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摘要：
目的： 建立HPLC法测定桂蒲肾清片中咖啡酸含量。方法：采用高效液相色谱法测定蒲公中咖啡酸的含量。结果咖啡酸在进样量在在25.68-141.24μg范围内有良好，平均回收率为RSD为1.14%（n=6）。结论：所建立的方法测定样品中咖啡酸准确可靠、灵敏度高、专属性强，可有效控制桂蒲肾清片的的质量。
关键词：桂蒲肾清片；咖啡酸； 高效液相色谱法
【中图分类号】
R453 【文献标识码】B 【文章编号】1002-3763（2014）08-0066-02
桂蒲肾清片由诃子、菥蓂子、人工牛黄、蒲公英、三七、鸡内金、肉桂、菟丝子、莲子、琥珀、阿胶、泽泻等12味药，具有清热利湿解毒，化瘀通淋止痛。用于湿热下注、毒瘀互阻所致尿频、尿急、尿痛、尿血、腰疼乏力等症；尿路感染，急慢性肾盂肾炎、非淋菌性尿道炎见上述症候者。[1]该制剂由桂蒲肾清胶囊改剂型而来，原质量标准中采用薄层扫描法测定人工牛黄中的胆酸，为更好的控制产品质量，建立HPLC法测定方中的君药蒲公英中的咖啡酸含量的方法。
1 仪器与试药
仪器：岛津LC-2010AHT型高效液相色谱仪；十万分之一电子分析天平；HS12060D型超声波清洗器（功率：250w； 频率：40 khz）。离心机（功率：25W；最高转速：4000r/min）。
试药：色谱甲醇；水（重蒸水）；磷酸；咖啡酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110885-200102 ，供含量测定用）；样品（贵州顺健制药有限公司自制，批号：20060501；20060502；20060503）。
2 色谱条件的选择
色谱柱： 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂柱；流动相：甲醇-0.4%磷酸溶液（21：79）；流速：1.0ml/min ；柱温：30℃；检测波长：323nm。
3 对照品溶液的制备
精密称取在110℃干燥至恒重的咖啡酸对照品10.70mg置50ml量瓶中，加甲醇适量溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取1ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取取2 ml，置10量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
4 供试品溶液制备
取本品，除去薄膜衣，研细，取约2g，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，加入适量石油醚（30-60℃），索氏提取6h，挥干石油醚，残渣精密加入5%甲酸的甲醇溶液20ml，超声30分钟，冷却，摇匀，离心（2000r/min）10min，取上清液，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得。
5 方法学考察
5.1 系统适应性试验： 分别精密吸取对照品溶液、阴性供试品溶液、空白溶液及供试品溶液各15μl，按上述色谱条件注入色谱仪，见图1。阴性对照品溶液色谱图在咖啡酸峰位置无色谱峰，表明其他组分对测定无干扰咖啡酸峰与相邻组分峰的分离度大于1.5 ，理论板数以咖啡酸峰计不小于2000。
C 缺蒲公英阴性溶液
5.2 线性关系的考察： 精密吸取咖啡酸对照品贮备液（C=12.84μg/ml）2μl、3μl、5μl、7μl、9μl，11μl（即分别含咖啡酸25.68μg、38.52μg、64.20μg、89.88μg、115.56μg、141.24μg） 分别注15μl入高效液相色谱仪中，按上述色谱条件测定峰面积，记录色谱图，并以对照品的进样量X（μg）为横坐标，峰面积值Y为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：y = 4140.4 x -5246.6 R2 = 0.9996，结果表明，咖啡酸在25.68-141.24μg范围内有良好的线性关系。
5.3 精密度试验： 精密吸取对照品溶液（C=4.28μg/ml）15μl，平行进样6次，测定咖啡酸峰面积值。结果相对标准偏差RSD=1.7%，表明仪器精密度良好。
5.4 稳定性试验： 精密吸取同一供试品溶液（批号：20060501）各15μl，在室温0小时、2小时、4小时、6小时、8小时、10小时进行测定咖啡酸峰面积。结果表明， RSD为1.67（n=6），表明咖啡酸在10小时内稳定性良好。
5.5 重复性试验： 取本品，除去薄膜衣，研细，精密称取各2g，共6份，依法制备供试品溶液并测定含量。结果RSD为0.26%（n=6），表明该方法重现性良好。
5.6 加样回收率试验：取已知含量的同一批样品（咖啡酸含量为32.6687μg/g，批号：20060501）各约1g，共6份，精密称定，按照样品中咖啡酸含量的100%的比例分别加入咖啡酸贮备液（每1ml含咖啡酸34.24μg）1ml，按供试品溶液的制备方法制备成供试品溶液，精密吸取供试品溶液各15μl进样，按照上述色谱条件测定含量。实验结果回收率平均值为98.41%，RSD=1.14%（n=6），回收率试验良好。
5.7 样品测定：分别取10批样品适量，按上述方法测定咖啡酸含量（单位：μg/片）分别为：12.88、12.88、13.03、12.92、12.90、13.11、12.99、13.05、12.92、12.94。
6 讨论
试验中考察了不同提取方法，不同提取溶剂，不同提取方法时间，结果样品中测定咖啡酸含量样品制备方法为取本品，除去薄膜衣，研细，取约2g，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，加入适量石油醚（30-60℃），索氏提取6h，挥干石油醚，残渣精密加入5%甲酸的甲醇溶液20ml，超声30分钟，冷却，摇匀，离心（2000r/min）10min，取上清液，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得。能有效测定样品中的咖啡酸。
本制剂由12味中药材组方，本试验除了与原桂蒲肾清胶囊测定人工牛黄中胆酸的含量，同时还对蒲公英中的咖啡酸进行含量测定，此质量控制方法能很好控制产品质量。
参考文献
[1]中华人民共和国国家药品监督管理局WS-11110（ZD-1110）-2002
目的： 建立HPLC法测定桂蒲肾清片中咖啡酸含量。方法：采用高效液相色谱法测定蒲公中咖啡酸的含量。结果咖啡酸在进样量在在25.68-141.24μg范围内有良好，平均回收率为RSD为1.14%（n=6）。结论：所建立的方法测定样品中咖啡酸准确可靠、灵敏度高、专属性强，可有效控制桂蒲肾清片的的质量。
关键词：桂蒲肾清片；咖啡酸； 高效液相色谱法
【中图分类号】
R453 【文献标识码】B 【文章编号】1002-3763（2014）08-0066-02
桂蒲肾清片由诃子、菥蓂子、人工牛黄、蒲公英、三七、鸡内金、肉桂、菟丝子、莲子、琥珀、阿胶、泽泻等12味药，具有清热利湿解毒，化瘀通淋止痛。用于湿热下注、毒瘀互阻所致尿频、尿急、尿痛、尿血、腰疼乏力等症；尿路感染，急慢性肾盂肾炎、非淋菌性尿道炎见上述症候者。[1]该制剂由桂蒲肾清胶囊改剂型而来，原质量标准中采用薄层扫描法测定人工牛黄中的胆酸，为更好的控制产品质量，建立HPLC法测定方中的君药蒲公英中的咖啡酸含量的方法。
1 仪器与试药
仪器：岛津LC-2010AHT型高效液相色谱仪；十万分之一电子分析天平；HS12060D型超声波清洗器（功率：250w； 频率：40 khz）。离心机（功率：25W；最高转速：4000r/min）。
试药：色谱甲醇；水（重蒸水）；磷酸；咖啡酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110885-200102 ，供含量测定用）；样品（贵州顺健制药有限公司自制，批号：20060501；20060502；20060503）。
2 色谱条件的选择
色谱柱： 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂柱；流动相：甲醇-0.4%磷酸溶液（21：79）；流速：1.0ml/min ；柱温：30℃；检测波长：323nm。
3 对照品溶液的制备
精密称取在110℃干燥至恒重的咖啡酸对照品10.70mg置50ml量瓶中，加甲醇适量溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取1ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取取2 ml，置10量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
4 供试品溶液制备
取本品，除去薄膜衣，研细，取约2g，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，加入适量石油醚（30-60℃），索氏提取6h，挥干石油醚，残渣精密加入5%甲酸的甲醇溶液20ml，超声30分钟，冷却，摇匀，离心（2000r/min）10min，取上清液，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得。
5 方法学考察
5.1 系统适应性试验： 分别精密吸取对照品溶液、阴性供试品溶液、空白溶液及供试品溶液各15μl，按上述色谱条件注入色谱仪，见图1。阴性对照品溶液色谱图在咖啡酸峰位置无色谱峰，表明其他组分对测定无干扰咖啡酸峰与相邻组分峰的分离度大于1.5 ，理论板数以咖啡酸峰计不小于2000。
C 缺蒲公英阴性溶液
5.2 线性关系的考察： 精密吸取咖啡酸对照品贮备液（C=12.84μg/ml）2μl、3μl、5μl、7μl、9μl，11μl（即分别含咖啡酸25.68μg、38.52μg、64.20μg、89.88μg、115.56μg、141.24μg） 分别注15μl入高效液相色谱仪中，按上述色谱条件测定峰面积，记录色谱图，并以对照品的进样量X（μg）为横坐标，峰面积值Y为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：y = 4140.4 x -5246.6 R2 = 0.9996，结果表明，咖啡酸在25.68-141.24μg范围内有良好的线性关系。
5.3 精密度试验： 精密吸取对照品溶液（C=4.28μg/ml）15μl，平行进样6次，测定咖啡酸峰面积值。结果相对标准偏差RSD=1.7%，表明仪器精密度良好。
5.4 稳定性试验： 精密吸取同一供试品溶液（批号：20060501）各15μl，在室温0小时、2小时、4小时、6小时、8小时、10小时进行测定咖啡酸峰面积。结果表明， RSD为1.67（n=6），表明咖啡酸在10小时内稳定性良好。
5.5 重复性试验： 取本品，除去薄膜衣，研细，精密称取各2g，共6份，依法制备供试品溶液并测定含量。结果RSD为0.26%（n=6），表明该方法重现性良好。
5.6 加样回收率试验：取已知含量的同一批样品（咖啡酸含量为32.6687μg/g，批号：20060501）各约1g，共6份，精密称定，按照样品中咖啡酸含量的100%的比例分别加入咖啡酸贮备液（每1ml含咖啡酸34.24μg）1ml，按供试品溶液的制备方法制备成供试品溶液，精密吸取供试品溶液各15μl进样，按照上述色谱条件测定含量。实验结果回收率平均值为98.41%，RSD=1.14%（n=6），回收率试验良好。
5.7 样品测定：分别取10批样品适量，按上述方法测定咖啡酸含量（单位：μg/片）分别为：12.88、12.88、13.03、12.92、12.90、13.11、12.99、13.05、12.92、12.94。
6 讨论
试验中考察了不同提取方法，不同提取溶剂，不同提取方法时间，结果样品中测定咖啡酸含量样品制备方法为取本品，除去薄膜衣，研细，取约2g，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，加入适量石油醚（30-60℃），索氏提取6h，挥干石油醚，残渣精密加入5%甲酸的甲醇溶液20ml，超声30分钟，冷却，摇匀，离心（2000r/min）10min，取上清液，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得。能有效测定样品中的咖啡酸。
本制剂由12味中药材组方，本试验除了与原桂蒲肾清胶囊测定人工牛黄中胆酸的含量，同时还对蒲公英中的咖啡酸进行含量测定，此质量控制方法能很好控制产品质量。
参考文献
[1]中华人民共和国国家药品监督管理局WS-11110（ZD-1110）-2002