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摘要：
本研究在分析浸泡乙醇浓度、提取水浴温度、提取负压、提取时间等4个单因素对柞蚕雄蛾浓缩液提取得率影响的基础上，通过正交试验对4因素进行了优化，最终确定柞蚕雄蛾浓缩液最佳提取工艺条件为：95%食用酒精在水浴温度60℃、提取负压-0.09 MPa的条件下提取4 h。该提取工艺条件下柞蚕雄蛾浓缩液得率19.09%，浓缩液清澈透明、感观品质好、脂肪含量低，可直接加工成保健品服用或用于勾兑雄蚕蛾酒及饮料等。
关键词：柞蚕雄蛾浓缩液；提取；工艺条件；正交试验
中图分类号：S885.1文献标识号：A文章编号：1001-4942（2015）05-0105-04
Study on Optimum Extraction Technology
for Concentrated Extract of Tussah Male Moth
Fan Zuoqing， Guo Guang， Xiao Lianming， Nie Lei， Zou Deqing*
（Sericultural Research Institute of Shandong Province， Yantai 264002， China）
AbstractBased on the effect analysis of 4 single factors including ethanol concentrate， water bath temperature， extracting negative pressure and time on the extraction rate， an orthogonal experimental was designed to optimize the extraction technology.The optimum extraction conditions were extracting for 4 hours with 95% ethanol （v/v） as solvent in 60℃ water bath and under –0.09 Mpa. Under the optimum conditions，the extraction rate was 19.09%，and the concentrated extract of tussah male moth was clear and transparent with better sensory quality and lower fat content，so it could be processed into tonic product directly or used to produce blended wine.
Key wordsConcentrated extract of tussah male moth； Extraction； Technological condition； Orthogonal experiment
柞蚕产自山野，其雄蛾由雄蛹变态而来，个大体健，飞翔能力及求偶欲极强，属食疗珍品，国家卫生部已将蚕蛾列为有特定保健功能的动物性资源，雄蚕蛾当属其中极品，历史上曾被作为“贡品”，被誉为“神虫国宝”。柞蚕雄蛾是柞蚕4个变态中的成虫阶段，也是性成熟阶段，不再取食也不再生长，完成交配后就结束一生。此阶段柞蚕雄蛾体内积聚了大量能调节机体功能的营养物质，如矿物质、微量元素、维生素和激素类及其它活性物质，这些营养活性物质的存在使得柞蚕雄蛾具有一定的药用功效，可减轻氢化可的松所致的肾阳虚小鼠的阳虚症状，显示出雄性激素样作用和对肾阳虚的预防作用。
传统柞蚕雄蛾主要用来泡制药酒或配制中药，但随着科技发展，传统雄蚕蛾加工利用方式已不能适应便捷、高效的现代食品、药品加工工艺要求，为高效利用柞蚕雄蛾原料，推动蚕业资源多元化利用，笔者对柞蚕雄蛾营养物质的提取技术进行了研究。柞蚕雄蛾浓缩液是一种从鲜活柞蚕雄蛾体内提取的富含生物活性物质的高蛋白制品。柞蚕雄蛾浓缩液对小鼠的保肝降酶试验表明，柞蚕雄蛾浓缩液可明显降低四氯化碳中毒小鼠血清中谷丙转氨酶水平，对小鼠肝细胞具有明显保护作用，可减少肝细胞变性坏死的程度和范围，具有保肝降酶作用；抗肿瘤细胞免疫试验表明，柞蚕雄蛾浓缩液可以改善大鼠机体免疫功能抑制状态，增强抗肿瘤细胞免疫功能等；对小鼠细胞免疫、体液免疫和单核吞噬细胞系统功能影响的研究表明，柞蚕雄蛾浓缩液是具有免疫调节作用的保健食品。
柞蚕雄蛾浓缩液加工工艺是一项繁琐复杂的提取除杂技术，多年研究发现其提取浓缩效率主要受乙醇浓度、提取水浴温度、提取负压、提取时间等因素条件的交叉影响。本研究通过对以上4个因素的单因素分析，利用正交试验优化了柞蚕雄蛾浓缩液的最佳提取工艺条件。
1材料与方法
1.1材料及主要仪器设备
柞蚕雄蛾由产自辽宁的柞蚕茧自然条件下孵化所得，选取初羽化未交配前的柞蚕雄蛾；浸出剂为烟台酿酒厂生产的食用酒精，乙醇浓度为95%；减压回流提取装置（主要由三通圆底烧瓶、蛇形冷凝管、恒温水浴装置、2X-4旋片式真空泵组成）；飞鸽牌LXJ—ⅡB型高速离心机（上海安亭科学仪器厂）。
1.2提取工艺流程
1.2.1柞蚕雄蛾浓缩液提取工艺流程 柞蚕雄蛾浓缩液提取工艺流程如图1所示，可见，柞蚕雄蛾经一定浓度食用酒精浸泡粉碎，在适当条件下回流提取一定时间，离心去渣，再经浓缩回收酒精至水分含量达50%左右（多年研究发现，在浓缩至水分含量达50%时低温离心去除油脂最彻底），再经冷冻除脂工艺去除油脂得浓缩液。
1.2.2柞蚕雄蛾的预处理收集自然条件下初羽化未及交配的鲜活柞蚕雄蛾，排空尿液，掐翅去足备用。 1.2.3柞蚕雄蛾浓缩液得率的计算及脂肪含量测定柞蚕雄蛾浓缩液得率=所得浓缩液的质量/所用雄蛾的质量×100%；柞蚕雄蛾浓缩液脂肪含量测定参照GB/T5413-1997。
1.3提取条件的优化
1.3.1单因素试验① 浸泡乙醇浓度：将1 000 g柞蚕雄蛾经粉碎处理，分别浸泡于乙醇含量为55%、65%、75%、85%、95%的食用酒精中，提取水浴温度控制在60℃，提取负压为-0.08 MPa，提取时间为150 min。
②提取时间：将1 000 g柞蚕雄蛾经粉碎处理，用乙醇含量为85%的食用酒精，提取水浴温度控制在60℃，提取负压为-0.08 MPa，分别回流提取60、90、120、150、180 min。
③提取水浴温度：将1 000 g柞蚕雄蛾经粉碎处理，用乙醇含量为85%的食用酒精，提取水浴温度分别控制在40、50、60、70℃，提取负压-0.08 MPa，回流提取3 h。
④提取负压：将1 000 g柞蚕雄蛾经粉碎处理，用乙醇含量为85%的食用酒精，提取水浴温度控制在60℃，提取负压分别为-0.06、-0.07、-0.08、-0.09、-0.10 MPa，回流提取3 h。
1.3.2正交试验由于柞蚕雄蛾浓缩液提取得率实际上受上述4个因素交叉影响，因此在进行上述单因素试验后选用L9（34）正交表（见表1）设计了3水平4因素的正交试验。
1.3.3验证试验在以上最佳工艺条件下进行3次重复试验，分别计算浓缩液得率及所得浓缩液中油脂含量。
2结果与分析
2.1单因素试验
2.1.1乙醇浓度对浓缩液得率的影响由图2可知，柞蚕雄蛾浓缩液得率随乙醇浓度的升高而逐渐增大且趋势明显，这可能是随乙醇浓度增大，乙醇作为有机溶剂其脂溶性和水溶性溶解度加大，柞蚕雄蛾体内有效物质更多地溶解于酒精中。
2.1.2提取时间对浓缩液得率的影响由图3可知：浓缩液得率随提取时间增长逐渐提高，当时间超过90 min后趋势趋于平缓。从理论上分析，提取时间并不是越长越好，因为柞蚕雄蛾浓缩液是一种具有生物活性的物质，其长时间处于温度较高环境中，更容易失去生物功能，因此，综合考虑最佳提取时间应在3～4 h内。
2.1.3提取水浴温度对浓缩液得率的影响由图4可知，随着提取水浴温度的升高，柞蚕雄蛾浓缩液得率逐渐增大，且增大趋势明显，但考虑到当水温超过60℃时柞蚕雄蛾浓缩液中的有效活性物质易被钝化失活，从而失去其生物保健功能，故最佳提取水浴温度确定为60℃。
2.1.4提取负压对浓缩液得率的影响由图5可知，随提取负压的增大，柞蚕雄蛾浓缩液得率总体呈增大趋势，说明负压增大加快了蛾体细胞破裂的速度，加快了蛾体功能成分向酒精中释出的时间和速度，当压力大于-0.08 MPa时随时间的延长趋势趋于平缓。
2.2正交试验
从表2可以看出，各因素对浓缩液提取得率影响的主次顺序依次为乙醇浓度>提取负压>提取水浴温度>提取时间。根据以上试验结果与分析，最佳提取工艺条件为A3B3C3D3，即使用乙醇含量为95%的食用酒精在水浴温度为60℃、提取负压为-0.09MPa的条件下提取4 h。
2.3最佳工艺条件验证结果
由表3可知，在最佳工艺条件下，浓缩液得率19.09%，高于工艺优化前的得率16.55%；油脂含量0.087%，比优化前大大降低。所得浓缩液清澈透明，感官品质好，脂肪含量低。
3结论与讨论
3.1柞蚕雄蛾浓缩液是一种保存了柞蚕雄蛾体内有效活性成分的高营养制品，由于柞蚕雄蛾体内油脂含量较高，油脂的存在导致了柞蚕雄蛾提取液易酸败、保存时间短及感观差等缺点，而油脂的分离与严格的提取工艺条件密不可分。本研究通过单因素试验及正交试验，确定在使用95%食用酒精、水浴温度60℃、负压-0.09MPa、提取4 h的工艺条件下，柞蚕雄蛾浓缩液得率19.09%。
3.2柞蚕雄蛾体内含有丰富的营养物质及活性成分，这些营养物质及活性成分对人体具有重要的保健功能。传统雄蚕蛾用法是将蚕蛾用高度酒浸泡，制成药酒，这样利用率极低，不仅是对原料的极大浪费，所浸出的有效成分也极其有限。为高效利用柞蚕雄蛾，本研究利用酒精做为浸出剂，通过优化试验，对雄蚕蛾体内的营养成分进行有效萃取，利用冷冻工艺去除脂肪，生产的柞蚕雄蛾浓缩液清澈透明、感观品质好、脂肪含量低，可直接加工成保健品服用或用于勾兑雄蚕蛾酒及饮料等，该生产工艺已获得国家发明专利（专利号：2009 1 0016120.X）。
3.3本研究仅涉及低温负压提取浓缩工艺条件对浓缩液得率的影响，浓缩液中脂肪的分离去除步骤所需离心时间、离心温度、离心速度等工艺研究已发表。该柞蚕雄蛾浓缩液的加工工艺是一项繁琐复杂的提取除杂技术，首先，柞蚕雄蛾浓缩液中的水分含量直接影响到浓缩液得率，长期研究发现，只有在其水分含量浓缩为一特定临界值时通过低温离心分离工艺浓缩液中的油脂才能分离最彻底，才能保证浓缩液清澈的感观和较长的保质期限。其次，在该工艺条件下所提取的柞蚕雄蛾浓缩液基本能保全雄蛾体内所含营养成分，但还有部分脂溶性物质如维生素A、维生素E等随油脂的去除而被分离，对于如何更多地保留这些营养物质，还需进一步研究。
参考文献：
[1]
吕继业，李金志，孙继红，等.柞蚕雄蛾营养成分的测定与评价[J].北方蚕业，2013，34（3）：6-8.
[2]顾美儿，时连根，傅淑清.雄蚕蛾开发利用研究进展[J].蚕桑通报，2007，38（1）：15-18.
[3]辽宁省蚕业科学研究所.中国柞蚕[M].沈阳：辽宁科学技术出版社，2003：584-593.
[4]邹德庆，郑淑湘，阮怀军，等.柞蚕雄蛾浓缩液对肝细胞的保护和对高脂血症的治疗效果[J].蚕业科学，2006，32（4）：530-534.
[5]邹德庆，张维东，范作卿，等.柞蚕雄蛾浓缩液对大鼠荷W256癌肉瘤放疗后免疫功能的试验研究[J].北方蚕业，2007（4）：9-11.
[6]邹德庆，郑淑湘，李全宏，等.柞蚕雄蛾浓缩液成分及免疫调节功能的研究[J].食品科学，2006（5）：231-234.
[7]邹德庆，范作卿，李智峰，等.柞蚕雄蛾浓缩液生产的部分工艺条件改进与产品质量检测[J].蚕业科学，2012，38（5）：942-948.
本研究在分析浸泡乙醇浓度、提取水浴温度、提取负压、提取时间等4个单因素对柞蚕雄蛾浓缩液提取得率影响的基础上，通过正交试验对4因素进行了优化，最终确定柞蚕雄蛾浓缩液最佳提取工艺条件为：95%食用酒精在水浴温度60℃、提取负压-0.09 MPa的条件下提取4 h。该提取工艺条件下柞蚕雄蛾浓缩液得率19.09%，浓缩液清澈透明、感观品质好、脂肪含量低，可直接加工成保健品服用或用于勾兑雄蚕蛾酒及饮料等。
关键词：柞蚕雄蛾浓缩液；提取；工艺条件；正交试验
中图分类号：S885.1文献标识号：A文章编号：1001-4942（2015）05-0105-04
Study on Optimum Extraction Technology
for Concentrated Extract of Tussah Male Moth
Fan Zuoqing， Guo Guang， Xiao Lianming， Nie Lei， Zou Deqing*
（Sericultural Research Institute of Shandong Province， Yantai 264002， China）
AbstractBased on the effect analysis of 4 single factors including ethanol concentrate， water bath temperature， extracting negative pressure and time on the extraction rate， an orthogonal experimental was designed to optimize the extraction technology.The optimum extraction conditions were extracting for 4 hours with 95% ethanol （v/v） as solvent in 60℃ water bath and under –0.09 Mpa. Under the optimum conditions，the extraction rate was 19.09%，and the concentrated extract of tussah male moth was clear and transparent with better sensory quality and lower fat content，so it could be processed into tonic product directly or used to produce blended wine.
Key wordsConcentrated extract of tussah male moth； Extraction； Technological condition； Orthogonal experiment
柞蚕产自山野，其雄蛾由雄蛹变态而来，个大体健，飞翔能力及求偶欲极强，属食疗珍品，国家卫生部已将蚕蛾列为有特定保健功能的动物性资源，雄蚕蛾当属其中极品，历史上曾被作为“贡品”，被誉为“神虫国宝”。柞蚕雄蛾是柞蚕4个变态中的成虫阶段，也是性成熟阶段，不再取食也不再生长，完成交配后就结束一生。此阶段柞蚕雄蛾体内积聚了大量能调节机体功能的营养物质，如矿物质、微量元素、维生素和激素类及其它活性物质，这些营养活性物质的存在使得柞蚕雄蛾具有一定的药用功效，可减轻氢化可的松所致的肾阳虚小鼠的阳虚症状，显示出雄性激素样作用和对肾阳虚的预防作用。
传统柞蚕雄蛾主要用来泡制药酒或配制中药，但随着科技发展，传统雄蚕蛾加工利用方式已不能适应便捷、高效的现代食品、药品加工工艺要求，为高效利用柞蚕雄蛾原料，推动蚕业资源多元化利用，笔者对柞蚕雄蛾营养物质的提取技术进行了研究。柞蚕雄蛾浓缩液是一种从鲜活柞蚕雄蛾体内提取的富含生物活性物质的高蛋白制品。柞蚕雄蛾浓缩液对小鼠的保肝降酶试验表明，柞蚕雄蛾浓缩液可明显降低四氯化碳中毒小鼠血清中谷丙转氨酶水平，对小鼠肝细胞具有明显保护作用，可减少肝细胞变性坏死的程度和范围，具有保肝降酶作用；抗肿瘤细胞免疫试验表明，柞蚕雄蛾浓缩液可以改善大鼠机体免疫功能抑制状态，增强抗肿瘤细胞免疫功能等；对小鼠细胞免疫、体液免疫和单核吞噬细胞系统功能影响的研究表明，柞蚕雄蛾浓缩液是具有免疫调节作用的保健食品。
柞蚕雄蛾浓缩液加工工艺是一项繁琐复杂的提取除杂技术，多年研究发现其提取浓缩效率主要受乙醇浓度、提取水浴温度、提取负压、提取时间等因素条件的交叉影响。本研究通过对以上4个因素的单因素分析，利用正交试验优化了柞蚕雄蛾浓缩液的最佳提取工艺条件。
1材料与方法
1.1材料及主要仪器设备
柞蚕雄蛾由产自辽宁的柞蚕茧自然条件下孵化所得，选取初羽化未交配前的柞蚕雄蛾；浸出剂为烟台酿酒厂生产的食用酒精，乙醇浓度为95%；减压回流提取装置（主要由三通圆底烧瓶、蛇形冷凝管、恒温水浴装置、2X-4旋片式真空泵组成）；飞鸽牌LXJ—ⅡB型高速离心机（上海安亭科学仪器厂）。
1.2提取工艺流程
1.2.1柞蚕雄蛾浓缩液提取工艺流程 柞蚕雄蛾浓缩液提取工艺流程如图1所示，可见，柞蚕雄蛾经一定浓度食用酒精浸泡粉碎，在适当条件下回流提取一定时间，离心去渣，再经浓缩回收酒精至水分含量达50%左右（多年研究发现，在浓缩至水分含量达50%时低温离心去除油脂最彻底），再经冷冻除脂工艺去除油脂得浓缩液。
1.2.2柞蚕雄蛾的预处理收集自然条件下初羽化未及交配的鲜活柞蚕雄蛾，排空尿液，掐翅去足备用。 1.2.3柞蚕雄蛾浓缩液得率的计算及脂肪含量测定柞蚕雄蛾浓缩液得率=所得浓缩液的质量/所用雄蛾的质量×100%；柞蚕雄蛾浓缩液脂肪含量测定参照GB/T5413-1997。
1.3提取条件的优化
1.3.1单因素试验① 浸泡乙醇浓度：将1 000 g柞蚕雄蛾经粉碎处理，分别浸泡于乙醇含量为55%、65%、75%、85%、95%的食用酒精中，提取水浴温度控制在60℃，提取负压为-0.08 MPa，提取时间为150 min。
②提取时间：将1 000 g柞蚕雄蛾经粉碎处理，用乙醇含量为85%的食用酒精，提取水浴温度控制在60℃，提取负压为-0.08 MPa，分别回流提取60、90、120、150、180 min。
③提取水浴温度：将1 000 g柞蚕雄蛾经粉碎处理，用乙醇含量为85%的食用酒精，提取水浴温度分别控制在40、50、60、70℃，提取负压-0.08 MPa，回流提取3 h。
④提取负压：将1 000 g柞蚕雄蛾经粉碎处理，用乙醇含量为85%的食用酒精，提取水浴温度控制在60℃，提取负压分别为-0.06、-0.07、-0.08、-0.09、-0.10 MPa，回流提取3 h。
1.3.2正交试验由于柞蚕雄蛾浓缩液提取得率实际上受上述4个因素交叉影响，因此在进行上述单因素试验后选用L9（34）正交表（见表1）设计了3水平4因素的正交试验。
1.3.3验证试验在以上最佳工艺条件下进行3次重复试验，分别计算浓缩液得率及所得浓缩液中油脂含量。
2结果与分析
2.1单因素试验
2.1.1乙醇浓度对浓缩液得率的影响由图2可知，柞蚕雄蛾浓缩液得率随乙醇浓度的升高而逐渐增大且趋势明显，这可能是随乙醇浓度增大，乙醇作为有机溶剂其脂溶性和水溶性溶解度加大，柞蚕雄蛾体内有效物质更多地溶解于酒精中。
2.1.2提取时间对浓缩液得率的影响由图3可知：浓缩液得率随提取时间增长逐渐提高，当时间超过90 min后趋势趋于平缓。从理论上分析，提取时间并不是越长越好，因为柞蚕雄蛾浓缩液是一种具有生物活性的物质，其长时间处于温度较高环境中，更容易失去生物功能，因此，综合考虑最佳提取时间应在3～4 h内。
2.1.3提取水浴温度对浓缩液得率的影响由图4可知，随着提取水浴温度的升高，柞蚕雄蛾浓缩液得率逐渐增大，且增大趋势明显，但考虑到当水温超过60℃时柞蚕雄蛾浓缩液中的有效活性物质易被钝化失活，从而失去其生物保健功能，故最佳提取水浴温度确定为60℃。
2.1.4提取负压对浓缩液得率的影响由图5可知，随提取负压的增大，柞蚕雄蛾浓缩液得率总体呈增大趋势，说明负压增大加快了蛾体细胞破裂的速度，加快了蛾体功能成分向酒精中释出的时间和速度，当压力大于-0.08 MPa时随时间的延长趋势趋于平缓。
2.2正交试验
从表2可以看出，各因素对浓缩液提取得率影响的主次顺序依次为乙醇浓度>提取负压>提取水浴温度>提取时间。根据以上试验结果与分析，最佳提取工艺条件为A3B3C3D3，即使用乙醇含量为95%的食用酒精在水浴温度为60℃、提取负压为-0.09MPa的条件下提取4 h。
2.3最佳工艺条件验证结果
由表3可知，在最佳工艺条件下，浓缩液得率19.09%，高于工艺优化前的得率16.55%；油脂含量0.087%，比优化前大大降低。所得浓缩液清澈透明，感官品质好，脂肪含量低。
3结论与讨论
3.1柞蚕雄蛾浓缩液是一种保存了柞蚕雄蛾体内有效活性成分的高营养制品，由于柞蚕雄蛾体内油脂含量较高，油脂的存在导致了柞蚕雄蛾提取液易酸败、保存时间短及感观差等缺点，而油脂的分离与严格的提取工艺条件密不可分。本研究通过单因素试验及正交试验，确定在使用95%食用酒精、水浴温度60℃、负压-0.09MPa、提取4 h的工艺条件下，柞蚕雄蛾浓缩液得率19.09%。
3.2柞蚕雄蛾体内含有丰富的营养物质及活性成分，这些营养物质及活性成分对人体具有重要的保健功能。传统雄蚕蛾用法是将蚕蛾用高度酒浸泡，制成药酒，这样利用率极低，不仅是对原料的极大浪费，所浸出的有效成分也极其有限。为高效利用柞蚕雄蛾，本研究利用酒精做为浸出剂，通过优化试验，对雄蚕蛾体内的营养成分进行有效萃取，利用冷冻工艺去除脂肪，生产的柞蚕雄蛾浓缩液清澈透明、感观品质好、脂肪含量低，可直接加工成保健品服用或用于勾兑雄蚕蛾酒及饮料等，该生产工艺已获得国家发明专利（专利号：2009 1 0016120.X）。
3.3本研究仅涉及低温负压提取浓缩工艺条件对浓缩液得率的影响，浓缩液中脂肪的分离去除步骤所需离心时间、离心温度、离心速度等工艺研究已发表。该柞蚕雄蛾浓缩液的加工工艺是一项繁琐复杂的提取除杂技术，首先，柞蚕雄蛾浓缩液中的水分含量直接影响到浓缩液得率，长期研究发现，只有在其水分含量浓缩为一特定临界值时通过低温离心分离工艺浓缩液中的油脂才能分离最彻底，才能保证浓缩液清澈的感观和较长的保质期限。其次，在该工艺条件下所提取的柞蚕雄蛾浓缩液基本能保全雄蛾体内所含营养成分，但还有部分脂溶性物质如维生素A、维生素E等随油脂的去除而被分离，对于如何更多地保留这些营养物质，还需进一步研究。
参考文献：
[1]
吕继业，李金志，孙继红，等.柞蚕雄蛾营养成分的测定与评价[J].北方蚕业，2013，34（3）：6-8.
[2]顾美儿，时连根，傅淑清.雄蚕蛾开发利用研究进展[J].蚕桑通报，2007，38（1）：15-18.
[3]辽宁省蚕业科学研究所.中国柞蚕[M].沈阳：辽宁科学技术出版社，2003：584-593.
[4]邹德庆，郑淑湘，阮怀军，等.柞蚕雄蛾浓缩液对肝细胞的保护和对高脂血症的治疗效果[J].蚕业科学，2006，32（4）：530-534.
[5]邹德庆，张维东，范作卿，等.柞蚕雄蛾浓缩液对大鼠荷W256癌肉瘤放疗后免疫功能的试验研究[J].北方蚕业，2007（4）：9-11.
[6]邹德庆，郑淑湘，李全宏，等.柞蚕雄蛾浓缩液成分及免疫调节功能的研究[J].食品科学，2006（5）：231-234.
[7]邹德庆，范作卿，李智峰，等.柞蚕雄蛾浓缩液生产的部分工艺条件改进与产品质量检测[J].蚕业科学，2012，38（5）：942-948.