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摘要：采用HPLC分别测定了橙色果肉甜瓜Homoka和对照白色果肉甜瓜M01-3 六个发育时期的β-胡萝卜素及叶黄素含量，并对相关基因作了生物信息学及表达分析。结果表明：随果实发育，橙色甜瓜β-胡萝卜素含量显著升高，在接近成熟时达到积累高峰，成熟时又有所降低；两种甜瓜果实中β-胡萝卜素合成相关基因PSY2、PDS、ZDS、LCY-b的表达量均升高，但橙色甜瓜中PDS和LCY-b表达量高于白色甜瓜；β-胡萝卜素的裂解酶基因CCD1在橙色甜瓜中表达下调，而在白色甜瓜中上调。与白色果肉甜瓜M01-3相比，PDS、LCY-b的高表达和CCD1表达的下调可能决定了橙色甜瓜果实中β-胡萝卜素的高积累量。
关键词：甜瓜；果实；β-胡萝卜素；积累
中图分类号：Q786文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）05-0007-06
甜瓜（Cucumis melo L.）是世界重要的园艺作物，其果实营养丰富、芳香味浓郁、口感良好，深受消费者欢迎。甜瓜果肉色泽是甜瓜品质的重要方面，因类胡萝卜素和叶绿素积累量及组分的不同而不同，主要有白色、橙色和绿色等[1]，其中成熟的橙色果肉甜瓜果实中积累大量β-胡萝卜素（β-Carotenoid）[2]。
β-胡萝卜素是植物类胡萝卜素代谢的一个重要产物，摄入人体后被转化为维生素A，从而起到防癌、抗氧化及保护视力的作用[3～6]。β-胡萝卜素由番茄红素经番茄红素β环化酶（Lycopene β-cyclase，LCY-b）催化生成，而ε环化酶（Lycopene ε-cyclase，LCY-e）可催化番茄红素生成δ-胡萝卜素（δ-Carotenoid），最终生成叶黄素（Lutein）[7，8]。在植物中，这些种类繁多的色素既能使植物花和果实展现鲜艳的颜色，又能被裂解成多种脱辅基类胡萝卜素参与特殊香味的形成，进一步代谢，还能生成植物激素，如脱落酸和独角金内酯等，参与植物生长调控[9～13]。对柑橘和甜橙果实类胡萝卜素积累的研究表明，随果实发育，多个参与类胡萝卜素合成的基因共同作用，致使一种或多种类胡萝卜素大量积累而形成特定的果色[14]。虽然甜瓜果色种类较多，但对其色素积累机理的研究较少，本试验基于甜瓜基因组序列，选取白色果肉甜瓜为对照，对橙色果肉甜瓜β-胡萝卜素积累的分子机制进行了研究。
1材料与方法
1.1材料与试剂
供试材料为本实验室选育的橙色果肉厚皮甜瓜Homoka和白色果肉自交系M01-3。于2013年2月25日播种育苗，4月1日定植于山东农业大学园艺实验站日光温室内，花期人工授粉，严格控制自交，常规栽培管理。
RNA提取试剂盒、反转录试剂盒和荧光定量试剂盒等购自大连宝生物公司；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；叶黄素和β-胡萝卜购自Sigma公司，其他试剂为国产分析纯。
1.2基因搜索及生物信息学分析
从甜瓜基因组网站https：//melonomics.net/genome/[15]查询类胡萝卜素代谢相关基因的序列，利用DNAMAN、Bioedit、MEGA4、Tmpred、SPOMA等分子生物学软件作相关基因的生物信息学分析，用Primer 6.0软件设计各基因扩增引物。
1.3半定量及实时荧光定量PCR
采用Trizol法分别提取两种甜瓜授粉后果实6个发育时期的总RNA，反转录合成cDNA，进行半定量及实时荧光定量PCR扩增。内参基因参照Hao等[16]选择Actin基因（登录号：FJ763186），引物序列见表1。
半定量PCR反应程序为：94℃ 3 min；94℃ 30 s，58℃ 45 s，72℃ 1 min，28个循环后拍照对比。实时荧光定量PCR反应程序为：94℃ 3 min；94℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 10 s，40个循环，参照Livak等[17]方法计算目的基因的相对表达量。
1.4甜瓜果实β-胡萝卜素及叶黄素含量测定
采用高效液相色谱技术测定不同时期果实中叶黄素和β-胡萝卜素含量，参数设置为波长：450 nm；灵敏度：0.8 AUFS；流速：1 mL/min；进样时间：45 min。
2结果与分析
2.1甜瓜果实β-胡萝卜素及叶黄素含量
图1结果显示，两种果色甜瓜果肉中叶黄素和β-胡萝卜素含量差异明显。白色果肉品系M01-3随果实发育，两种色素含量下降，成熟时含量最低。橙色果肉品种Homoka随果实发育，β-胡萝卜素呈现先升高后降低的趋势，授粉45 d含量最高，成熟时有所减少；叶黄素含量基本平稳。
2.2类胡萝卜素代谢相关基因的生物信息学分析
为进一步分析甜瓜果实β-胡萝卜素生物合成的分子机制，在甜瓜基因组测序完成的基础上，对类胡萝卜素代谢相关的6个合成酶基因和3个裂解酶基因进行生物信息学分析（表2）。结果显示，参与分析的9个基因中，ZDS的开放阅读框（OFR）最小，为1 086 bp，CCD7的OFR最大，为1 833 bp。除LCY-b外，其余8个基因均含有内
图1M01-3和Homoka甜瓜果实β-胡萝卜素及叶黄素含量
含子，内含子数目从4～13不等。基因结构比较表明（图2），9个基因中，PDS最长，接近10 kb，内含子数目最多，基因结构较复杂；而LCY-b最短，不含内含子，编码区较短，基因结构较简单。综上所述，这9个基因中，PDS基因序列最长。
利用ExPaSy和Strawberry-ProtComp 9.0等软件对该9个基因推导蛋白做了等电点（pI）、分子量（Mr）及亚细胞定位（Sub-cellular location）分析。结果表明，ZDS的分子量最小，CCD7的分子量最大。亚细胞定位结果显示，只有CCD1定位在细胞质，其他8个蛋白均定位在叶绿体中，并含有长度不等的转运肽（表3），表明该8种蛋白质在叶绿体中参与催化反应。叶绿体是质体的一种，能转化成其他有色体，生产和储存色素。在植物果实及花瓣中，有色体含有丰富的类胡萝卜素，使果实呈现黄色、橙色或橙红色。 采用半定量PCR技术，对以上9个基因中参与合成代谢的6个酶基因做了半定量分析（图3）。结果显示，该6个基因中，PSY2、PDS、ZDS和LCY-b的表达趋势相似，均表现为随果实发育表达上调。而PSY1在果实发育初期表达量高，随果实发育表达下调。推测在甜瓜中，两个拷贝的PSY可能存在组织特异性表达，PSY1在绿色组织中表达，而PSY2在果实及花中表达，随果实发育，表现为相反的变化趋势。在半定量水平上没有检测到LCY-e的表达，可能其在果实中的表达量相对较低，或者不表达。两种果实的差异表现为橙色果实PDS和LCY-b表达量明显高于白色果实。推测，PDS和LCY-b的表达差异可能是导致β-胡萝卜素积累差异的主要原因。
2.4类胡萝卜素裂解相关基因的表达分析
裂解双加氧酶（carotenoid cleavage dioxygenases，CCD）可催化β-胡萝卜素氧化裂解成假紫罗酮、β-紫罗酮等参与风味形成的物质，是类胡萝卜素分解代谢的主要途径。为进一步分析果实类胡萝卜素合成物质流的去向，对3个双加氧裂解酶基因做了定量分析。
结果（图4）显示，随果实发育，白色甜瓜CCD1表达略微上调，而橙色甜瓜呈下调趋势。CCD7与CCD8的表达变化趋势不明显，其中在橙色甜瓜果实发育的第5时期（授粉后45 d），CCD7的丰度相对于第1时期突升20多倍，最后降低；白色甜瓜中检测不到CCD8的表达，而橙色甜瓜
1～6：M01-3授粉5、10、15、20、25、30 d； 7～12：Homoken授粉9、18、27、36、45、54 d
表现先上调后下调的趋势，在第4时期的表达最高。β-胡萝卜素是CCD1的底物，分解后生成芳香物质。CCD7和CCD8是参与ABA合成的关键基因，在果实发育后期表达上调可能与果实成熟及脱落有关。综上所述，推测CCD1表达的差异可能是类胡萝卜素积累差异的另一原因。
3讨论
类胡萝卜素是广泛存在于大自然中的一类色素，在植物中参与光合作用的光能吸收和转化反应，同时能使器官带有鲜艳的颜色。植物通过类胡萝卜素代谢调节其组分及含量来响应环境刺激、满足生长需求[18～21]。类胡萝卜素代谢的调控在植物不同组织中存在差异，在绿色组织中主要生成参与光合作用光能吸收和转化的叶黄素、紫黄质和新黄质等色素[22～24]，而在花和果实中则主要在细胞有色体中积累如番茄红素、β-胡萝卜素等特定的色素，这些色素也是植物激素ABA和独脚金内酯的前体物质。
对甜橙类胡萝卜素生物合成的研究发现，随果实成熟，果实中的类胡萝卜素组分、成分及基因表达均发生变化，且其合成物质流偏向β环化分支。本试验发现在果实中LCY-e表达量低，而LCY-b的表达量较高，这和甜橙中的结果相符。PSY被认为是类胡萝卜素代谢途径中最重要的基因[25]，能在转录水平上响应强光、干旱、盐胁迫和高温等胁迫及反馈调节。拟南芥中只有一个拷贝的PSY，而甜瓜中存在两个拷贝，即PSY1和PSY2[18，26～29]，试验发现PSY1在果实发育初期表达较高，随后下调，而PSY2表达趋势相反，可能是因为PSY的表达存在组织特异性，PSY1在绿色组织中表达，而PSY2在非绿色组织中表达，且表现为相反的变化趋势。对类胡萝卜素分解代谢途径的研究发现，裂解酶基因CCD1在白色甜瓜中，随果实发育表达上调，而在橙色甜瓜中，随果实发育表达下调。
参考文献：
[1]Tadmor Y， Burger Y， Katzir N， et al. Melon plants comprising tetra-cis-lycopene： US， US 2012/0324597 A1[P]. 2012-12-20.
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[3]Aluru M， Xu Y， Guo R， et al. Generation of transgenic maize with enhanced provitamin A content[J]. Exp. Bot.， 2008， 59（13）：3551-3562.
[4]Butrum R R， Clifford C K， Lanza E. NCI dietary guidelines： rationale[J]. Am. J. Clin. Nutr.， 1988， 48：888-895.
[5]DellaPenna D， Pogson B J. Vitamin synthesis in plants： tocopherols and carotenoids[J]. Plant Biol.， 2006， 57：711-738.
[6]Paine J A， Shipton C A， Chaggar S， et al. Improving the nutritional value of Golden Rice through increased pro-vitamin A content[J]. Nat. Biotechnol.， 2005， 23：482-487.
[7]Cuttriss A J， Chubb A C， Alawady A， et al. Regulation of lutein biosynthesis and prolamellar body formation in Arabidopsis[J]. Funct. Plant Biol.， 2007， 34（8）：663-672. [8]Cazzonelli C I， Cuttriss A J， Cossetto S B， et al. Regulation of carotenoid composition and shoot branching in Arabidopsis by a chromatin modifying histone methyltransferase， SDG8[J]. Plant Cell， 2009， 21（1）：39-53.
[9]DellaPenna D， Pogson B J. Vitamin synthesis in plants： tocopherols and carotenoids[J]. Annu. Rev. Plant Biol.， 2006， 57：711-738.
[10]Howitt C A， Pogson B J. Carotenoid accumulation and function in seeds and non-green tissues[J]. Plant Cell Environ.， 2006， 29：435-445.
[11]Gomez-Roldan V， Fermas S， Brewer P B， et al. Strigolactone inhibition of shoot branching[J]. Nature， 2008， 455：189-194.
[12]Umehara M， Hanada A， Yoshida S， et al. Inhibition of shoot branching by new terpenoid plant hormones[J]. Nature， 2008， 455：195-200.
[13]Nambara E， Marion-Poll A. Abscisic acid biosynthesis and catabolism[J]. Annu. Rev. Plant Biol.， 2005， 56：165-185.
[14]Rodrigo M J， Marcos J F， Zacarías L. Biochemical and molecular analysis of carotenoid biosynthesis in flavedo of orange （Citrus sinensis L.） during fruit development and maturation[J]. Agric. Food Chem.， 2004， 52（22）：6724-6731.
[15]Garcia-Mas J， Benjak A， Sanseverino W， et al. The genome of melon（Cucumis melo L.） [J]. PNAS， 2012， 109（29）：11872-11877.
[16]Hao H， Ma L Y， Cong H Z， et al. Isolation and characterization of a muskmelon cDNA encoding lycopene beta-cyclase[J]. Gene， 2012， 503：147-151.
[17]Livak K J， Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using realtime quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method[J]. Methods， 2001， 25：402-408.
[18]Li F，Vallabhaneni R， Yu J， et al. The maize phytoene synthase gene family： overlapping roles for carotenogenesis in endosperm， photomorphogenesis， and thermal stress tolerance[J]. Plant Physiol.， 2008， 147：1334-1346.（下转第30页）山 东 农 业 科 学2014，46（5）：12～17Shandong Agricultural Sciences山 东 农 业 科 学第46卷第5期张士刚：苹果TCP转录因子家族生物信息学分析
关键词：甜瓜；果实；β-胡萝卜素；积累
中图分类号：Q786文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）05-0007-06
甜瓜（Cucumis melo L.）是世界重要的园艺作物，其果实营养丰富、芳香味浓郁、口感良好，深受消费者欢迎。甜瓜果肉色泽是甜瓜品质的重要方面，因类胡萝卜素和叶绿素积累量及组分的不同而不同，主要有白色、橙色和绿色等[1]，其中成熟的橙色果肉甜瓜果实中积累大量β-胡萝卜素（β-Carotenoid）[2]。
β-胡萝卜素是植物类胡萝卜素代谢的一个重要产物，摄入人体后被转化为维生素A，从而起到防癌、抗氧化及保护视力的作用[3～6]。β-胡萝卜素由番茄红素经番茄红素β环化酶（Lycopene β-cyclase，LCY-b）催化生成，而ε环化酶（Lycopene ε-cyclase，LCY-e）可催化番茄红素生成δ-胡萝卜素（δ-Carotenoid），最终生成叶黄素（Lutein）[7，8]。在植物中，这些种类繁多的色素既能使植物花和果实展现鲜艳的颜色，又能被裂解成多种脱辅基类胡萝卜素参与特殊香味的形成，进一步代谢，还能生成植物激素，如脱落酸和独角金内酯等，参与植物生长调控[9～13]。对柑橘和甜橙果实类胡萝卜素积累的研究表明，随果实发育，多个参与类胡萝卜素合成的基因共同作用，致使一种或多种类胡萝卜素大量积累而形成特定的果色[14]。虽然甜瓜果色种类较多，但对其色素积累机理的研究较少，本试验基于甜瓜基因组序列，选取白色果肉甜瓜为对照，对橙色果肉甜瓜β-胡萝卜素积累的分子机制进行了研究。
1材料与方法
1.1材料与试剂
供试材料为本实验室选育的橙色果肉厚皮甜瓜Homoka和白色果肉自交系M01-3。于2013年2月25日播种育苗，4月1日定植于山东农业大学园艺实验站日光温室内，花期人工授粉，严格控制自交，常规栽培管理。
RNA提取试剂盒、反转录试剂盒和荧光定量试剂盒等购自大连宝生物公司；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；叶黄素和β-胡萝卜购自Sigma公司，其他试剂为国产分析纯。
1.2基因搜索及生物信息学分析
从甜瓜基因组网站https：//melonomics.net/genome/[15]查询类胡萝卜素代谢相关基因的序列，利用DNAMAN、Bioedit、MEGA4、Tmpred、SPOMA等分子生物学软件作相关基因的生物信息学分析，用Primer 6.0软件设计各基因扩增引物。
1.3半定量及实时荧光定量PCR
采用Trizol法分别提取两种甜瓜授粉后果实6个发育时期的总RNA，反转录合成cDNA，进行半定量及实时荧光定量PCR扩增。内参基因参照Hao等[16]选择Actin基因（登录号：FJ763186），引物序列见表1。
半定量PCR反应程序为：94℃ 3 min；94℃ 30 s，58℃ 45 s，72℃ 1 min，28个循环后拍照对比。实时荧光定量PCR反应程序为：94℃ 3 min；94℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 10 s，40个循环，参照Livak等[17]方法计算目的基因的相对表达量。
1.4甜瓜果实β-胡萝卜素及叶黄素含量测定
采用高效液相色谱技术测定不同时期果实中叶黄素和β-胡萝卜素含量，参数设置为波长：450 nm；灵敏度：0.8 AUFS；流速：1 mL/min；进样时间：45 min。
2结果与分析
2.1甜瓜果实β-胡萝卜素及叶黄素含量
图1结果显示，两种果色甜瓜果肉中叶黄素和β-胡萝卜素含量差异明显。白色果肉品系M01-3随果实发育，两种色素含量下降，成熟时含量最低。橙色果肉品种Homoka随果实发育，β-胡萝卜素呈现先升高后降低的趋势，授粉45 d含量最高，成熟时有所减少；叶黄素含量基本平稳。
2.2类胡萝卜素代谢相关基因的生物信息学分析
为进一步分析甜瓜果实β-胡萝卜素生物合成的分子机制，在甜瓜基因组测序完成的基础上，对类胡萝卜素代谢相关的6个合成酶基因和3个裂解酶基因进行生物信息学分析（表2）。结果显示，参与分析的9个基因中，ZDS的开放阅读框（OFR）最小，为1 086 bp，CCD7的OFR最大，为1 833 bp。除LCY-b外，其余8个基因均含有内
图1M01-3和Homoka甜瓜果实β-胡萝卜素及叶黄素含量
含子，内含子数目从4～13不等。基因结构比较表明（图2），9个基因中，PDS最长，接近10 kb，内含子数目最多，基因结构较复杂；而LCY-b最短，不含内含子，编码区较短，基因结构较简单。综上所述，这9个基因中，PDS基因序列最长。
利用ExPaSy和Strawberry-ProtComp 9.0等软件对该9个基因推导蛋白做了等电点（pI）、分子量（Mr）及亚细胞定位（Sub-cellular location）分析。结果表明，ZDS的分子量最小，CCD7的分子量最大。亚细胞定位结果显示，只有CCD1定位在细胞质，其他8个蛋白均定位在叶绿体中，并含有长度不等的转运肽（表3），表明该8种蛋白质在叶绿体中参与催化反应。叶绿体是质体的一种，能转化成其他有色体，生产和储存色素。在植物果实及花瓣中，有色体含有丰富的类胡萝卜素，使果实呈现黄色、橙色或橙红色。 采用半定量PCR技术，对以上9个基因中参与合成代谢的6个酶基因做了半定量分析（图3）。结果显示，该6个基因中，PSY2、PDS、ZDS和LCY-b的表达趋势相似，均表现为随果实发育表达上调。而PSY1在果实发育初期表达量高，随果实发育表达下调。推测在甜瓜中，两个拷贝的PSY可能存在组织特异性表达，PSY1在绿色组织中表达，而PSY2在果实及花中表达，随果实发育，表现为相反的变化趋势。在半定量水平上没有检测到LCY-e的表达，可能其在果实中的表达量相对较低，或者不表达。两种果实的差异表现为橙色果实PDS和LCY-b表达量明显高于白色果实。推测，PDS和LCY-b的表达差异可能是导致β-胡萝卜素积累差异的主要原因。
2.4类胡萝卜素裂解相关基因的表达分析
裂解双加氧酶（carotenoid cleavage dioxygenases，CCD）可催化β-胡萝卜素氧化裂解成假紫罗酮、β-紫罗酮等参与风味形成的物质，是类胡萝卜素分解代谢的主要途径。为进一步分析果实类胡萝卜素合成物质流的去向，对3个双加氧裂解酶基因做了定量分析。
结果（图4）显示，随果实发育，白色甜瓜CCD1表达略微上调，而橙色甜瓜呈下调趋势。CCD7与CCD8的表达变化趋势不明显，其中在橙色甜瓜果实发育的第5时期（授粉后45 d），CCD7的丰度相对于第1时期突升20多倍，最后降低；白色甜瓜中检测不到CCD8的表达，而橙色甜瓜
1～6：M01-3授粉5、10、15、20、25、30 d； 7～12：Homoken授粉9、18、27、36、45、54 d
表现先上调后下调的趋势，在第4时期的表达最高。β-胡萝卜素是CCD1的底物，分解后生成芳香物质。CCD7和CCD8是参与ABA合成的关键基因，在果实发育后期表达上调可能与果实成熟及脱落有关。综上所述，推测CCD1表达的差异可能是类胡萝卜素积累差异的另一原因。
3讨论
类胡萝卜素是广泛存在于大自然中的一类色素，在植物中参与光合作用的光能吸收和转化反应，同时能使器官带有鲜艳的颜色。植物通过类胡萝卜素代谢调节其组分及含量来响应环境刺激、满足生长需求[18～21]。类胡萝卜素代谢的调控在植物不同组织中存在差异，在绿色组织中主要生成参与光合作用光能吸收和转化的叶黄素、紫黄质和新黄质等色素[22～24]，而在花和果实中则主要在细胞有色体中积累如番茄红素、β-胡萝卜素等特定的色素，这些色素也是植物激素ABA和独脚金内酯的前体物质。
对甜橙类胡萝卜素生物合成的研究发现，随果实成熟，果实中的类胡萝卜素组分、成分及基因表达均发生变化，且其合成物质流偏向β环化分支。本试验发现在果实中LCY-e表达量低，而LCY-b的表达量较高，这和甜橙中的结果相符。PSY被认为是类胡萝卜素代谢途径中最重要的基因[25]，能在转录水平上响应强光、干旱、盐胁迫和高温等胁迫及反馈调节。拟南芥中只有一个拷贝的PSY，而甜瓜中存在两个拷贝，即PSY1和PSY2[18，26～29]，试验发现PSY1在果实发育初期表达较高，随后下调，而PSY2表达趋势相反，可能是因为PSY的表达存在组织特异性，PSY1在绿色组织中表达，而PSY2在非绿色组织中表达，且表现为相反的变化趋势。对类胡萝卜素分解代谢途径的研究发现，裂解酶基因CCD1在白色甜瓜中，随果实发育表达上调，而在橙色甜瓜中，随果实发育表达下调。
参考文献：
[1]Tadmor Y， Burger Y， Katzir N， et al. Melon plants comprising tetra-cis-lycopene： US， US 2012/0324597 A1[P]. 2012-12-20.
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[9]DellaPenna D， Pogson B J. Vitamin synthesis in plants： tocopherols and carotenoids[J]. Annu. Rev. Plant Biol.， 2006， 57：711-738.
[10]Howitt C A， Pogson B J. Carotenoid accumulation and function in seeds and non-green tissues[J]. Plant Cell Environ.， 2006， 29：435-445.
[11]Gomez-Roldan V， Fermas S， Brewer P B， et al. Strigolactone inhibition of shoot branching[J]. Nature， 2008， 455：189-194.
[12]Umehara M， Hanada A， Yoshida S， et al. Inhibition of shoot branching by new terpenoid plant hormones[J]. Nature， 2008， 455：195-200.
[13]Nambara E， Marion-Poll A. Abscisic acid biosynthesis and catabolism[J]. Annu. Rev. Plant Biol.， 2005， 56：165-185.
[14]Rodrigo M J， Marcos J F， Zacarías L. Biochemical and molecular analysis of carotenoid biosynthesis in flavedo of orange （Citrus sinensis L.） during fruit development and maturation[J]. Agric. Food Chem.， 2004， 52（22）：6724-6731.
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[17]Livak K J， Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using realtime quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method[J]. Methods， 2001， 25：402-408.
[18]Li F，Vallabhaneni R， Yu J， et al. The maize phytoene synthase gene family： overlapping roles for carotenogenesis in endosperm， photomorphogenesis， and thermal stress tolerance[J]. Plant Physiol.， 2008， 147：1334-1346.（下转第30页）山 东 农 业 科 学2014，46（5）：12～17Shandong Agricultural Sciences山 东 农 业 科 学第46卷第5期张士刚：苹果TCP转录因子家族生物信息学分析