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摘 要：目的：探讨粒-巨噬细胞集落刺激因子对化疗后大鼠结肠吻合口愈合的影响情况。方法：28只Wistar大鼠实施结肠吻合术，术后随机分草酸铂组（A组）和草酸铂 GM-CSF组（B组），每组14只，B组于吻合口两侧浆膜下层注射GM-CSF。术后24小时两组腹腔注射草酸铂25mg/kg。测定吻合口爆破压、羟脯氨酸含量及胶原纤维含量。结果术后第7天二组均出现吻合口漏，分别为3例和2例，差异无统计学意义；二组爆破压值及羟脯氨酸含量分别为：（169.26±4.31）mmHg、（191.15±1.84）mmHg；（9.86±0.40）μg/mg、（11.38±0.50）μg/mg；Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维含量分别为：（1.08±0.11）p·μm2、（1.43±0.08）p·μm2；（1.06±0.10）p·μm2、（1.34±0.09）p·μm2。A组与B组比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论：局部注射GM-CSF可促进结肠吻合口愈合。
关键词：粒-巨噬细胞集落刺激因子； 药物疗法； 伤口愈合
中图分类号：TQ464 文献标识码：A 文章编号：1006-3315（2015）01-178-002
中晚期结直肠癌术后易出现转移，预后效果不佳，因此，大肠癌术后辅助治疗受到国内外学者的重视。手术联合术后早期腹腔化疗可显著提高大肠癌患者无病生存期与5年生存率[1]，但化疗药物可延缓消化道吻合口的愈合[2-4]，本文以Wistar 大鼠为实验模型，探讨粒-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）对化疗后大鼠结肠吻合口愈合的影响情况，从而为临床应用提供必要的实验依据。
一、材料与方法
1.材料
草酸铂（江苏恒瑞医药有限公司）。GM-CSF（厦门特宝生物工程有限公司）。羟脯氨酸测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）。Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维试剂盒（北京中杉金桥生物工程有限公司）。
2.实验分组
清洁级Wistar大鼠28只，随机分二组：A组：结肠吻合术 术后腹腔注射草酸铂；B组：结肠吻合术 术中局部注射GM-CSF 术后腹腔注射草酸铂。
3.动物模型的建立
Wistar大鼠术前禁食12h，2.5%戊巴比妥钠40mg/kg麻醉。麻醉成功后四肢固定，常规进腹，行结肠断端吻合术。
4.给药方式
草酸铂溶于5%葡萄糖溶液50ml中，终浓度为1mg/ml，于术后24h按25mg/kg腹腔注射；B组术中结肠吻合完成后，在吻合口两侧浆膜下层用21G注射器注射GM-CSF50μg。
5.吻合口爆破压测定
移出以吻合口为中心长约6cm肠管，远端固定于压力传感器（YH-4，北京航天医学工程研究所），近端连接注射泵（WZ-50C66 浙江大学医学仪器有限公司），以2ml/min速率注入生理盐水，记录压力曲线突然降低时的数值为肠吻合口爆破压值。
6.羟脯氨酸含量的测定
取0.5cm×0.5cm大小的吻合口组织保存于-80℃深低温冰箱，按羟脯氨酸测定试剂盒说明检测。
7.胶原纤维含量测定
免疫组化染色过程按试剂盒说明进行，Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维染成棕黄色颗粒或片状。由德国莱卡Q550IW图像分析仪进行计算机图像分析，结果取像素（pixels，p）和面积（μm2）平均值的乘积。
8.统计学分析
实验数据以均数±标准差（±s）表示，资料统计采用统计学软件SASFor Windows6.12分析，采用单因素方差分析、SNK-q检验和χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
二、结果
1.大体形态的观察
术后各组大鼠无一例死亡，第7天均再次接受腹腔麻醉，剖腹探查，观察有无吻合口漏发生。吻合口漏出现情况：A组3例，B组2例，差异无统计学意义。
2.爆破压测定结果（表1）
术后第7天，A、B组之间平均爆破压差异存在统计学意义（P<0.01），提示局部注射GM-CSF可能促进化疗后大肠吻合口愈合。
3.羟脯氨酸含量测定结果（表1）
A组羟脯氨酸含量低，与B两组比较差异有统计学意义（P=0.0001）。
4.胶原纤维含量测定结果
免疫定量显示Ⅰ型胶原纤维分别为（1.08±0.11）p·μm2、（1.43 ±0.08）p·μm2；Ⅲ型胶原纤维分别为（1.06±0.10）p·μm2、（1.34±0.09）p·μm2。A组Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维含量低于B组（P<0.01）。
三、讨论
结直肠癌术后复发及转移是患者预后不良的重要因素，所以术后辅助治疗已得到认可。术后腹腔化疗可使化疗药物与腹膜表面充分接触，直接杀灭瘤细胞，对预防复发和腹膜种植有独特的优势。时机倾向于手术切除原发肿瘤后24h开始[5-6]，Pestieau等[7]实验结果表明，草酸铂腹腔化疗对消除结直肠癌术后的微观转移灶有良好的效果。
国外学者主张采用[8]：（1）爆破压；（2）羟脯氨酸含量；（3）胶原纤维含量作为衡量胃肠吻合口愈合情况的指标。胶原纤维组织是维持胃肠吻合口张力的主要因素，位于胃肠黏膜下层，生物化学分析显示Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维含量占总胶原纤维的88%[9]。多项研究表明：吻合口愈合主要依赖于胶原纤维合成的总量、速率及成熟度[10]。研究表明，局部注射GM-CSF能促进术中放射治疗条件下结肠吻合口的愈合，其机制可能为[11-12]：动员吻合口周围组织单核细胞、淋巴细胞及巨噬细胞分化及迁移，巨噬细胞可释放一系列的细胞活素、生长因子，促进成纤维细胞的分裂与增殖，加快胶原纤维合成，改善创面微循环，提供组织修复所必需的氧和营养物质。本实验B组爆破压、羟脯氨酸含量及胶原纤维含量均高于A组，组间比较差异存在统计学意义（P<0.05），提示局部注射GM-CSF可促进术后腹腔化疗条件下结肠吻合口的愈合。但局部注射GM-CSF是否涉及血液系统改变及对机体的影响仍不明确，需进一步研究证实。 参考文献：
[1]Koppe MJ，Boerman OC，Oyen WJ，et al. Peritoneal carcinomatosis of colorectal origin：incidence and current treatment strategies. Ann Surg，2006，243：212-222
[2]Erdem E，Dinc S，Erdem D，et al. Effects of intraperitoneal chemotherapy and GM-CSF on anastomotic healing：an experimental study in rats.J Surg Res，2002，108：1-6
[3]Cetinkaya K，Dinc S，Gulcelik MA，etal. Granulocyte macrophage-colony stimulating factor improves impaired anastomotic wound healing in
rats treated with intraperitoneal mitomycin-C. Surg Today，2005，35：290-294
[4]Kanellos I，Christoforidis E，Kanellos D，etal.The healing of colon anastomosis covered with fibrin glue after early postoperative intraperitonealchemotherapy. Tech Coloproctol，2006，10：115-120
[5]Pestieau SR，Sugarbaker PH. Treatment of primary colon cancer with peritoneal carcinomatosis：comparison of concomitant vs. delayed manage-ment. Dis Colon Rectum，2000，43：1341-1346.
[6]Berg J，Gebhardt MC，Rand WM. Effect of timing of postoperative chemotherapy on survival of dogs with osteosarcoma. Cancer，1997，79：1343-1350.
[7]Pestieau SR，Belliveau JF，Griffin H，et al. Pharmacokinetics of intraperitoneal oxaliplatin：experimental studies. J Surg Oncol，2001，76：106-114.
[8]Thompson SK，Chang EY，Jobe BA. Clinical review：Healing in gastrointestinal anastomoses，part I. Microsurgery，2006，26：131-136.
[9]Thornton FJ，Barbul A. Healing in the gastrointestinal tract. Surg Clin North Am，1997，77：549-573
[10]Witte MB，Barbul A. General principles of wound healing. Surg Clin North Am，1997，77：509-528
[11]Dinc S，Ozbirecikli B，Gulcelik MA，et al. The effects of locally injected granulocyte macrophage-colony stimulating factor on the healing of intraop-
eratively irradiated intestinal anastomoses in rats. J Exp Clin Cancer Res，2004，23：77-82
[12]Dinc S，Alagol H，Gulcelik MA，et al. Locally applied granulocyte-macrophage colony-stimulating factor improves the impaired bowel anastomoses in rats with long-term corticosteroid treatment. World J Surg，2002，26：1208-1213
关键词：粒-巨噬细胞集落刺激因子； 药物疗法； 伤口愈合
中图分类号：TQ464 文献标识码：A 文章编号：1006-3315（2015）01-178-002
中晚期结直肠癌术后易出现转移，预后效果不佳，因此，大肠癌术后辅助治疗受到国内外学者的重视。手术联合术后早期腹腔化疗可显著提高大肠癌患者无病生存期与5年生存率[1]，但化疗药物可延缓消化道吻合口的愈合[2-4]，本文以Wistar 大鼠为实验模型，探讨粒-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）对化疗后大鼠结肠吻合口愈合的影响情况，从而为临床应用提供必要的实验依据。
一、材料与方法
1.材料
草酸铂（江苏恒瑞医药有限公司）。GM-CSF（厦门特宝生物工程有限公司）。羟脯氨酸测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）。Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维试剂盒（北京中杉金桥生物工程有限公司）。
2.实验分组
清洁级Wistar大鼠28只，随机分二组：A组：结肠吻合术 术后腹腔注射草酸铂；B组：结肠吻合术 术中局部注射GM-CSF 术后腹腔注射草酸铂。
3.动物模型的建立
Wistar大鼠术前禁食12h，2.5%戊巴比妥钠40mg/kg麻醉。麻醉成功后四肢固定，常规进腹，行结肠断端吻合术。
4.给药方式
草酸铂溶于5%葡萄糖溶液50ml中，终浓度为1mg/ml，于术后24h按25mg/kg腹腔注射；B组术中结肠吻合完成后，在吻合口两侧浆膜下层用21G注射器注射GM-CSF50μg。
5.吻合口爆破压测定
移出以吻合口为中心长约6cm肠管，远端固定于压力传感器（YH-4，北京航天医学工程研究所），近端连接注射泵（WZ-50C66 浙江大学医学仪器有限公司），以2ml/min速率注入生理盐水，记录压力曲线突然降低时的数值为肠吻合口爆破压值。
6.羟脯氨酸含量的测定
取0.5cm×0.5cm大小的吻合口组织保存于-80℃深低温冰箱，按羟脯氨酸测定试剂盒说明检测。
7.胶原纤维含量测定
免疫组化染色过程按试剂盒说明进行，Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维染成棕黄色颗粒或片状。由德国莱卡Q550IW图像分析仪进行计算机图像分析，结果取像素（pixels，p）和面积（μm2）平均值的乘积。
8.统计学分析
实验数据以均数±标准差（±s）表示，资料统计采用统计学软件SASFor Windows6.12分析，采用单因素方差分析、SNK-q检验和χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
二、结果
1.大体形态的观察
术后各组大鼠无一例死亡，第7天均再次接受腹腔麻醉，剖腹探查，观察有无吻合口漏发生。吻合口漏出现情况：A组3例，B组2例，差异无统计学意义。
2.爆破压测定结果（表1）
术后第7天，A、B组之间平均爆破压差异存在统计学意义（P<0.01），提示局部注射GM-CSF可能促进化疗后大肠吻合口愈合。
3.羟脯氨酸含量测定结果（表1）
A组羟脯氨酸含量低，与B两组比较差异有统计学意义（P=0.0001）。
4.胶原纤维含量测定结果
免疫定量显示Ⅰ型胶原纤维分别为（1.08±0.11）p·μm2、（1.43 ±0.08）p·μm2；Ⅲ型胶原纤维分别为（1.06±0.10）p·μm2、（1.34±0.09）p·μm2。A组Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维含量低于B组（P<0.01）。
三、讨论
结直肠癌术后复发及转移是患者预后不良的重要因素，所以术后辅助治疗已得到认可。术后腹腔化疗可使化疗药物与腹膜表面充分接触，直接杀灭瘤细胞，对预防复发和腹膜种植有独特的优势。时机倾向于手术切除原发肿瘤后24h开始[5-6]，Pestieau等[7]实验结果表明，草酸铂腹腔化疗对消除结直肠癌术后的微观转移灶有良好的效果。
国外学者主张采用[8]：（1）爆破压；（2）羟脯氨酸含量；（3）胶原纤维含量作为衡量胃肠吻合口愈合情况的指标。胶原纤维组织是维持胃肠吻合口张力的主要因素，位于胃肠黏膜下层，生物化学分析显示Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维含量占总胶原纤维的88%[9]。多项研究表明：吻合口愈合主要依赖于胶原纤维合成的总量、速率及成熟度[10]。研究表明，局部注射GM-CSF能促进术中放射治疗条件下结肠吻合口的愈合，其机制可能为[11-12]：动员吻合口周围组织单核细胞、淋巴细胞及巨噬细胞分化及迁移，巨噬细胞可释放一系列的细胞活素、生长因子，促进成纤维细胞的分裂与增殖，加快胶原纤维合成，改善创面微循环，提供组织修复所必需的氧和营养物质。本实验B组爆破压、羟脯氨酸含量及胶原纤维含量均高于A组，组间比较差异存在统计学意义（P<0.05），提示局部注射GM-CSF可促进术后腹腔化疗条件下结肠吻合口的愈合。但局部注射GM-CSF是否涉及血液系统改变及对机体的影响仍不明确，需进一步研究证实。 参考文献：
[1]Koppe MJ，Boerman OC，Oyen WJ，et al. Peritoneal carcinomatosis of colorectal origin：incidence and current treatment strategies. Ann Surg，2006，243：212-222
[2]Erdem E，Dinc S，Erdem D，et al. Effects of intraperitoneal chemotherapy and GM-CSF on anastomotic healing：an experimental study in rats.J Surg Res，2002，108：1-6
[3]Cetinkaya K，Dinc S，Gulcelik MA，etal. Granulocyte macrophage-colony stimulating factor improves impaired anastomotic wound healing in
rats treated with intraperitoneal mitomycin-C. Surg Today，2005，35：290-294
[4]Kanellos I，Christoforidis E，Kanellos D，etal.The healing of colon anastomosis covered with fibrin glue after early postoperative intraperitonealchemotherapy. Tech Coloproctol，2006，10：115-120
[5]Pestieau SR，Sugarbaker PH. Treatment of primary colon cancer with peritoneal carcinomatosis：comparison of concomitant vs. delayed manage-ment. Dis Colon Rectum，2000，43：1341-1346.
[6]Berg J，Gebhardt MC，Rand WM. Effect of timing of postoperative chemotherapy on survival of dogs with osteosarcoma. Cancer，1997，79：1343-1350.
[7]Pestieau SR，Belliveau JF，Griffin H，et al. Pharmacokinetics of intraperitoneal oxaliplatin：experimental studies. J Surg Oncol，2001，76：106-114.
[8]Thompson SK，Chang EY，Jobe BA. Clinical review：Healing in gastrointestinal anastomoses，part I. Microsurgery，2006，26：131-136.
[9]Thornton FJ，Barbul A. Healing in the gastrointestinal tract. Surg Clin North Am，1997，77：549-573
[10]Witte MB，Barbul A. General principles of wound healing. Surg Clin North Am，1997，77：509-528
[11]Dinc S，Ozbirecikli B，Gulcelik MA，et al. The effects of locally injected granulocyte macrophage-colony stimulating factor on the healing of intraop-
eratively irradiated intestinal anastomoses in rats. J Exp Clin Cancer Res，2004，23：77-82
[12]Dinc S，Alagol H，Gulcelik MA，et al. Locally applied granulocyte-macrophage colony-stimulating factor improves the impaired bowel anastomoses in rats with long-term corticosteroid treatment. World J Surg，2002，26：1208-1213