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【中图分类号】R733.1【文献标识码】A【文章编号】1632-5281（2015）1
急性白血病（AL）实验室诊断传统方法为FAB分型和细胞化学染色法。 随着细胞遗传学和免疫分型检测方法的逐步完善，对急性白血病的研究已达到分子机制层面。由于受检验者主观影响较大，误诊率高，故传统的FAB分型已逐渐被世界卫生组织WHO分型所取代[1]。急性髓系白血病（AML）占成人急性白血病的80%～90%。慢性淋巴细胞白血病（CLL）是由于细胞凋亡途径受抑而导致的淋巴细胞克隆性增殖性疾病，目前诊断强调单克隆B淋巴细胞增殖，而流式细胞术（FCM）是确定其单克隆依据的关键手段之一。本文探讨AML和B-CLL免疫表型特征，以提高流式免疫分型对白血病的诊断。
1 资料与方法
1.1 研究对象
24例AML、14例B-CLL/SLL为淮南市东方医院集团肿瘤医院2012年1月至2014年12月初诊的，行流式免疫分型检测的患者，临床诊断系结合临床特征、骨髓活检、融合基因、染色体核型、骨髓涂片和细胞化学染色检查等综合判定。其中AML男14例，女10例，年龄7-89岁，平均年龄76岁，M2 10例，AML 4例，M1 1例，M3 1例，M4 5例，M5 1例，M6 1例，M7 1例；B-CLL/SLL男9例，女5例，年龄48-82岁，平均年龄69岁。
1.2 免疫表型分析
取肝素抗凝的骨髓液或外周血1-3ml，采用四色免疫荧光法标记，Cell Quest软件获取3万个以上细胞，以CD45/SSC设门设定待检细胞群，分析该群细胞的抗原表达情况。本研究采用美国Becton Dickinson公司的FACSCalibur型四色流式细胞仪和单克隆抗体，检测结果判断，荧光强度﹥阴性对照，且抗原表达﹥20%为阳性。
2 结果
2.1 AML免疫表型
24例AML患者，抗原表达分别为CD13（100%）、CD33（83%）、CD34（63%）、CD117（75%）、HLA-DR（75%）、CD14（17%）、CD15（58%）、CD11b（45.5%）、CD7（38%），CD2表达率为4.2%，其它淋系抗原CD5、CD19、CD10、CD20未见表达。抗原跨系表达、抗原缺失、早晚期抗原同步表达、抗原高表达等，抗原表达异常病例高达87.5%（21/24）。1例M7病例其表达CD117，其CD41a、CD61均高表达。1例诊断M5，其CD13、CD33、CD117高表达，而其它系列抗原均阴性。1例诊断M3，其CD117不表达。
2.2 B-CLL/SLL免疫表型
14例初诊B-CLL患者均表达CD19，其他B细胞相关抗原CD20、CD23、CD25阳性率依次为100%（14/14）、66.7%（8/12）、及66.7%（8/12），均不表达早期B细胞表而标志CD34和CDl0，CD15表达率为72.7%（8/11），T系相关抗原CD5的阳性率78.6%（11/14）。CD19+CD5-共3例，占B-CLL的21.4%，其CD23表达率为33.3%（1/3），CD19+CD5+双阳性11例，其CD23表达率为90.9%（10/11），差异显著（P=0.000）。
3 讨论
2008年国际CLL工作组联合美国国立癌症研究所CLL工作组发表新的诊断指南[2]，特指CLL为B细胞肿瘤，同时循环B淋巴细胞的克隆性需要FCM证实。CD5+合并成熟B淋巴细胞CD19、CD20、CD22、CD23等细胞表面标志阳性为其克隆性的重要诊断依据。其中尤以检测CD5和CD19双阳性细胞最为重要。本组中CD19全部阳性，CD5的阳性率为78.6%，与国内较大样本免疫表型分析的报道相近[3-4]，CD25阳性率66.7%，高于文献报道[4]，可能与较强的荧光素PE标记CD25抗体有关。CD19+CD5- 病例，CD23表达率明显减低，其临床意义有待进一步研究。
本组AML各抗原表达率与文献[5]报道相近，抗原异常表达病例高达87.5%（21/24）。Legrand[6]总结了177例AML患者的免疫表型特点，M1干/祖细胞标志的阳性率并不比M2型高，部分M1患者CD34、HLA-DR、CD117可以为阴性，由于白血病存在多种异常免疫表型[7]，根据免疫表型诊断白血病时，不能依据某个抗原下结论，应根据抗体表达总体情况，并结合CD45/SCC特点综合分析。
CD7在胎肝时期表达于髓系祖细胞上，在正常骨髓髓系祖细胞上很少表达，CD7阳性多提示是白血病细胞，其预后较差，本组CD7表达占38%。M2中白血病细胞出现弱CD19+（伴CD56+）时，多提示存在t（8；21）， t（8；21）阳性者预后较好[8]，故M2应行染色体或RT-PCR检测。
CD117正常表达于原粒和早幼粒细胞上，急性早幼粒细胞白血病细胞多CD33、CD117高表达，CD34、HLA-DR阴性，CD9高表达是支持M3诊断有意义的证据之一，部分患者表达弱的CD64，除CD2外，很少表达淋系标志。本组2例CD117异常表达，说明免疫表型分析并非特异，尤其是髓系白血病亚型，需结合多种检查，如特异性染色体核型分析和融合基因检查。
国际白血病MIC分型协作组认为免疫分型对每一例急性白血病都是必不可少的；凡是符合下列条件者均应进行免疫分型：（1）形态学细胞化学染色不能肯定细胞来源的白血病；（2）形态学为ALL；（3）AUL、MLL；（4）CLL；（5）NHL和淋巴瘤细胞白血病；（6）大部分髓系白血病；（7）微小残留白血病；（8）不明原因的、持续淋巴细胞增多；（9）疑为MDS；（10）CML急变。
总之，CD5阳性合并成熟B淋巴细胞CD19、CD20、CD22、CD23等细胞表面标志是B细胞CLL克隆性的重要诊断依据。不同类型AML存在非同期抗原共表达、交叉系列抗原表达、抗原过度表达等，应用流式细胞仪进行免疫分型测定，可以辅助各型AML的诊断，并评估AML患者的预后。特别对于FAB分型无法显示的一些生物学特性具有重要价值，可以分析白血病细胞的来源和所处的分化阶段，以便指导临床治疗AML的方案制定和预后判断。 参考文献：
[1] Bacher U， Kern W， Schnittger S， et al. Further correlations of morphology according to FAB and WHO classification to cytogenetics in de novo acute myeloidleukemia： a study on 2，235 patients[J]. Ann Hematol，2005，84（l2）：785-79l.
[2] Hoster E，Dreyling M，Klapper W，et a1.A new prognostic index（MIPI） for patients with advanced-stage mantle cell lymphoma[J].Blood，2008，111：558—565.
[3] 秦继霞，方美云，孙国珍，等. 免疫分型联合核型检查对初诊慢性淋巴细胞白血病的诊断价值[J]. 白血病·淋巴瘤，2012，21（11）： 681-683，696.
[4] 刘越坚，郭莉，邱阳，等. 慢性淋巴细胞白血病免疫表型及凋亡相关蛋白分析[J].国际检验医学杂志，2013，34（1）：25-26.
[5] 刘志祥，姚忠红，李瑞明，等. 129例急性白血病流式细胞术免疫分型的特点分析[J]. 中国实验诊断学，2013，17（1）：127-126.
[6] Legrand O， Perrot JY， Baudard M， et al.The immuunophentype of 177 adults with acute myeloid leukekia： proposal of a prognostic score[J]. Blood， 2000， 96： 876-877.
[7] Liu YR，wang Yz，chen Ss，et a1.Analysis of immunophenotype and leukemia associated immunophenotype in 610 patients with acute myeloid leukemia[J].zhonghua xue Ye xue za zhi，2007，28（11）：73l-736.
作者：朱铭 邢应如 单位：安徽理工大学附属东方肿瘤医院 省市：安徽 淮南
急性白血病（AL）实验室诊断传统方法为FAB分型和细胞化学染色法。 随着细胞遗传学和免疫分型检测方法的逐步完善，对急性白血病的研究已达到分子机制层面。由于受检验者主观影响较大，误诊率高，故传统的FAB分型已逐渐被世界卫生组织WHO分型所取代[1]。急性髓系白血病（AML）占成人急性白血病的80%～90%。慢性淋巴细胞白血病（CLL）是由于细胞凋亡途径受抑而导致的淋巴细胞克隆性增殖性疾病，目前诊断强调单克隆B淋巴细胞增殖，而流式细胞术（FCM）是确定其单克隆依据的关键手段之一。本文探讨AML和B-CLL免疫表型特征，以提高流式免疫分型对白血病的诊断。
1 资料与方法
1.1 研究对象
24例AML、14例B-CLL/SLL为淮南市东方医院集团肿瘤医院2012年1月至2014年12月初诊的，行流式免疫分型检测的患者，临床诊断系结合临床特征、骨髓活检、融合基因、染色体核型、骨髓涂片和细胞化学染色检查等综合判定。其中AML男14例，女10例，年龄7-89岁，平均年龄76岁，M2 10例，AML 4例，M1 1例，M3 1例，M4 5例，M5 1例，M6 1例，M7 1例；B-CLL/SLL男9例，女5例，年龄48-82岁，平均年龄69岁。
1.2 免疫表型分析
取肝素抗凝的骨髓液或外周血1-3ml，采用四色免疫荧光法标记，Cell Quest软件获取3万个以上细胞，以CD45/SSC设门设定待检细胞群，分析该群细胞的抗原表达情况。本研究采用美国Becton Dickinson公司的FACSCalibur型四色流式细胞仪和单克隆抗体，检测结果判断，荧光强度﹥阴性对照，且抗原表达﹥20%为阳性。
2 结果
2.1 AML免疫表型
24例AML患者，抗原表达分别为CD13（100%）、CD33（83%）、CD34（63%）、CD117（75%）、HLA-DR（75%）、CD14（17%）、CD15（58%）、CD11b（45.5%）、CD7（38%），CD2表达率为4.2%，其它淋系抗原CD5、CD19、CD10、CD20未见表达。抗原跨系表达、抗原缺失、早晚期抗原同步表达、抗原高表达等，抗原表达异常病例高达87.5%（21/24）。1例M7病例其表达CD117，其CD41a、CD61均高表达。1例诊断M5，其CD13、CD33、CD117高表达，而其它系列抗原均阴性。1例诊断M3，其CD117不表达。
2.2 B-CLL/SLL免疫表型
14例初诊B-CLL患者均表达CD19，其他B细胞相关抗原CD20、CD23、CD25阳性率依次为100%（14/14）、66.7%（8/12）、及66.7%（8/12），均不表达早期B细胞表而标志CD34和CDl0，CD15表达率为72.7%（8/11），T系相关抗原CD5的阳性率78.6%（11/14）。CD19+CD5-共3例，占B-CLL的21.4%，其CD23表达率为33.3%（1/3），CD19+CD5+双阳性11例，其CD23表达率为90.9%（10/11），差异显著（P=0.000）。
3 讨论
2008年国际CLL工作组联合美国国立癌症研究所CLL工作组发表新的诊断指南[2]，特指CLL为B细胞肿瘤，同时循环B淋巴细胞的克隆性需要FCM证实。CD5+合并成熟B淋巴细胞CD19、CD20、CD22、CD23等细胞表面标志阳性为其克隆性的重要诊断依据。其中尤以检测CD5和CD19双阳性细胞最为重要。本组中CD19全部阳性，CD5的阳性率为78.6%，与国内较大样本免疫表型分析的报道相近[3-4]，CD25阳性率66.7%，高于文献报道[4]，可能与较强的荧光素PE标记CD25抗体有关。CD19+CD5- 病例，CD23表达率明显减低，其临床意义有待进一步研究。
本组AML各抗原表达率与文献[5]报道相近，抗原异常表达病例高达87.5%（21/24）。Legrand[6]总结了177例AML患者的免疫表型特点，M1干/祖细胞标志的阳性率并不比M2型高，部分M1患者CD34、HLA-DR、CD117可以为阴性，由于白血病存在多种异常免疫表型[7]，根据免疫表型诊断白血病时，不能依据某个抗原下结论，应根据抗体表达总体情况，并结合CD45/SCC特点综合分析。
CD7在胎肝时期表达于髓系祖细胞上，在正常骨髓髓系祖细胞上很少表达，CD7阳性多提示是白血病细胞，其预后较差，本组CD7表达占38%。M2中白血病细胞出现弱CD19+（伴CD56+）时，多提示存在t（8；21）， t（8；21）阳性者预后较好[8]，故M2应行染色体或RT-PCR检测。
CD117正常表达于原粒和早幼粒细胞上，急性早幼粒细胞白血病细胞多CD33、CD117高表达，CD34、HLA-DR阴性，CD9高表达是支持M3诊断有意义的证据之一，部分患者表达弱的CD64，除CD2外，很少表达淋系标志。本组2例CD117异常表达，说明免疫表型分析并非特异，尤其是髓系白血病亚型，需结合多种检查，如特异性染色体核型分析和融合基因检查。
国际白血病MIC分型协作组认为免疫分型对每一例急性白血病都是必不可少的；凡是符合下列条件者均应进行免疫分型：（1）形态学细胞化学染色不能肯定细胞来源的白血病；（2）形态学为ALL；（3）AUL、MLL；（4）CLL；（5）NHL和淋巴瘤细胞白血病；（6）大部分髓系白血病；（7）微小残留白血病；（8）不明原因的、持续淋巴细胞增多；（9）疑为MDS；（10）CML急变。
总之，CD5阳性合并成熟B淋巴细胞CD19、CD20、CD22、CD23等细胞表面标志是B细胞CLL克隆性的重要诊断依据。不同类型AML存在非同期抗原共表达、交叉系列抗原表达、抗原过度表达等，应用流式细胞仪进行免疫分型测定，可以辅助各型AML的诊断，并评估AML患者的预后。特别对于FAB分型无法显示的一些生物学特性具有重要价值，可以分析白血病细胞的来源和所处的分化阶段，以便指导临床治疗AML的方案制定和预后判断。 参考文献：
[1] Bacher U， Kern W， Schnittger S， et al. Further correlations of morphology according to FAB and WHO classification to cytogenetics in de novo acute myeloidleukemia： a study on 2，235 patients[J]. Ann Hematol，2005，84（l2）：785-79l.
[2] Hoster E，Dreyling M，Klapper W，et a1.A new prognostic index（MIPI） for patients with advanced-stage mantle cell lymphoma[J].Blood，2008，111：558—565.
[3] 秦继霞，方美云，孙国珍，等. 免疫分型联合核型检查对初诊慢性淋巴细胞白血病的诊断价值[J]. 白血病·淋巴瘤，2012，21（11）： 681-683，696.
[4] 刘越坚，郭莉，邱阳，等. 慢性淋巴细胞白血病免疫表型及凋亡相关蛋白分析[J].国际检验医学杂志，2013，34（1）：25-26.
[5] 刘志祥，姚忠红，李瑞明，等. 129例急性白血病流式细胞术免疫分型的特点分析[J]. 中国实验诊断学，2013，17（1）：127-126.
[6] Legrand O， Perrot JY， Baudard M， et al.The immuunophentype of 177 adults with acute myeloid leukekia： proposal of a prognostic score[J]. Blood， 2000， 96： 876-877.
[7] Liu YR，wang Yz，chen Ss，et a1.Analysis of immunophenotype and leukemia associated immunophenotype in 610 patients with acute myeloid leukemia[J].zhonghua xue Ye xue za zhi，2007，28（11）：73l-736.
作者：朱铭 邢应如 单位：安徽理工大学附属东方肿瘤医院 省市：安徽 淮南