、5），对分离菌株和模式菌株之间的亲缘关系进行研究。
从图4中的系统发育树可以看出，共检测到1个属：Saccharomyces cerevisiae，因此Y6和Y18形成了一个类群。以上分离菌株与相对应的模式菌都聚在一起，且同源性都在 99% 以上，说明真菌26S rDNA 基因序列分析结果具有非常高的可信性 。 从图5中的系统发育树可以看出，共检测到4个属：Penicillium、 Alternaria、Aspergillus和Cladosporium。因此，D、SG和S6形成了一个类群；Y、S6、S17和H形成一个类群；B单独形成一个类群；S01和XH形成了一个类群；S3单独形成一个类群。以上分离菌株与相对应的模式菌都聚在一起，且同源性都在 99%以上，说明真菌26S rDNA 基因序列分析结果具有非常高的可信性。
2.3 防腐剂对蒸蛋糕的影响
2.3.1 细菌数的变化。
从表6的数据分析可知，第3天时空白和添加防腐剂的蒸蛋糕的菌落总数虽都已超过GB7099—2003 中规定的热加工食品时细菌计数（<1 500 CFU/g）的标准，但添加防腐剂的蒸蛋糕的细菌数都小于空白，说明防腐剂可以抑制蒸蛋糕中微生物的生长。第5天时添加防腐剂的蒸蛋糕的细菌数均大于空白，原因可能是由于空白的蒸蛋糕的霉菌的生长抑制了细菌的生长。
2.3.2 霉菌数的变化。
从表7的数据分析可知，添加防腐剂的蒸蛋糕的霉菌数都小于空白。第3天时空白的霉菌数超过GB7099—2003中规定的热加工食品时霉菌计数（≤100 CFU/g）的标准，而添加防腐剂的蒸蛋糕的霉菌均小于国标值。由此可见，3种防腐剂对蒸蛋糕的霉菌都有抑制作用，且3种防腐剂对蒸蛋糕霉变的影响大小依次为脱氢乙酸钠、丙酸钙、山梨酸钾。说明脱氢乙酸钠对蒸蛋糕的防霉变效果最好，这与林真等[29]对千层蛋糕的研究结果相一致。
3 结论
（1）该研究结果表明，蒸蛋糕主要是由于表皮霉变造成腐败的，初期主要的腐败霉菌是青霉菌和球孢枝孢，后期主要的腐败霉菌是黑曲霉和黄曲霉。
（2）应用分子测序技术对蒸蛋糕中的腐败微生物构成进行了初步分析，从蒸蛋糕中总共分析到细菌7种，真菌11种。
（3）分析结果表明，Staphylococcus和Kocuriarhizophila是蒸蛋糕腐败中的优势细菌，Penicillium、Aspergillus和Cladosporium是蒸蛋糕腐败中的优势霉菌。
（4）研究结果表明，脱氢乙酸钠对蒸蛋糕的防霉效果优于丙酸钙和山梨酸钾。
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