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【摘 要】 目的：通过对复方柳安咖注射液进行细菌内毒素检查法研究，建立复方柳安咖注射液细菌内毒素检查方法。方法：采用2010年版《中国药典》（二部）附录XI E细菌内毒素检查法进行。结果：复方柳安咖注射液经80倍及以上稀释，对细菌内毒素检查法（凝胶法）无干扰作用。结论：细菌内毒素检查法适用于复方柳安咖注射液中内毒素的检测。
【关键词】 复方柳安咖注射液；细菌内毒素检查；干扰试验
【中图分类号】R927.1 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2015）17-0009-04
Abstract：Objective To establish a method for the bacterial endotoxin test of compound sodium salicylate antipyrine and caffeine injection. Method The bacterial endotoxin test was carried out according to the appendix XI E of Chinese Pharmacopoeia （Vol.Ⅱ，edition 2010）.Result The compound sodium salicylate antipyrine and caffeine injection by diluting to a concentration of more than eighty times was noninterference for bacterial endotoxin test of gel-clot. Conclusion The bacterial endotoxins test is suitable for the detection of endotoxin in the compound sodium salicylate antipyrine and caffeine injection.
Keywords：compound sodium salicylate antipyrine and caffeine injection；bacterial endotoxins； interference test
复方柳安咖注射液又名撒痛风注射液，是水杨酸钠、安替比林、咖啡因的复方制剂，临床主要用于治疗风湿、类风湿关节炎，急、慢性关节炎，痛风，疼痛，发热。该品种收载于《国家药品标准》第十一册[1]。目前，该复方制剂的质量控制研究主要采用HPLC法对复方柳安咖注射液中的三种主要成分进行含量测定与分析[2-4]，而对细菌内毒素的检查未见有关方面的报道[5-6]。本实验参照2010年版《中国药典》（二部）附录XI E细菌内毒素检查法[7]，采用两个厂家的鲎试剂对来自3个生产企业12个批次的复方柳安咖注射液进行细菌内毒素的检查，考察并建立该品种细菌内毒素的检查方法。
1 仪器与材料
1.1 仪器 Binder FD115烘箱（德国BINDER公司）；GL-88B旋涡混合器（江苏海门麒麟医用仪器厂）；TW20恒温水浴（德国JULABO公司）。
1.2 试药试剂 鲎试剂（TAL，批号：1406032，λ=0.5EU/ml，规格：0.1ml/Amp，湛江安度斯生物有限公司；批号：1404170，λ=0.5EU/ml，规格：0.1 ml/Amp，湛江博康海洋生物有限公司；批号：1405250，λ=0.25EU/ml，规格：0.1 ml/Amp，湛江博康海洋生物有限公司）；细菌内毒素工作标准品（WSE，批号：201175，规格：120 ml/Amp，中国食品药品检定研究院）；细菌内毒素检查用水（WBET，批号：1309230，湛江安度斯生物有限公司；批号：1311080，湛江博康海洋生物有限公司）；复方柳安咖注射液（批号：130707、130902、130903、130904，西南药业股份有限公司；批号：14041127、14031217、14031317、14031417，四川美大康华康药业有限公司；批号：121206、121207、131002、131003，桂林南药股份有限公司）。
2 方法与结果
2.1 鲎试剂灵敏度（λ）复核 将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15 min，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30 s。每个浓度均平行做4管，另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照管。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，放入（37±1）℃的恒温水浴中，保温（60±2）min后观察。将试管缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成不结实、变形并从管壁滑脱者为阴性。按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc）。λc =antilg（∑Χ/4），当λc在0.5～2.0λ范围内时，鲎试剂灵敏度符合规定，可用于细菌内毒素检查。结果表明2个批号的鲎试剂的λc值均在0.5～2.0λ范围内，结果见表1。
2.2 细菌内毒素限值L的确立 根据说明书中复方柳安咖注射液用法用量：皮下注射或肌内注射，一次2ml（1支），一日1～2次。按2010年版《中国药典》（二部）附录Ⅺ E细菌内毒素检查法计算内毒素限值：根据公式L=K/M（其中K为人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，注射剂K=5EU/（kg·h），M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，按体重60 kg计算，M=2ml/（60·kg·h）；限值L=150 EU/ml，最终确立复方柳安咖注射液细菌内毒素限值L为：应小于150 EU/ml。 2.3 最大有效稀释倍数（MVD）的计算 按公式MVD=CL/λ计算，L=150 EU/ml，C为供试品溶液浓度，当L以EU/ml表示时，则C等于1.0 ml/ml，λ为鲎试剂标示灵敏度，目前市售TAL最高灵敏度为0.03 EU/ml，可计算得复方柳安咖注射液MVD=150 EU/ml/0.03125 EU/ml=4800倍。由此可知，样品可在稀释倍数小于4800倍的情况下进行内毒素检查。
2.4 复方柳安咖注射液干扰预试验 每个生产厂家挑选一批进行干扰预试验，用细菌内毒素检查用水WBET对复方柳安咖注射液进行稀释，使稀释倍数分别为10、20、40、80、160、320、640倍，将此系列溶液记为样品供试液，取相应浓度样品稀释液加入标准内毒素溶液制成内毒素浓度为2λ和0.25λ的样品供试液，取TAL（批号：1404170）与上述系列溶液进行反应，每一浓度重复2管。结果见表2。
由表2预干扰试验结果可初步了解，复方柳安咖注射液经40倍及以上稀释对TAL与内毒素的反应无干扰。为进一步确证有无干扰因素，用复方柳安咖注射液80倍稀释液进行如下干扰试验。
2.5 复方柳安咖注射液干扰试验 为进一步确认复方柳安咖注射液在作80倍稀释后对鲎试剂无干扰作用，按2010年版《中国药典》（二部）附录Ⅺ E细菌内毒素检查法“供试品干扰试验”项下规定进行。将来自3个厂家共9批的复方柳安咖注射液分别用细菌内毒素检查用水（WBET）作80倍稀释。用WBET及80倍稀释的复方柳安咖注射液分别将细菌内毒素标准品（WSE）配成浓度为1.0、0.5、0.25、0.125 EU/ml的试验液，用两批λ为0.5 EU/ml的不同厂家的TAL进行试验，每个浓度平行4管，结果见表3、4。
实验结果按Es= antilg（∑XS/4）和Et= antilg（∑Xt/4）计算，其中XS和Xt分别为WBET稀释系列和80倍稀释的复方柳安咖注射液稀释系列的反应终点浓度的对数值。当在0.5λ～2.0λ范围内时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。由表3、4结果可知，复方柳安咖注射液在80倍稀释时，对细菌内毒素检查法无干扰作用。
2.6 复方柳安咖注射液凝胶限度试验 按拟订的细菌内毒素限值L=150 EU/ml，用灵敏度为0.25 EU/ml的鲎试剂对不同厂家的复方柳安咖注射液进行细菌内毒素检查。取12个批次的复方柳安咖注射液样品，分别用WBET稀释至600倍浓度的溶液为供试品管，用作300倍稀释的样品溶液与浓度为1.00 EU/ml的内毒素溶液等体积混合，制成供试品阳性管，以0.5 EU/ml的内毒素溶液为阳性管，WBET为阴性管，（37±1）℃的恒温，（60±2）min后观察结果（均设2个平行管），详见表5。
由表5可知，复方柳安咖注射液细菌内毒素含量均低于150 EU/ml，符合拟定的限值要求。
3 讨论
细菌内毒素检查法是近年来发展较快的用于检测药品及其中间品内毒素污染的一种方法。在美国、欧洲及日本等发达国家，大部分的注射剂均采用细菌内毒素检查法。我国于1990年将该法收载入《中国药典》，自此，采用该方法检测细菌内毒素的品种逐年增多。
研究结果发现，用鲎试剂对三批复方柳安咖注射液进行干扰试验，Et结果均在0.5～2.0 Es范围内，表明复方柳安咖注射液经80倍以上稀释对细菌内毒素检查法（凝胶法）无干扰，对12批不同厂家的复方柳安咖注射液依法检验，结果均符合2010年版《中国药典》规定，合格率为100%，其细菌内毒素项可拟订为：取本品依2010年版《中国药典》（二部）附录XI E项下检查，每1ml中含细菌内毒素的量应小于150 EU。
复方柳安咖注射液现行质量标准为《化学药品地方标准上升国家标准》WS-10001-（HD-1087）-2002，其安全性检查项目仅有无菌项。根据《化学药品注射剂安全性检查法应用指导原则》[8]，生产工艺易污染细菌内毒素的肌内注射用注射剂，应考虑设细菌内毒素检查项。复方柳安咖注射液临床使用为皮下注射或肌内注射，而现行标准中并未收载细菌内毒素检查项，为提高复方柳安咖注射液临床用药的安全性，加强对注射液的质量控制，建议增订该项目。
参考文献
[1]WS-10001-（HD-1087）-2002.复方柳安咖注射液[S].
[2]莫文电，石文松，杨帆.HPLC法同时测定复方柳安咖注射液中3组分的含量[J].中国药师，2008，11（9）：1081-1083.
[3]岑淑姬，辛俊衡.HPLC法同时测定复方柳安咖注射液中水杨酸钠和安替比林的含量[J].广西医科大学学报，2008，25（5）：762-763.
[4]陈华文，辛俊衡.HPLC测定复方柳安咖注射液中咖啡因的含量[J].首都医药，2008（9）：51-52.
[5]辛俊衡，汪锌华.高效液相色谱法同时测定复方柳安咖注射液中3组分含量[J].中国药业，2008，17（18）：39-40.
[6]丁培芳，崔郭勤.高效液相色谱法测定井冈水杨酸钠水剂中水杨酸钠含量[J].广东化工，2011，38（8）：139-140.
[7]国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部）[S].北京：中国医药科技出版社，2010：附录99-102.
[8]国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部）[S].北京：中国医药科技出版社，2010：附录212.
（收稿日期：2015.06.04）
【关键词】 复方柳安咖注射液；细菌内毒素检查；干扰试验
【中图分类号】R927.1 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2015）17-0009-04
Abstract：Objective To establish a method for the bacterial endotoxin test of compound sodium salicylate antipyrine and caffeine injection. Method The bacterial endotoxin test was carried out according to the appendix XI E of Chinese Pharmacopoeia （Vol.Ⅱ，edition 2010）.Result The compound sodium salicylate antipyrine and caffeine injection by diluting to a concentration of more than eighty times was noninterference for bacterial endotoxin test of gel-clot. Conclusion The bacterial endotoxins test is suitable for the detection of endotoxin in the compound sodium salicylate antipyrine and caffeine injection.
Keywords：compound sodium salicylate antipyrine and caffeine injection；bacterial endotoxins； interference test
复方柳安咖注射液又名撒痛风注射液，是水杨酸钠、安替比林、咖啡因的复方制剂，临床主要用于治疗风湿、类风湿关节炎，急、慢性关节炎，痛风，疼痛，发热。该品种收载于《国家药品标准》第十一册[1]。目前，该复方制剂的质量控制研究主要采用HPLC法对复方柳安咖注射液中的三种主要成分进行含量测定与分析[2-4]，而对细菌内毒素的检查未见有关方面的报道[5-6]。本实验参照2010年版《中国药典》（二部）附录XI E细菌内毒素检查法[7]，采用两个厂家的鲎试剂对来自3个生产企业12个批次的复方柳安咖注射液进行细菌内毒素的检查，考察并建立该品种细菌内毒素的检查方法。
1 仪器与材料
1.1 仪器 Binder FD115烘箱（德国BINDER公司）；GL-88B旋涡混合器（江苏海门麒麟医用仪器厂）；TW20恒温水浴（德国JULABO公司）。
1.2 试药试剂 鲎试剂（TAL，批号：1406032，λ=0.5EU/ml，规格：0.1ml/Amp，湛江安度斯生物有限公司；批号：1404170，λ=0.5EU/ml，规格：0.1 ml/Amp，湛江博康海洋生物有限公司；批号：1405250，λ=0.25EU/ml，规格：0.1 ml/Amp，湛江博康海洋生物有限公司）；细菌内毒素工作标准品（WSE，批号：201175，规格：120 ml/Amp，中国食品药品检定研究院）；细菌内毒素检查用水（WBET，批号：1309230，湛江安度斯生物有限公司；批号：1311080，湛江博康海洋生物有限公司）；复方柳安咖注射液（批号：130707、130902、130903、130904，西南药业股份有限公司；批号：14041127、14031217、14031317、14031417，四川美大康华康药业有限公司；批号：121206、121207、131002、131003，桂林南药股份有限公司）。
2 方法与结果
2.1 鲎试剂灵敏度（λ）复核 将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15 min，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30 s。每个浓度均平行做4管，另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照管。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，放入（37±1）℃的恒温水浴中，保温（60±2）min后观察。将试管缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成不结实、变形并从管壁滑脱者为阴性。按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc）。λc =antilg（∑Χ/4），当λc在0.5～2.0λ范围内时，鲎试剂灵敏度符合规定，可用于细菌内毒素检查。结果表明2个批号的鲎试剂的λc值均在0.5～2.0λ范围内，结果见表1。
2.2 细菌内毒素限值L的确立 根据说明书中复方柳安咖注射液用法用量：皮下注射或肌内注射，一次2ml（1支），一日1～2次。按2010年版《中国药典》（二部）附录Ⅺ E细菌内毒素检查法计算内毒素限值：根据公式L=K/M（其中K为人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，注射剂K=5EU/（kg·h），M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，按体重60 kg计算，M=2ml/（60·kg·h）；限值L=150 EU/ml，最终确立复方柳安咖注射液细菌内毒素限值L为：应小于150 EU/ml。 2.3 最大有效稀释倍数（MVD）的计算 按公式MVD=CL/λ计算，L=150 EU/ml，C为供试品溶液浓度，当L以EU/ml表示时，则C等于1.0 ml/ml，λ为鲎试剂标示灵敏度，目前市售TAL最高灵敏度为0.03 EU/ml，可计算得复方柳安咖注射液MVD=150 EU/ml/0.03125 EU/ml=4800倍。由此可知，样品可在稀释倍数小于4800倍的情况下进行内毒素检查。
2.4 复方柳安咖注射液干扰预试验 每个生产厂家挑选一批进行干扰预试验，用细菌内毒素检查用水WBET对复方柳安咖注射液进行稀释，使稀释倍数分别为10、20、40、80、160、320、640倍，将此系列溶液记为样品供试液，取相应浓度样品稀释液加入标准内毒素溶液制成内毒素浓度为2λ和0.25λ的样品供试液，取TAL（批号：1404170）与上述系列溶液进行反应，每一浓度重复2管。结果见表2。
由表2预干扰试验结果可初步了解，复方柳安咖注射液经40倍及以上稀释对TAL与内毒素的反应无干扰。为进一步确证有无干扰因素，用复方柳安咖注射液80倍稀释液进行如下干扰试验。
2.5 复方柳安咖注射液干扰试验 为进一步确认复方柳安咖注射液在作80倍稀释后对鲎试剂无干扰作用，按2010年版《中国药典》（二部）附录Ⅺ E细菌内毒素检查法“供试品干扰试验”项下规定进行。将来自3个厂家共9批的复方柳安咖注射液分别用细菌内毒素检查用水（WBET）作80倍稀释。用WBET及80倍稀释的复方柳安咖注射液分别将细菌内毒素标准品（WSE）配成浓度为1.0、0.5、0.25、0.125 EU/ml的试验液，用两批λ为0.5 EU/ml的不同厂家的TAL进行试验，每个浓度平行4管，结果见表3、4。
实验结果按Es= antilg（∑XS/4）和Et= antilg（∑Xt/4）计算，其中XS和Xt分别为WBET稀释系列和80倍稀释的复方柳安咖注射液稀释系列的反应终点浓度的对数值。当在0.5λ～2.0λ范围内时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。由表3、4结果可知，复方柳安咖注射液在80倍稀释时，对细菌内毒素检查法无干扰作用。
2.6 复方柳安咖注射液凝胶限度试验 按拟订的细菌内毒素限值L=150 EU/ml，用灵敏度为0.25 EU/ml的鲎试剂对不同厂家的复方柳安咖注射液进行细菌内毒素检查。取12个批次的复方柳安咖注射液样品，分别用WBET稀释至600倍浓度的溶液为供试品管，用作300倍稀释的样品溶液与浓度为1.00 EU/ml的内毒素溶液等体积混合，制成供试品阳性管，以0.5 EU/ml的内毒素溶液为阳性管，WBET为阴性管，（37±1）℃的恒温，（60±2）min后观察结果（均设2个平行管），详见表5。
由表5可知，复方柳安咖注射液细菌内毒素含量均低于150 EU/ml，符合拟定的限值要求。
3 讨论
细菌内毒素检查法是近年来发展较快的用于检测药品及其中间品内毒素污染的一种方法。在美国、欧洲及日本等发达国家，大部分的注射剂均采用细菌内毒素检查法。我国于1990年将该法收载入《中国药典》，自此，采用该方法检测细菌内毒素的品种逐年增多。
研究结果发现，用鲎试剂对三批复方柳安咖注射液进行干扰试验，Et结果均在0.5～2.0 Es范围内，表明复方柳安咖注射液经80倍以上稀释对细菌内毒素检查法（凝胶法）无干扰，对12批不同厂家的复方柳安咖注射液依法检验，结果均符合2010年版《中国药典》规定，合格率为100%，其细菌内毒素项可拟订为：取本品依2010年版《中国药典》（二部）附录XI E项下检查，每1ml中含细菌内毒素的量应小于150 EU。
复方柳安咖注射液现行质量标准为《化学药品地方标准上升国家标准》WS-10001-（HD-1087）-2002，其安全性检查项目仅有无菌项。根据《化学药品注射剂安全性检查法应用指导原则》[8]，生产工艺易污染细菌内毒素的肌内注射用注射剂，应考虑设细菌内毒素检查项。复方柳安咖注射液临床使用为皮下注射或肌内注射，而现行标准中并未收载细菌内毒素检查项，为提高复方柳安咖注射液临床用药的安全性，加强对注射液的质量控制，建议增订该项目。
参考文献
[1]WS-10001-（HD-1087）-2002.复方柳安咖注射液[S].
[2]莫文电，石文松，杨帆.HPLC法同时测定复方柳安咖注射液中3组分的含量[J].中国药师，2008，11（9）：1081-1083.
[3]岑淑姬，辛俊衡.HPLC法同时测定复方柳安咖注射液中水杨酸钠和安替比林的含量[J].广西医科大学学报，2008，25（5）：762-763.
[4]陈华文，辛俊衡.HPLC测定复方柳安咖注射液中咖啡因的含量[J].首都医药，2008（9）：51-52.
[5]辛俊衡，汪锌华.高效液相色谱法同时测定复方柳安咖注射液中3组分含量[J].中国药业，2008，17（18）：39-40.
[6]丁培芳，崔郭勤.高效液相色谱法测定井冈水杨酸钠水剂中水杨酸钠含量[J].广东化工，2011，38（8）：139-140.
[7]国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部）[S].北京：中国医药科技出版社，2010：附录99-102.
[8]国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部）[S].北京：中国医药科技出版社，2010：附录212.
（收稿日期：2015.06.04）