论文部分内容阅读
摘 要：目的：探讨PI3K/Akt信号通路在过氧化氢（H2O2）致大鼠血管内皮细胞凋亡中的作用。方法：体外培养大鼠血管内皮细胞（RAEC），复制H2O2氧化损伤模型，采用PI3K/Akt信号通路的特异性阻断剂渥曼青霉素（Wortmannin，W）对模型细胞株进行干预，实验分为3组：对照组、H2O2组、H2O2+渥曼青霉素（W）组，采用Western blot法检测各组细胞中Bcl2及Bax蛋白的表达。结果：渥曼青霉素干预后，与对照组比较，H2O2组及H2O2+W组Bcl2蛋白表达和Bcl2/Bax比值下降、Bax蛋白表达升高（P均<0.05）。H2O2组与H2O2+W组间Bcl2蛋白表达和Bcl2/Bax比值差异均无统计学意义（P均>0.05）。H2O2+W组Bax蛋白表达高于H2O2组（P<0.05）。结论：渥曼青霉素抑制PI3K/Akt信号通路促进过氧化氢致血管内细胞损伤。
关键词：氧化应激;血管内皮细胞;细胞凋亡;PI3K/AKT
血管内皮细胞位是血管组织内壁的单层柱状上皮细胞，它是机体循环系统对抗外部损失与破坏的第一道防线，它不仅具有内分泌功能，还具有对血管组织的保护功能能，对维持机体正常血液循环的稳定状态具有重要作用[1]。血管内皮细胞的完整性一旦破坏，会导致高血压、动脉粥样硬化及血栓等一系列疾病[2]。渥曼青霉素及其类似物是真菌的代谢产物，可以通过与胞内磷脂酰肌醇激酶（PI3K）的催化亚单位p110结合，不可逆地抑制PI3K的激酶活性，从而阻断PI3K/AKT信号通路[3]。渥曼青霉素极其类似物是真菌的代谢产物，可以通过与PI3K的催化亚单位p110结合，非竞争性和不可逆的阻断PI3K/AKT信号通路[3]，抑制信号通路的传导，因此本研究主要以H2O2复制内皮细胞氧化损伤模型，采用PI3K信号通路抑制剂渥曼青霉素对细胞进行干预，检测PI3K/Akt信号通路下游Bcl2、Bax的表达情况，探讨PI3K/AKT信号通路在H2O2致体外培养大鼠血管内皮细胞（RAEC）氧化损伤中的作用，明确PI3K/Akt信号通路对过氧化氢致细胞凋亡的作用。
一、材料和方法
（一）主要试剂和仪器
大鼠胸主动脉血管内皮细胞（RAEC，为原代细胞）;H2O2（30%）;渥曼青霉素;Bcl2、Bax一抗;大鼠主动脉内皮细胞专用培养基。CO2培养箱;Transblot SD半干转印槽;电泳凝胶成像分析仪（TH690B）。
（二）实验方法
1.细胞实验分组
RAEC（大鼠胸主动脉血管内皮细胞）在37℃、5%CO2饱和湿度恒温培养箱中常规培养，细胞达到融合状态时开始传代，并分三组：对照组、H2O2组、H2O2+渥曼青霉素（W）组。
2.细胞培养
大鼠主动脉内皮细胞专用培养基（每50mL加0.5mL的青链霉素混合液及300μL的环丙沙星注射液）显微镜观察细胞的状态，放入37℃、5%CO2细胞恒温培养箱中静置24h过夜，第二天更换培养液继续培养，观察细胞状态是否稳定、内皮细胞贴壁数量是否超80%时进行传代。
3.过氧化氢损伤主动脉内皮细胞模型制备
30%过氧化氢原液用灭菌三蒸水稀释得1mmol·L-1的过氧化氢母液;使用前吸取大鼠主动脉内皮细胞专用培养液稀释过氧化氢母液，得终浓度为100μmol·L-1的过氧化氢培养基。用微量移液器将大鼠主动脉内皮单细胞混悬液接种在96孔板上，每孔接种100μL，放入37℃、5%CO2培养箱中过夜，待细胞贴壁并待生长至覆盖85%时，弃去培养液，用多通道移液器加入上述终浓度含100μmol·L-1过氧化氢的培养基，37℃、5%CO2培养箱中孵育2h，制成过氧化氢损伤细胞模型。
4.CCK8法检测渥曼青霉素对大鼠主动脉内皮细胞存活率的影响及渥曼青霉素最大抑菌浓度筛选
将大鼠主动脉内皮细胞分为6组，每组5个复孔，1×104个/孔细胞接种于96孔培养板，每孔加入含有0、10、50、100、500和1000nmol·L-1渥曼青霉素的不同浓度的培养基，37℃、5%CO2培养箱中孵育24h和48h。按照试剂使用说明书，用完全培养基1︰10稀释CCK8原液，每孔加入100μL稀释液，37℃、5%CO2培养箱中孵育2h。待板内液体变成橙黄色时，放入酶标仪（波长450nm）中检测，记录光密度（OD）值，计算出各组细胞的存活率（细胞存活率=[（AsAb）/（AcAb）]×100%;抑制率=[（AcAs）/（AcAb）]×100%;As：實验孔吸光度;Ac：对照孔吸光度;Ab：空白孔吸光度），筛选对大鼠主动脉内皮细胞抑制率最大的渥曼青霉素浓度。
5.Western blot检测
将三组组大鼠主动脉内皮细胞消化收集完毕，检测其Bcl2，Bax蛋白表达含量，使用PBS冲洗洗3遍。置于低温环境下，使用摇床进行震荡混匀30min，加入Lysis Buffer，15000r·min1，低温离心20min，取上清为全蛋白提取物，蛋白定量（BCA法）后，分别保存于超低温冰箱（-80℃）。随后，取冻存蛋白100μg上样，缓冲液按照8∶2体积混合并加入到样本中，沸水煮沸10min。一式四份，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（15%）分离转膜（PVDF），用脱脂奶粉（5%）低温（4℃）封闭1h。分别加入抗bcl2（2∶400）、抗bax（1∶3000）、抗βactin（1∶500）一抗，4℃孵育过夜。PBST洗膜3次，每次10min。二抗（1∶800），低温孵育2h。采用PBST洗膜、ECL化学发光、显影。运用Quantity One图像分析软件测定条带灰度值，条带与内参条带灰度值比值表示各组结果。 （三）统计学处理方法
数据收集、分析采用SPSS 21.0软件，所有计量资料以均数±标准差（x±s）表示;组间两两比较采用q检验，组间比较采用单因素方差分析，检验水准取α=0.05。
三、结果
（一）不同浓度渥曼青霉素对RACE存活率的影响
加入不同浓度的渥曼青霉素与细胞共同培养24h、48h，与0nmol·L-1剂量组比较，10、50、100、500和1000nmol·L-1渥曼青霉素浓度组RACE存活率均降低（P<0.05）。其中1000nmol·L-1的渥曼青霉素干预细胞48h后RACE存活率是（58.596±1.364）%，近半数致死量，选择该浓度进行后续实验。见表1。
（二）渥曼青霉素干预细胞后，各组细胞中Bcl2、Bax蛋白表达和Bcl2/Bax的变化
与对照組比较，H2O2组及H2O2+W组Bcl2蛋白表达和Bcl2/Bax比值下降、Bax蛋白表达升高（P均<0.05）。H2O2组与H2O2+W组间Bcl2蛋白表达和Bcl2/Bax比值差异均无统计学意义（P均>0.05）。H2O2+W组Bax蛋白表达高于H2O2组（P<0.05），见表2，图1。
四、讨论
心血管内皮细胞形态和功能变化是氧化应激损伤的主要形式，同时，也是多种心血管疾病发生与演变的开始[4]。课题组前期通过不同浓度的H2O2来构建氧化损伤模型，当H2O2干预浓度为100μmmol·L-1时，细胞存活率为（54.93±3.364）%，为氧化损伤的最佳模型。因此，本研究采用100μmmol·L-1的H2O2建立氧化损伤模型。
细胞凋亡是伴随生命进程中机体固有的一直程序化死亡的生理性现象，在所有机体组织中都有发生。课题组前期研究发现，H2O2可导致大鼠血管内皮细胞发生凋亡[5]，但机制不清。PI3K/AKT信号通路是与增殖凋亡密切相关的一条信号通路，既有抑制凋亡作用又有促进凋亡的作用，以抑制细胞凋亡作用为主，其发挥作用可通过直接调控下游基因Bcl2和Bax的表达而发挥生理作用[7]。为进一步探究PI3K/AKT信号通路是否在H2O2促进大鼠血管内皮细胞凋亡中发挥作用，本研究采用PI3K/AKT信号通路抑制剂渥曼青霉素干预H2O2致RAEC氧化损伤模型，探讨PI3K/AKT信号通路在H2O2致RAEC氧化损伤中的作用。
细胞凋亡主要有两种途径，分别为：Fas与FasL介导的死亡受体通路和通过Bcl2家族调节的线粒体通路，其中Bcl2家族成员主要分为抗调亡蛋白Bcl2和促凋亡蛋白Bax两类，这两种蛋白作为调节细胞程序化（死亡）凋亡重要的调节基因，这两种凋亡蛋白（Bcl2、Bax）在机体组织中表达水平以及它们基因水平的高低，与其凋亡水平密切相关。Bax/Bcl2的比率是决定细胞凋亡的关键因素，当细胞生存周期正常时则二者表达量平衡，当Bax表达水平高时，形成同源二聚体Bax/Bax，促进细胞凋亡;当Bcl2表达水平高时，形成异源二聚体Bcl2/Bax，抑制细胞凋亡，因此也有学者将Bcl2/Bax称作凋亡开关。本实验研究发现，H2O2组Bcl2蛋白表达降低、Bax蛋白表达升高，Bcl2/Bax比值降低，表明H2O2可导致大鼠血管内皮细胞发生凋亡，这与课题组前期研究结果相一致。而利用渥曼青霉素干预组后，与H2O2组相比，Bax表达增高，且Bcl2/Bax比值显著增加，这可能与渥曼青霉素抑制PI3K/AKT信号通路导致抗凋亡机制降低，而促进了H2O2所致的血管内皮细胞的凋亡有关。
综上所述，渥曼青霉素通过抑制PI3K/AKT信号通路后，进一步加剧了H2O2致大鼠血管内皮细胞的促凋亡作用，且PI3K/AKT信号通路在其中发挥了重要的作用。
参考文献：
[1]位庚，李红蓉，常丽萍，等.血管紧张素Ⅱ诱导血管内皮细胞损伤及中药保护作用[J].中国老年学杂志，2017，37（13）：33533355.
[2]饶璇，李元建.内皮细胞损伤与修复的研究进展[J].中国动脉硬化杂志，2017，25（5）：531535.
[3]郭云学，莫德林，陈瑶生，等.PI3K/AKT抑制剂渥曼青霉素对猪前体脂肪细胞增殖和凋亡的影响[J].遗传，2012，34（10）：12821290.
[4]Yamada T，Egashira N，Bando A，et al.Activation of p38 MAPK by oxidative stress underlying epirubicininduced vascular endothelial cell injury[J].Free Radical Biology & Medicine，2012，52（8）：12851293.
[5]薛姝婧.枸杞多糖对过氧化氢致血管内皮细胞损伤保护作用的研究[D].银川：宁夏医科大学，2017.
基金项目：宁夏自然科学基金项目：2020年，宁夏科技厅，ErbB2/PI3K/eNOS信号通路在脱水式热暴露致大鼠胸主动脉血管内皮细胞损伤中的作用及机理研究，2020AAC03149;宁夏高等学校科学研究项目：2020年，宁夏教育厅，ErbBs/PI3K/eNOS信号通路在氧化应激致大鼠胸主动脉血管内皮细屏障功能损伤作用的研究，NGY 2020042;宁夏医科大学校级科研项目：2019年，宁夏医科大学，热应激对大鼠胸主动脉内皮细胞屏障功能影响的实验研究，XM2019001
作者简介：薛姝婧（1988— ），女，汉族，宁夏银川人，硕士，实验师，主要从事应激与心血管方面的研究;高媛媛（1991— ），女，汉族，宁夏银川人，硕士，实验师，主要从事血管内皮细胞方面的研究（并列一作）。
*通讯作者：耿瑶（1982— ），女，汉族，宁夏银川人，硕士，副教授，主要从事应激与心血管功能变化方面的研究。
关键词：氧化应激;血管内皮细胞;细胞凋亡;PI3K/AKT
血管内皮细胞位是血管组织内壁的单层柱状上皮细胞，它是机体循环系统对抗外部损失与破坏的第一道防线，它不仅具有内分泌功能，还具有对血管组织的保护功能能，对维持机体正常血液循环的稳定状态具有重要作用[1]。血管内皮细胞的完整性一旦破坏，会导致高血压、动脉粥样硬化及血栓等一系列疾病[2]。渥曼青霉素及其类似物是真菌的代谢产物，可以通过与胞内磷脂酰肌醇激酶（PI3K）的催化亚单位p110结合，不可逆地抑制PI3K的激酶活性，从而阻断PI3K/AKT信号通路[3]。渥曼青霉素极其类似物是真菌的代谢产物，可以通过与PI3K的催化亚单位p110结合，非竞争性和不可逆的阻断PI3K/AKT信号通路[3]，抑制信号通路的传导，因此本研究主要以H2O2复制内皮细胞氧化损伤模型，采用PI3K信号通路抑制剂渥曼青霉素对细胞进行干预，检测PI3K/Akt信号通路下游Bcl2、Bax的表达情况，探讨PI3K/AKT信号通路在H2O2致体外培养大鼠血管内皮细胞（RAEC）氧化损伤中的作用，明确PI3K/Akt信号通路对过氧化氢致细胞凋亡的作用。
一、材料和方法
（一）主要试剂和仪器
大鼠胸主动脉血管内皮细胞（RAEC，为原代细胞）;H2O2（30%）;渥曼青霉素;Bcl2、Bax一抗;大鼠主动脉内皮细胞专用培养基。CO2培养箱;Transblot SD半干转印槽;电泳凝胶成像分析仪（TH690B）。
（二）实验方法
1.细胞实验分组
RAEC（大鼠胸主动脉血管内皮细胞）在37℃、5%CO2饱和湿度恒温培养箱中常规培养，细胞达到融合状态时开始传代，并分三组：对照组、H2O2组、H2O2+渥曼青霉素（W）组。
2.细胞培养
大鼠主动脉内皮细胞专用培养基（每50mL加0.5mL的青链霉素混合液及300μL的环丙沙星注射液）显微镜观察细胞的状态，放入37℃、5%CO2细胞恒温培养箱中静置24h过夜，第二天更换培养液继续培养，观察细胞状态是否稳定、内皮细胞贴壁数量是否超80%时进行传代。
3.过氧化氢损伤主动脉内皮细胞模型制备
30%过氧化氢原液用灭菌三蒸水稀释得1mmol·L-1的过氧化氢母液;使用前吸取大鼠主动脉内皮细胞专用培养液稀释过氧化氢母液，得终浓度为100μmol·L-1的过氧化氢培养基。用微量移液器将大鼠主动脉内皮单细胞混悬液接种在96孔板上，每孔接种100μL，放入37℃、5%CO2培养箱中过夜，待细胞贴壁并待生长至覆盖85%时，弃去培养液，用多通道移液器加入上述终浓度含100μmol·L-1过氧化氢的培养基，37℃、5%CO2培养箱中孵育2h，制成过氧化氢损伤细胞模型。
4.CCK8法检测渥曼青霉素对大鼠主动脉内皮细胞存活率的影响及渥曼青霉素最大抑菌浓度筛选
将大鼠主动脉内皮细胞分为6组，每组5个复孔，1×104个/孔细胞接种于96孔培养板，每孔加入含有0、10、50、100、500和1000nmol·L-1渥曼青霉素的不同浓度的培养基，37℃、5%CO2培养箱中孵育24h和48h。按照试剂使用说明书，用完全培养基1︰10稀释CCK8原液，每孔加入100μL稀释液，37℃、5%CO2培养箱中孵育2h。待板内液体变成橙黄色时，放入酶标仪（波长450nm）中检测，记录光密度（OD）值，计算出各组细胞的存活率（细胞存活率=[（AsAb）/（AcAb）]×100%;抑制率=[（AcAs）/（AcAb）]×100%;As：實验孔吸光度;Ac：对照孔吸光度;Ab：空白孔吸光度），筛选对大鼠主动脉内皮细胞抑制率最大的渥曼青霉素浓度。
5.Western blot检测
将三组组大鼠主动脉内皮细胞消化收集完毕，检测其Bcl2，Bax蛋白表达含量，使用PBS冲洗洗3遍。置于低温环境下，使用摇床进行震荡混匀30min，加入Lysis Buffer，15000r·min1，低温离心20min，取上清为全蛋白提取物，蛋白定量（BCA法）后，分别保存于超低温冰箱（-80℃）。随后，取冻存蛋白100μg上样，缓冲液按照8∶2体积混合并加入到样本中，沸水煮沸10min。一式四份，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（15%）分离转膜（PVDF），用脱脂奶粉（5%）低温（4℃）封闭1h。分别加入抗bcl2（2∶400）、抗bax（1∶3000）、抗βactin（1∶500）一抗，4℃孵育过夜。PBST洗膜3次，每次10min。二抗（1∶800），低温孵育2h。采用PBST洗膜、ECL化学发光、显影。运用Quantity One图像分析软件测定条带灰度值，条带与内参条带灰度值比值表示各组结果。 （三）统计学处理方法
数据收集、分析采用SPSS 21.0软件，所有计量资料以均数±标准差（x±s）表示;组间两两比较采用q检验，组间比较采用单因素方差分析，检验水准取α=0.05。
三、结果
（一）不同浓度渥曼青霉素对RACE存活率的影响
加入不同浓度的渥曼青霉素与细胞共同培养24h、48h，与0nmol·L-1剂量组比较，10、50、100、500和1000nmol·L-1渥曼青霉素浓度组RACE存活率均降低（P<0.05）。其中1000nmol·L-1的渥曼青霉素干预细胞48h后RACE存活率是（58.596±1.364）%，近半数致死量，选择该浓度进行后续实验。见表1。
（二）渥曼青霉素干预细胞后，各组细胞中Bcl2、Bax蛋白表达和Bcl2/Bax的变化
与对照組比较，H2O2组及H2O2+W组Bcl2蛋白表达和Bcl2/Bax比值下降、Bax蛋白表达升高（P均<0.05）。H2O2组与H2O2+W组间Bcl2蛋白表达和Bcl2/Bax比值差异均无统计学意义（P均>0.05）。H2O2+W组Bax蛋白表达高于H2O2组（P<0.05），见表2，图1。
四、讨论
心血管内皮细胞形态和功能变化是氧化应激损伤的主要形式，同时，也是多种心血管疾病发生与演变的开始[4]。课题组前期通过不同浓度的H2O2来构建氧化损伤模型，当H2O2干预浓度为100μmmol·L-1时，细胞存活率为（54.93±3.364）%，为氧化损伤的最佳模型。因此，本研究采用100μmmol·L-1的H2O2建立氧化损伤模型。
细胞凋亡是伴随生命进程中机体固有的一直程序化死亡的生理性现象，在所有机体组织中都有发生。课题组前期研究发现，H2O2可导致大鼠血管内皮细胞发生凋亡[5]，但机制不清。PI3K/AKT信号通路是与增殖凋亡密切相关的一条信号通路，既有抑制凋亡作用又有促进凋亡的作用，以抑制细胞凋亡作用为主，其发挥作用可通过直接调控下游基因Bcl2和Bax的表达而发挥生理作用[7]。为进一步探究PI3K/AKT信号通路是否在H2O2促进大鼠血管内皮细胞凋亡中发挥作用，本研究采用PI3K/AKT信号通路抑制剂渥曼青霉素干预H2O2致RAEC氧化损伤模型，探讨PI3K/AKT信号通路在H2O2致RAEC氧化损伤中的作用。
细胞凋亡主要有两种途径，分别为：Fas与FasL介导的死亡受体通路和通过Bcl2家族调节的线粒体通路，其中Bcl2家族成员主要分为抗调亡蛋白Bcl2和促凋亡蛋白Bax两类，这两种蛋白作为调节细胞程序化（死亡）凋亡重要的调节基因，这两种凋亡蛋白（Bcl2、Bax）在机体组织中表达水平以及它们基因水平的高低，与其凋亡水平密切相关。Bax/Bcl2的比率是决定细胞凋亡的关键因素，当细胞生存周期正常时则二者表达量平衡，当Bax表达水平高时，形成同源二聚体Bax/Bax，促进细胞凋亡;当Bcl2表达水平高时，形成异源二聚体Bcl2/Bax，抑制细胞凋亡，因此也有学者将Bcl2/Bax称作凋亡开关。本实验研究发现，H2O2组Bcl2蛋白表达降低、Bax蛋白表达升高，Bcl2/Bax比值降低，表明H2O2可导致大鼠血管内皮细胞发生凋亡，这与课题组前期研究结果相一致。而利用渥曼青霉素干预组后，与H2O2组相比，Bax表达增高，且Bcl2/Bax比值显著增加，这可能与渥曼青霉素抑制PI3K/AKT信号通路导致抗凋亡机制降低，而促进了H2O2所致的血管内皮细胞的凋亡有关。
综上所述，渥曼青霉素通过抑制PI3K/AKT信号通路后，进一步加剧了H2O2致大鼠血管内皮细胞的促凋亡作用，且PI3K/AKT信号通路在其中发挥了重要的作用。
参考文献：
[1]位庚，李红蓉，常丽萍，等.血管紧张素Ⅱ诱导血管内皮细胞损伤及中药保护作用[J].中国老年学杂志，2017，37（13）：33533355.
[2]饶璇，李元建.内皮细胞损伤与修复的研究进展[J].中国动脉硬化杂志，2017，25（5）：531535.
[3]郭云学，莫德林，陈瑶生，等.PI3K/AKT抑制剂渥曼青霉素对猪前体脂肪细胞增殖和凋亡的影响[J].遗传，2012，34（10）：12821290.
[4]Yamada T，Egashira N，Bando A，et al.Activation of p38 MAPK by oxidative stress underlying epirubicininduced vascular endothelial cell injury[J].Free Radical Biology & Medicine，2012，52（8）：12851293.
[5]薛姝婧.枸杞多糖对过氧化氢致血管内皮细胞损伤保护作用的研究[D].银川：宁夏医科大学，2017.
基金项目：宁夏自然科学基金项目：2020年，宁夏科技厅，ErbB2/PI3K/eNOS信号通路在脱水式热暴露致大鼠胸主动脉血管内皮细胞损伤中的作用及机理研究，2020AAC03149;宁夏高等学校科学研究项目：2020年，宁夏教育厅，ErbBs/PI3K/eNOS信号通路在氧化应激致大鼠胸主动脉血管内皮细屏障功能损伤作用的研究，NGY 2020042;宁夏医科大学校级科研项目：2019年，宁夏医科大学，热应激对大鼠胸主动脉内皮细胞屏障功能影响的实验研究，XM2019001
作者简介：薛姝婧（1988— ），女，汉族，宁夏银川人，硕士，实验师，主要从事应激与心血管方面的研究;高媛媛（1991— ），女，汉族，宁夏银川人，硕士，实验师，主要从事血管内皮细胞方面的研究（并列一作）。
*通讯作者：耿瑶（1982— ），女，汉族，宁夏银川人，硕士，副教授，主要从事应激与心血管功能变化方面的研究。