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[摘要]目的：观察脂肪组织来源干细胞（ADSCs）对光老化皮肤中黑色素含量的降低作用。方法：将6周龄裸鼠（18～22g）双侧耳背部皮肤每2d紫外线光照一次，每次30min。持续4周后，通过观察皮肤变化和Fontana-Mas soil染色，确立光老化模型。每只裸鼠随机选取一侧耳背部皮下注射ADSCs溶液，对侧给予等量的平衡盐溶液（HBSS）。通过Fontana-Mas son染色观察皮肤中黑色素含量。结果：ADSCs注射组黑色素少于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）。结论：光老化可导致皮肤黑色素含量增加，而脂肪干细胞可以降低光老化皮肤中黑色素的含量。
[关键词]脂肪干细胞；黑色素；光老化；紫外线
[中图分类号]R758.1 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2017）06-0079-03
皮肤老化受多种因素的影响，包括内源性及外源性因素，临床表现为皮肤变薄粗糙、色素沉着、色斑形成、弹性差、顺应性差、皱纹增多及毛细血管扩张等。内源性老化与年龄、遗传因素、免疫功能及内分泌因素有关，受基因的调控，是不可抗拒的力量。外源性因素以紫外线辐射的作用最为明显，也被称之为光老化，其中长波紫外线（UVA）及中波紫外线（UVB）的影响最为突出。异常色素沉着也是皮肤光老化的一种表现形式，主要是由于紫外线辐射导致的表皮黑色素的增加。虽然黑色素能抵御紫外线的辐射，但由此产生的黑色素聚集加深了皮肤的颜色，导致皮肤局部色斑的形成。
脂肪干细胞（ADSCs）是从脂肪组织中分离的一种间充质干细胞，具有多向分化特性。Kim等人通过皮下注射ADSCs证明其通过旁分泌的功能增加胶原蛋白的合成、真皮厚度、胶原密度以及无毛小鼠的成纤维细胞数量，同时促进新生血管的生成。本次实验以裸鼠光老化模型为研究对象，观察紫外线照射后黑色素的增加情况，并通过注射脂肪干细胞，探索ADSCs对光老化皮肤黑色素含量的降低作用。
1材料和方法
1.1材料：6周龄裸鼠（体重18～22g），sD雄性大鼠（体重80～120g）。所有的实验动物，由哈尔滨医科大学附属二院动物实验室提供，经哈尔滨医科大学伦理委员会审批通过。紫外线灯管TL20 W/12RS（Philips，Amsterdam，The Netherlands）。
1.2方法
1.2.1细胞培养：脂肪干细胞取自SD雄性大鼠的附睾脂肪组织。将无菌环境下提取的脂肪组织置于培养皿中，经PBS液洗涤后对脂肪组织进行粗剪，移至无菌试管中用0.5%的Ⅰ型胶原酶在37℃震荡消化处理1h；加入10%胎牛血清（FBS）终止消化，以速度1200r/min，离心10min；丢弃上层淡黄色物质，保留沉淀细胞，再将沉淀细胞用含有10%胎牛血清和双抗（100U/m1）的DMEM重悬后，接种到无菌的培养瓶中；在37℃饱和湿度的无菌培养箱中培养，传至第三代备用。
1.2.2建立裸鼠皮肤光老化模型：照射组裸鼠用紫外线灯管对双侧耳背部进行隔日照射，调整小鼠箱的高度，使照射距离为20～30cm约150mJ/cm2，每次持续30min，共累计照射4周。观察至皮肤出现部分变红、褶皱、色素沉着。非照射组裸鼠除不进行紫外线照射外，其余条件均相同。4周后，各组随机选取4只裸鼠颈脱法处死，进行FontanaMasson染色证实光老化模型建立成功。
1.2.3注射ADSCs溶液：将脂肪干细胞（1×106）悬浮于30ul的平衡盐溶液（HBSS）中，末次照射后从实验组中随机选取20只裸鼠，用微量注射器随机注射至一侧耳背部皮下区域（左耳10只，右耳10只，随机选自不同照射箱），将30μl HBSS注入另一侧作为对照组。28d后，所有小鼠处死，两组耳背皮肤分别从注射点向边缘切割5mm，得到的组织常规纵轴中线切片。将切片进行Fontana Masson染色（黑色素染色法：硝酸氨银经黑色素的作用还原为黑色的金属银）。
1.2.4黑色素含量测定：在同倍视野下（200×），记录黑色素点状聚合团与线状聚合团的数量，点状聚集为多个黑色素不连续聚合成团，且间距小于自身体积；线性聚集为多个黑色素交联聚合成团。所有样本均由有经验的病理学家在双盲条件下进行。组织学评估黑色素细胞分布情况分为4级，①0分：黑色素点状聚合成团分布小于5个；②1分：黑色素点状聚合成团分布大于5个；③2分：黑色素线状聚合成团分布小于5个；④3分：黑色素线状聚合成团分布大于5个。
1.3统计学分析：所得评分结果分别由均数±标准差表示，采用软件SPSS19.0进行独立样本t检验，P<0.05表示有统计学意义。
2结果
2.1光老化模型观察结果：组织切片可见照射组经过紫外线照射后真皮结构不清，胶原纤维含量减少，排列紊乱，不均匀分布，表皮增厚、连续性中断，黑色素明显增加，见图1A；非照射组皮肤结构完整清晰，具有正常厚度，胶原纤维均匀分布，有序排列，见图1B。
2.2ADSCs对光老化皮肤黑色素含量的影响测定结果：3只裸鼠不明原因死亡，在剩余17只裸鼠中左耳ADSCs组、右耳ADSCs组各选8只进行比对。Fontana Masson染色可见ADSCs组在同一视野下黑色素含量小于HBSS组，见图2；黑色素分布评价得分，ADSCs组小于HBSS组，两组差异具有统计学意义（P<0.05），见图3。
3讨论
色素沉着是一种很常见的皮肤疾病，可以出现在所有类型的皮肤中。任何一种炎症或损伤几乎都可以直接引起皮肤的色素沉着。色素异常沉着是皮肤光老化的一种重要表现形式，相比于自然老化的不可调控性，对皮肤光老化的治疗成为减缓皮肤老化进程的关键，目前已进行了多种尝试，主要包括激光、药物、射频和外科手术等方法。相比于手术，多数患者更倾向于选择非手术治疗。面部色素异常沉着、皱纹等均可通过激光治疗得到明显改善，但同时伴随的严重并发症、较长的治疗周期成为激光治疗光老化的致命缺陷。
ADSCs具有自我更新和分化成不同类型细胞的能力，可以从病人自己的身体中分离且不受排斥反应的影响。随着医学技术的日益发展，将会有效地应用于各种疾病的治疗。再生医学的初步临床试验正在进行，其中包括替代糖尿病小鼠的胰岛β细胞、小鼠的脊柱融合及周围神经再生等。Kim等人通过B16黑色素瘤细胞的体外实验证实了ADSCs的美白效果。认为其是应用了脂肪干细胞分泌因子的旁分泌作用，通过TGF-β1作用于黑色素合成通路，抑制酪氨酸酶及其相关蛋白的表达。本实验虽未研究相关机制，但与Kim得到了相似的研究结果。
在本次研究中选取6周龄裸鼠建立皮肤光老化模型，随着紫外线辐射时间的增加，可以观察到小鼠耳背部皮肤逐渐变红，粗糙，弹性降低，褶皱形成，直至皮肤脱屑，色素斑块异常沉积。相比于使用裸鼠建立光老化模型，SD大鼠虽然具有价格便宜、体表面积大、易于操作和易于固定等优点，但建模花费时间较长，一般需要8～12周，并且大鼠的毛發茂盛，需要定期修剪，影响对皮肤变化的观察。
实验所选80～120g的SD大鼠，是当前提取ADSCs较简单的鼠类，既保证了脂肪干细胞较高的成活率，也降低了移植到受体后裸鼠的死亡率。有相关文献报道移入受体的脂肪干细胞完全代谢大约需要28d，因此本次实验选择在注射ADSCs溶液28d后做组织切片，这样保证了干细胞有足够的时间发挥其作用。评分方法是对相关实验评分的改进，相比分光光度计吸光度检测和酪氨酸酶活性检测，此法操作简便，成本更低，效率较高，对皮肤光老化表现提供直观证据，也为ADSCs对黑色素的作用提供了统计学数据。
综上，光老化可导致皮肤黑色素含量增加，而脂肪干细胞可以降低光老化皮肤中黑色素的含量。
[收稿日期]2017-01-21
[修回日期]2017-05-28
编辑/张惠娟
[关键词]脂肪干细胞；黑色素；光老化；紫外线
[中图分类号]R758.1 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2017）06-0079-03
皮肤老化受多种因素的影响，包括内源性及外源性因素，临床表现为皮肤变薄粗糙、色素沉着、色斑形成、弹性差、顺应性差、皱纹增多及毛细血管扩张等。内源性老化与年龄、遗传因素、免疫功能及内分泌因素有关，受基因的调控，是不可抗拒的力量。外源性因素以紫外线辐射的作用最为明显，也被称之为光老化，其中长波紫外线（UVA）及中波紫外线（UVB）的影响最为突出。异常色素沉着也是皮肤光老化的一种表现形式，主要是由于紫外线辐射导致的表皮黑色素的增加。虽然黑色素能抵御紫外线的辐射，但由此产生的黑色素聚集加深了皮肤的颜色，导致皮肤局部色斑的形成。
脂肪干细胞（ADSCs）是从脂肪组织中分离的一种间充质干细胞，具有多向分化特性。Kim等人通过皮下注射ADSCs证明其通过旁分泌的功能增加胶原蛋白的合成、真皮厚度、胶原密度以及无毛小鼠的成纤维细胞数量，同时促进新生血管的生成。本次实验以裸鼠光老化模型为研究对象，观察紫外线照射后黑色素的增加情况，并通过注射脂肪干细胞，探索ADSCs对光老化皮肤黑色素含量的降低作用。
1材料和方法
1.1材料：6周龄裸鼠（体重18～22g），sD雄性大鼠（体重80～120g）。所有的实验动物，由哈尔滨医科大学附属二院动物实验室提供，经哈尔滨医科大学伦理委员会审批通过。紫外线灯管TL20 W/12RS（Philips，Amsterdam，The Netherlands）。
1.2方法
1.2.1细胞培养：脂肪干细胞取自SD雄性大鼠的附睾脂肪组织。将无菌环境下提取的脂肪组织置于培养皿中，经PBS液洗涤后对脂肪组织进行粗剪，移至无菌试管中用0.5%的Ⅰ型胶原酶在37℃震荡消化处理1h；加入10%胎牛血清（FBS）终止消化，以速度1200r/min，离心10min；丢弃上层淡黄色物质，保留沉淀细胞，再将沉淀细胞用含有10%胎牛血清和双抗（100U/m1）的DMEM重悬后，接种到无菌的培养瓶中；在37℃饱和湿度的无菌培养箱中培养，传至第三代备用。
1.2.2建立裸鼠皮肤光老化模型：照射组裸鼠用紫外线灯管对双侧耳背部进行隔日照射，调整小鼠箱的高度，使照射距离为20～30cm约150mJ/cm2，每次持续30min，共累计照射4周。观察至皮肤出现部分变红、褶皱、色素沉着。非照射组裸鼠除不进行紫外线照射外，其余条件均相同。4周后，各组随机选取4只裸鼠颈脱法处死，进行FontanaMasson染色证实光老化模型建立成功。
1.2.3注射ADSCs溶液：将脂肪干细胞（1×106）悬浮于30ul的平衡盐溶液（HBSS）中，末次照射后从实验组中随机选取20只裸鼠，用微量注射器随机注射至一侧耳背部皮下区域（左耳10只，右耳10只，随机选自不同照射箱），将30μl HBSS注入另一侧作为对照组。28d后，所有小鼠处死，两组耳背皮肤分别从注射点向边缘切割5mm，得到的组织常规纵轴中线切片。将切片进行Fontana Masson染色（黑色素染色法：硝酸氨银经黑色素的作用还原为黑色的金属银）。
1.2.4黑色素含量测定：在同倍视野下（200×），记录黑色素点状聚合团与线状聚合团的数量，点状聚集为多个黑色素不连续聚合成团，且间距小于自身体积；线性聚集为多个黑色素交联聚合成团。所有样本均由有经验的病理学家在双盲条件下进行。组织学评估黑色素细胞分布情况分为4级，①0分：黑色素点状聚合成团分布小于5个；②1分：黑色素点状聚合成团分布大于5个；③2分：黑色素线状聚合成团分布小于5个；④3分：黑色素线状聚合成团分布大于5个。
1.3统计学分析：所得评分结果分别由均数±标准差表示，采用软件SPSS19.0进行独立样本t检验，P<0.05表示有统计学意义。
2结果
2.1光老化模型观察结果：组织切片可见照射组经过紫外线照射后真皮结构不清，胶原纤维含量减少，排列紊乱，不均匀分布，表皮增厚、连续性中断，黑色素明显增加，见图1A；非照射组皮肤结构完整清晰，具有正常厚度，胶原纤维均匀分布，有序排列，见图1B。
2.2ADSCs对光老化皮肤黑色素含量的影响测定结果：3只裸鼠不明原因死亡，在剩余17只裸鼠中左耳ADSCs组、右耳ADSCs组各选8只进行比对。Fontana Masson染色可见ADSCs组在同一视野下黑色素含量小于HBSS组，见图2；黑色素分布评价得分，ADSCs组小于HBSS组，两组差异具有统计学意义（P<0.05），见图3。
3讨论
色素沉着是一种很常见的皮肤疾病，可以出现在所有类型的皮肤中。任何一种炎症或损伤几乎都可以直接引起皮肤的色素沉着。色素异常沉着是皮肤光老化的一种重要表现形式，相比于自然老化的不可调控性，对皮肤光老化的治疗成为减缓皮肤老化进程的关键，目前已进行了多种尝试，主要包括激光、药物、射频和外科手术等方法。相比于手术，多数患者更倾向于选择非手术治疗。面部色素异常沉着、皱纹等均可通过激光治疗得到明显改善，但同时伴随的严重并发症、较长的治疗周期成为激光治疗光老化的致命缺陷。
ADSCs具有自我更新和分化成不同类型细胞的能力，可以从病人自己的身体中分离且不受排斥反应的影响。随着医学技术的日益发展，将会有效地应用于各种疾病的治疗。再生医学的初步临床试验正在进行，其中包括替代糖尿病小鼠的胰岛β细胞、小鼠的脊柱融合及周围神经再生等。Kim等人通过B16黑色素瘤细胞的体外实验证实了ADSCs的美白效果。认为其是应用了脂肪干细胞分泌因子的旁分泌作用，通过TGF-β1作用于黑色素合成通路，抑制酪氨酸酶及其相关蛋白的表达。本实验虽未研究相关机制，但与Kim得到了相似的研究结果。
在本次研究中选取6周龄裸鼠建立皮肤光老化模型，随着紫外线辐射时间的增加，可以观察到小鼠耳背部皮肤逐渐变红，粗糙，弹性降低，褶皱形成，直至皮肤脱屑，色素斑块异常沉积。相比于使用裸鼠建立光老化模型，SD大鼠虽然具有价格便宜、体表面积大、易于操作和易于固定等优点，但建模花费时间较长，一般需要8～12周，并且大鼠的毛發茂盛，需要定期修剪，影响对皮肤变化的观察。
实验所选80～120g的SD大鼠，是当前提取ADSCs较简单的鼠类，既保证了脂肪干细胞较高的成活率，也降低了移植到受体后裸鼠的死亡率。有相关文献报道移入受体的脂肪干细胞完全代谢大约需要28d，因此本次实验选择在注射ADSCs溶液28d后做组织切片，这样保证了干细胞有足够的时间发挥其作用。评分方法是对相关实验评分的改进，相比分光光度计吸光度检测和酪氨酸酶活性检测，此法操作简便，成本更低，效率较高，对皮肤光老化表现提供直观证据，也为ADSCs对黑色素的作用提供了统计学数据。
综上，光老化可导致皮肤黑色素含量增加，而脂肪干细胞可以降低光老化皮肤中黑色素的含量。
[收稿日期]2017-01-21
[修回日期]2017-05-28
编辑/张惠娟