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摘要[目的] 筛选一种高效、简单、快速、价格合理的白蚁基因组DNA提取方法。[方法]比较了CTAB法、离心柱试剂盒和磁珠法试剂盒提取白蚁基因组DNA的效果。[结果]对于新鲜和保存得当的标本，3种方法提取的DNA质量均较好；但对于保存时间较长，出现降解的标本， 磁珠法试剂盒的效果明显优于其他方法。[结论] 获得分子检测所需要的最佳DNA提取方法。
关键词白蚁；DNA；提取
中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2014）23-07714-02
基金项目福建检验检疫局科技计划项目（FK201224）；质检公益性行业科研专项（201410076）。
作者简介张总泽（1984- ），男，内蒙古牙克石人，农艺师，硕士，从事昆虫检疫鉴定工作。
收稿日期20140620获得高质量的DNA模板是昆虫分子鉴定成功的基本前提，直接关系到鉴定工作的成败。口岸检疫工作中，有时截获的昆虫已经死亡，细胞内的DNA发生降解；有时截获的昆虫数量很少，可能只有1头或者部分残体，只能取部分组织用作提取DNA；有些实验室由于没有考虑到要开展分子生物学实验，对标本简单地干燥保存或乙醇浸泡常温保存，使得标本在用传统方法进行DNA提取时，提取结果无法满足试验需要，使后续试验难以进行。
目前常用的昆虫DNA提取方法可以分为3类，即传统的化学试剂法、离心柱试剂盒和磁珠法试剂盒。传统的酚一氯仿法、CTAB法、KAc法、盐析法和SDS法等提取DNA，操作复杂而耗时，DNA回收率低，无法充分去除对PCR试验的抑制因子，且对人体存在潜在的危险性。目前，各实验室常用的离心柱法DNA提取试剂盒，可应用于1～100 mg动物组织DNA的快速提取，全程只需要2 h左右，高效快速，但对于微量组织和长期保存标本的DNA提取效果不尽如人意。基于磁珠法的DNA提取方法是近年兴起的一种新技术，目前已广泛应用于法医学、医学、分子生物学等领域，该方法以纳米磁珠为DNA载体，将分离技术和富集技术有机地结合在一体，通过简单的洗脱即可以得到高纯度DNA，具有很好的应用前景[1-3]。
对于白蚁而言，口岸检验检疫中很难截获大量虫体，在进行分子鉴定时，为了保存标本的完整性，需要保留作为主要鉴定特征的头、胸部，仅利用足来提取DNA。另外，贸易便利化和快速通关对检测周期提出越来越高的要求，需要寻找一种快速、高效、稳定的白蚁DNA提取方法。笔者比较了CTAB法、离心柱试剂盒和磁珠法试剂盒提取白蚁DNA的效果，对所获得的DNA进行了质量和纯度等方面的检测分析，以期获得分子检测所需要的最佳DNA提取方法。
1材料与方法
1.1供试虫源及保存方式所用白蚁及保存方式见。
供试白蚁种类及有关信息
试虫产地时间保存方式台湾乳白蚁福州某木器厂200210无水乙醇浸泡，常温保存黑翅土白蚁福州温泉公园201403无水乙醇浸泡，常温保存
1.2DNA提取方法
1.2.1CTAB法。参照姜丽红等[4]的方法，取单头白蚁，解剖镜下挑取足部，放入1.5 ml离心管中，加入液氮，用融化的枪头做研磨棒，充分研磨。加入800 μl 65 ℃预热的CTAB提取缓冲液（0.1 mol/L CTAB，0.02 mol/L TrisHCl（pH 8.0），0.5% NaCl，0.2% β巯基乙醇），混匀，每5 min轻轻振荡几次，20 min后12 000 r/min离心15 min；小心吸取上清液，加入等体积的酚和氯仿（各400 μl）溶液，混匀，4 ℃、12 000 r/min离心10 min；小心吸取上清液，加入等体积的氯仿，混匀，4 ℃、12 000 r/min离心10 min；重复上一步骤1～2次，以蛋白层不出现为止；取上清，-20 ℃沉淀1 h，4 ℃、12 000 r/min离心10 min；弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀2次；室温下干燥30 min，溶于50 μl去离子水中，于-20 ℃下保存备用。
1.2.2离心柱试剂盒。选用天根血液组织细胞基因组提取试剂盒（DP304），虫体取样、粉碎方法同“1.2.1”，按照试剂盒说明书操作，最后用50 μl洗脱缓冲液洗脱DNA。
1.2.3磁珠法试剂盒。选用天根磁珠法基因组提取试剂盒（DP329），虫体取样、粉碎方法同“1.2.1”，按照试剂盒说明书操作，最后用50 μl洗脱缓冲液洗脱DNA。
1.3DNA纯度及浓度检测将提取后的DNA样品稀释100倍，采用核酸蛋白分析仪（Amersham Biosciences ULTROSPEC1100）测定DNA在波长260与280 nm处的吸收值，根据OD260/OD280值判断DNA的纯度。当OD260/OD280值低于1.6时，样品中有蛋白质或酚的污染；高于1.9则说明样品中有RNA污染。
1.4PCR扩增选用白蚁16SrRNA通用引物LRJ13007（5’TTACGCTGTTATCCCTAA3’）和LRN13398（5’CGCCTGTTTATCAAAAACAT3’）对所提取的模板DNA进行扩增，目的片段约430 bp。PCR反应体系：2.5 μl的10×PCR缓冲液、0.5 μl的dNTP混合物、引物各1 μl、1.25 units TaqDNA聚合酶、DNA模板2.5 μl，最后用ddH2O补充至25 μl。PCR反应条件：预变性94 ℃5 min；35个循環（94 ℃1 min；退火52 ℃30 s；延伸72 ℃1 min）；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存[5]。取10 μl PCR扩增产物，在1.5%琼脂糖凝胶上以100 V电泳分离30 min，染色后在凝胶成像仪上观察结果。
2结果与分析
2.1DNA纯度与浓度利用分光光度计法，测定了3种方法提取到的DNA的纯度与浓度（）。由可知，对于新采集的黑翅土白蚁，3种方法均可以提取到较高质量的DNA，OD260/OD280在1.78～1.85，差别不大；DNA浓度以CTAB法提取的最大，达1 545 μg/ml，离心柱试剂盒提取的最低，为147 μg/ml。对于保存时间较长的台湾乳白蚁，3种方法提取的DNA质量均显著下降，OD260/OD280均低于1.6，说明有蛋白质或酚的污染；DNA浓度仍是CTAB法最高，达67 μg/ml，离心柱试剂盒最低，为26 μg/ml。 不同方法提取白蚁基因组DNA的纯度与浓度
试虫CTAB法OD260/OD280DNA浓度∥μg/ml离心柱试剂盒OD260/OD280DNA浓度∥μg/ml磁珠法试剂盒OD260/OD280DNA浓度∥μg/ml台湾乳白蚁1.54671.38261.5743黑翅土白蚁1.7815451.851471.82352
2.2PCR结果利用通用引物扩增了3种方法提取到DNA的16SrRNA片段，结果见。由可知，对于新采集的黑翅土白蚁，3种方法提取的DNA均可以扩增出1条明亮的长度约430bp的条带；但对于保存时间较长的台湾乳白蚁，CTAB法和离心柱试剂盒提取的DNA几乎均未扩增出条带，而磁珠法提取的DNA扩增出清晰的条带。
注：M.Marker；1～3.CTAB法、离心柱法和磁珠法提取的台湾乳白蚁扩增结果；4～6.CTAB法、离心柱法和磁珠法提取的黑翅土白蚁扩增结果。
不同方法提取白蚁基因组DNA的扩增结果3讨论
经过对3种提取方法的比较，结果表明，从提取质量的角度看，磁珠法最好，特别是对于长期保存、出现降解的样品，磁珠法能减少DNA损失，提取出高质量的DNA，满足鉴定需要，而CTAB法和离心柱法的效果较差；从环保安全的角度看，CTAB法使用酚和氯仿，对人身和环境都有害。虽然离心柱法和磁珠法无法做到“零排放”，但两者在环保方面明显优于CTAB法；从提取成本的角度看，经济成本方面，提取单个样品CTAB法为3元，离心柱法为8.4元，磁珠法为12元；时间成本方面，提取单个样品CTAB法约3.5 h，离心柱法约1.5 h，磁珠法约1 h。
贸易便利化对检疫鉴定工作的“准、快”提出了越来越高的要求，应用分子生物学方法是口岸检疫鉴定白蚁工作的重要补充手段，而获得高质量的DNA模板是基本前提。综合以上因素，建议口岸部门在白蚁检疫鉴定工作中，采用如下策略：如果样品较为新鲜，或数量较多，可以用单头白蚁提取DNA时，推荐使用离心柱型试剂盒；如果样品质量较差，或仅有1头样品，只能将足用作DNA提取时，推荐使用磁珠法试剂盒。
参考文献
[1] 郑斯竹，安榆林，徐梅，等.天牛幼虫保存与DNA提取方法比较研究[J].中南林业科技大学学报，2012，32（5）：144-148.
[2] 游源浅，陈艳，易建平，等.松突圆蚧基因组DNA提取方法的比较[J].华东昆虫学报，2007，16（1）：26-29.
[3] 王平康，骆延，王光志，等.磁珠法快速提取鉴定DNA的实验研究[J].生物學通报，2006，41（6）：50-51.
[4] 姜丽红，邹湘武，宁涤非，等.白蚁mtDNA提取方法改良及检测[J].湖南文理学院学报：自然科学版，2013，25（1）：28-30，34.
[5] 张卫东，徐淼锋，廖力，等.乳白蚁属部分种类16SrRNA的分子系统发育关系[J].昆虫分类学报，2010，32（2）：93-99.安徽农业科学
关键词白蚁；DNA；提取
中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2014）23-07714-02
基金项目福建检验检疫局科技计划项目（FK201224）；质检公益性行业科研专项（201410076）。
作者简介张总泽（1984- ），男，内蒙古牙克石人，农艺师，硕士，从事昆虫检疫鉴定工作。
收稿日期20140620获得高质量的DNA模板是昆虫分子鉴定成功的基本前提，直接关系到鉴定工作的成败。口岸检疫工作中，有时截获的昆虫已经死亡，细胞内的DNA发生降解；有时截获的昆虫数量很少，可能只有1头或者部分残体，只能取部分组织用作提取DNA；有些实验室由于没有考虑到要开展分子生物学实验，对标本简单地干燥保存或乙醇浸泡常温保存，使得标本在用传统方法进行DNA提取时，提取结果无法满足试验需要，使后续试验难以进行。
目前常用的昆虫DNA提取方法可以分为3类，即传统的化学试剂法、离心柱试剂盒和磁珠法试剂盒。传统的酚一氯仿法、CTAB法、KAc法、盐析法和SDS法等提取DNA，操作复杂而耗时，DNA回收率低，无法充分去除对PCR试验的抑制因子，且对人体存在潜在的危险性。目前，各实验室常用的离心柱法DNA提取试剂盒，可应用于1～100 mg动物组织DNA的快速提取，全程只需要2 h左右，高效快速，但对于微量组织和长期保存标本的DNA提取效果不尽如人意。基于磁珠法的DNA提取方法是近年兴起的一种新技术，目前已广泛应用于法医学、医学、分子生物学等领域，该方法以纳米磁珠为DNA载体，将分离技术和富集技术有机地结合在一体，通过简单的洗脱即可以得到高纯度DNA，具有很好的应用前景[1-3]。
对于白蚁而言，口岸检验检疫中很难截获大量虫体，在进行分子鉴定时，为了保存标本的完整性，需要保留作为主要鉴定特征的头、胸部，仅利用足来提取DNA。另外，贸易便利化和快速通关对检测周期提出越来越高的要求，需要寻找一种快速、高效、稳定的白蚁DNA提取方法。笔者比较了CTAB法、离心柱试剂盒和磁珠法试剂盒提取白蚁DNA的效果，对所获得的DNA进行了质量和纯度等方面的检测分析，以期获得分子检测所需要的最佳DNA提取方法。
1材料与方法
1.1供试虫源及保存方式所用白蚁及保存方式见。
供试白蚁种类及有关信息
试虫产地时间保存方式台湾乳白蚁福州某木器厂200210无水乙醇浸泡，常温保存黑翅土白蚁福州温泉公园201403无水乙醇浸泡，常温保存
1.2DNA提取方法
1.2.1CTAB法。参照姜丽红等[4]的方法，取单头白蚁，解剖镜下挑取足部，放入1.5 ml离心管中，加入液氮，用融化的枪头做研磨棒，充分研磨。加入800 μl 65 ℃预热的CTAB提取缓冲液（0.1 mol/L CTAB，0.02 mol/L TrisHCl（pH 8.0），0.5% NaCl，0.2% β巯基乙醇），混匀，每5 min轻轻振荡几次，20 min后12 000 r/min离心15 min；小心吸取上清液，加入等体积的酚和氯仿（各400 μl）溶液，混匀，4 ℃、12 000 r/min离心10 min；小心吸取上清液，加入等体积的氯仿，混匀，4 ℃、12 000 r/min离心10 min；重复上一步骤1～2次，以蛋白层不出现为止；取上清，-20 ℃沉淀1 h，4 ℃、12 000 r/min离心10 min；弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀2次；室温下干燥30 min，溶于50 μl去离子水中，于-20 ℃下保存备用。
1.2.2离心柱试剂盒。选用天根血液组织细胞基因组提取试剂盒（DP304），虫体取样、粉碎方法同“1.2.1”，按照试剂盒说明书操作，最后用50 μl洗脱缓冲液洗脱DNA。
1.2.3磁珠法试剂盒。选用天根磁珠法基因组提取试剂盒（DP329），虫体取样、粉碎方法同“1.2.1”，按照试剂盒说明书操作，最后用50 μl洗脱缓冲液洗脱DNA。
1.3DNA纯度及浓度检测将提取后的DNA样品稀释100倍，采用核酸蛋白分析仪（Amersham Biosciences ULTROSPEC1100）测定DNA在波长260与280 nm处的吸收值，根据OD260/OD280值判断DNA的纯度。当OD260/OD280值低于1.6时，样品中有蛋白质或酚的污染；高于1.9则说明样品中有RNA污染。
1.4PCR扩增选用白蚁16SrRNA通用引物LRJ13007（5’TTACGCTGTTATCCCTAA3’）和LRN13398（5’CGCCTGTTTATCAAAAACAT3’）对所提取的模板DNA进行扩增，目的片段约430 bp。PCR反应体系：2.5 μl的10×PCR缓冲液、0.5 μl的dNTP混合物、引物各1 μl、1.25 units TaqDNA聚合酶、DNA模板2.5 μl，最后用ddH2O补充至25 μl。PCR反应条件：预变性94 ℃5 min；35个循環（94 ℃1 min；退火52 ℃30 s；延伸72 ℃1 min）；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存[5]。取10 μl PCR扩增产物，在1.5%琼脂糖凝胶上以100 V电泳分离30 min，染色后在凝胶成像仪上观察结果。
2结果与分析
2.1DNA纯度与浓度利用分光光度计法，测定了3种方法提取到的DNA的纯度与浓度（）。由可知，对于新采集的黑翅土白蚁，3种方法均可以提取到较高质量的DNA，OD260/OD280在1.78～1.85，差别不大；DNA浓度以CTAB法提取的最大，达1 545 μg/ml，离心柱试剂盒提取的最低，为147 μg/ml。对于保存时间较长的台湾乳白蚁，3种方法提取的DNA质量均显著下降，OD260/OD280均低于1.6，说明有蛋白质或酚的污染；DNA浓度仍是CTAB法最高，达67 μg/ml，离心柱试剂盒最低，为26 μg/ml。 不同方法提取白蚁基因组DNA的纯度与浓度
试虫CTAB法OD260/OD280DNA浓度∥μg/ml离心柱试剂盒OD260/OD280DNA浓度∥μg/ml磁珠法试剂盒OD260/OD280DNA浓度∥μg/ml台湾乳白蚁1.54671.38261.5743黑翅土白蚁1.7815451.851471.82352
2.2PCR结果利用通用引物扩增了3种方法提取到DNA的16SrRNA片段，结果见。由可知，对于新采集的黑翅土白蚁，3种方法提取的DNA均可以扩增出1条明亮的长度约430bp的条带；但对于保存时间较长的台湾乳白蚁，CTAB法和离心柱试剂盒提取的DNA几乎均未扩增出条带，而磁珠法提取的DNA扩增出清晰的条带。
注：M.Marker；1～3.CTAB法、离心柱法和磁珠法提取的台湾乳白蚁扩增结果；4～6.CTAB法、离心柱法和磁珠法提取的黑翅土白蚁扩增结果。
不同方法提取白蚁基因组DNA的扩增结果3讨论
经过对3种提取方法的比较，结果表明，从提取质量的角度看，磁珠法最好，特别是对于长期保存、出现降解的样品，磁珠法能减少DNA损失，提取出高质量的DNA，满足鉴定需要，而CTAB法和离心柱法的效果较差；从环保安全的角度看，CTAB法使用酚和氯仿，对人身和环境都有害。虽然离心柱法和磁珠法无法做到“零排放”，但两者在环保方面明显优于CTAB法；从提取成本的角度看，经济成本方面，提取单个样品CTAB法为3元，离心柱法为8.4元，磁珠法为12元；时间成本方面，提取单个样品CTAB法约3.5 h，离心柱法约1.5 h，磁珠法约1 h。
贸易便利化对检疫鉴定工作的“准、快”提出了越来越高的要求，应用分子生物学方法是口岸检疫鉴定白蚁工作的重要补充手段，而获得高质量的DNA模板是基本前提。综合以上因素，建议口岸部门在白蚁检疫鉴定工作中，采用如下策略：如果样品较为新鲜，或数量较多，可以用单头白蚁提取DNA时，推荐使用离心柱型试剂盒；如果样品质量较差，或仅有1头样品，只能将足用作DNA提取时，推荐使用磁珠法试剂盒。
参考文献
[1] 郑斯竹，安榆林，徐梅，等.天牛幼虫保存与DNA提取方法比较研究[J].中南林业科技大学学报，2012，32（5）：144-148.
[2] 游源浅，陈艳，易建平，等.松突圆蚧基因组DNA提取方法的比较[J].华东昆虫学报，2007，16（1）：26-29.
[3] 王平康，骆延，王光志，等.磁珠法快速提取鉴定DNA的实验研究[J].生物學通报，2006，41（6）：50-51.
[4] 姜丽红，邹湘武，宁涤非，等.白蚁mtDNA提取方法改良及检测[J].湖南文理学院学报：自然科学版，2013，25（1）：28-30，34.
[5] 张卫东，徐淼锋，廖力，等.乳白蚁属部分种类16SrRNA的分子系统发育关系[J].昆虫分类学报，2010，32（2）：93-99.安徽农业科学