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摘要[目的]研究江南星蕨与深绿卷柏多糖和脂溶性物质的提取及其抗菌活性。[方法]采用水提醇沉法和索氏抽提法分别对江南星蕨和深绿卷柏多糖和脂溶性物质进行提取，并用圆形纸片法和MIC测定法对其抗菌活性进行了检测。[结果]江南星蕨与深绿卷柏多糖含量有差别，其多糖提取物表现出不同程度的抗菌活性，其对酵母菌的抗菌活性最强，抑菌圈分别达18和22 mm；而两者所提取的脂溶性物质对5种受试菌均无抗菌效果。[结论]江南星蕨和深绿卷柏多糖可作为功能性多糖加以开发。
关键词江南星蕨；深绿卷柏；多糖；脂溶性物质；提取；抗菌活性
中图分类号S567文献标识码A文章编号0517-6611（2015）21-085-02
江南星蕨（Microsorum fortunei（T.Moore）Ching）系水龍骨科蕨类植物，全草入药，具有清热解毒、祛风除湿、凉血止血、消肿止痛功效，可治疗黄疸、痢疾、尿路感染、白带、风湿关节痛、吐血、便血、跌打损伤、毒蛇咬伤等症[1]。江南星蕨乙醇、丙酮和乙酸乙酯提取物具有很强的抗氧化能力[2]。深绿卷柏（Selaginella doederleinii Hieron.）为蕨类植物门卷柏科植物，其性味甘、微苦、涩，性凉，有清热解毒、祛风除湿、活血化淤之功效，常用于治疗咽喉肿痛、肺热咳嗽、乳腺炎、湿热黄疸、风湿痹痛、外伤出血[3]。深绿卷柏具有抗肿瘤药理活性[4]。但这2种蕨类植物在抗菌方面的研究却未见报道，为此，笔者对江南星蕨和深绿卷柏中多糖和脂类的提取及其抗菌活性进行了研究，以期为进一步开发利用药用蕨类资源提供基础资料。
1材料与方法
1.1材料
试材为江南星蕨与深绿卷柏的全株，采自福建省宁德市蕉城区后山。受试菌包括2种真菌和3种细菌，真菌有产黄青霉Penicillium chrysogenum Thom和啤酒酵母Saccharomyces carlsbergensis Hansen，细菌有革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Cohn、滕黄八叠球菌Sarcina lutea Schroeter和革兰氏阴性菌大肠杆菌Escherichia coli Castellani et Chalmers。菌种来自宁德师范学院生物系微生物实验室。
1.2方法
1.2.1材料的处理。
采集蕨类植物的全株，进行种类鉴定后，将2种蕨类洗净于阴凉处自然晾干，用剪刀将其剪成较小的植物碎片，再用植物粉碎机粉碎成40目，保存备用。
1.2.2多糖的提取和含量测定。
取江南星蕨和深绿卷柏2种蕨类粉末各100 g，加入1 000 ml水，于100 ℃水浴下加热1 h，再经70～80 ℃水浴加热1～2 h过滤，弃去残渣取上清液，在70 ℃水浴下将上清液浓缩至20～30 ml，加3倍体积无水乙醇，离心取沉淀，用3%三氯乙酸溶解沉淀，离心去沉淀，在40～50 ℃水浴条件下将上清液蒸干至恒重，得到多糖并称其质量。多糖含量的测定采用硫酸苯酚法，按照参考文献[5]的方法进行。
1.2.3脂溶性物质的提取和含量测定。
脂溶性物质的提取采用石油醚（分析纯，沸程为60～90 ℃）进行索氏抽提，称取2种蕨类粉末各25 g，按照参考文献[6]的方法进行提取18 h，得到的脂溶性物质通过真空旋转蒸馏仪去除溶剂，称重。
1.2.4抗菌活性的检测与MIC的测定。
将多糖提取物配成质量溶度为0.25 g/ml的水溶液，脂溶性物质则配成0.25 g/ml的石油醚溶液，同时分别以蒸馏水和石油醚为空白对照，用于抑菌试验，抑菌试验采用圆形纸片法，按照参考文献[7]的方法来进行。
MIC的测定也采用圆形纸片法，将多糖溶液稀释成30.0、15.0、7.5、5.0、2.5 mg/ml的梯度浓度用于抑菌，以未见抑菌圈的最高浓度为最小抑菌浓度（MIC）。
2结果与分析
2.1江南星蕨与深绿卷柏提取物的提取率及其含量
江南星蕨与深绿卷柏2种蕨类的多糖提取结果（表1）表明，不同种的蕨类植物，其多糖提取率存在明显差别，江南星蕨与深绿卷柏的多糖提取率分别为13.79%和18.70%，深绿卷柏的多糖提取率略高于江南星蕨；
根据所得标准曲线回归方程Y=0.007 8X+0.247 6（R2=0.991 3），测定得到江南星蕨与深绿卷柏的多糖含量分别为12.729%和10.232%，江南星蕨的多糖含量略高于深绿卷柏。
脂溶性物质的提取中发现江南星蕨的提取率为8.4%，而深绿卷柏的脂类提取率为4.4%，由此可见，江南星蕨的脂溶性物质提取率明显高于深绿卷柏。
比较这2种物质的提取率发现多糖的提取率高于脂类提取率，可见江南星蕨与深绿卷柏这2种蕨类多糖的含量高于脂类，其中深绿卷柏这2种物质的含量差距更大，可见蕨类植物物质的含量与其环境是相关的，光线越少其多糖含量会增加，而脂类物质相对减少。
2.2江南星蕨与深绿卷柏提取物的抗菌活性
从江南星蕨与深绿卷柏2种蕨类植物多糖的抑菌圈大小（表2）可以看出，当多糖的质量溶度为0.25 mg/ml时，江南星蕨与深绿卷柏的抑菌效果较好，抑菌圈的直径均在6～22 mm。深绿卷柏多糖的抗菌活性强于江南星蕨，而江南星蕨则呈现出对5种受试菌均有抗菌活性，说明江南星蕨具有广谱抗菌性。另外，江南星蕨与深绿卷柏2种蕨类对啤酒酵母的抑制效果最好，其抑菌圈分别为18和22 mm，从菌类的敏感性来看，啤酒酵母对江南星蕨与深绿卷柏多糖较为敏感。江南星蕨多糖提取物对革兰氏阴性菌的抗菌活性强于抗革兰氏阳性菌。江南星蕨与深绿卷柏的脂溶性提取物对5种受试菌均没有抑制活性，另外空白对照也没有抑菌活性。 2.3江南星蕨与深绿卷柏多糖的最小抑菌溶度
江南星蕨与深绿卷柏多糖对5种受试菌的MIC（表3）结果表明，深绿卷柏对八叠球菌的最小抑菌大于江南星蕨，江南星蕨对5种受试菌均具有较好的抑制效果，这与前面抑菌圈的测量结果一致，其中江南星蕨对八叠球菌的MIC达5.0 mg/ml。比较2种蕨类的MIC发现，深绿卷柏对大肠杆菌的MIC小于江南星蕨，而对产黄青霉与啤酒酵母的MIC均等于江南星蕨，说明浓度梯度设计的间距太大不易区别开抑菌的效果。
3讨论
对蕨类植物多糖提取的试验表明，不同的蕨类植物多糖提取率以及含量是不一样的。许柑叶等对8种蕨类植物多糖的提取结果表明，蕨的提取率最高，为15.4%，芒萁和华南毛蕨的多糖得率也较高，分别为11.9%和10.0%，而乌蕨的得率最低，仅为2.2%[8]。陈晓清等对9种蕨类植物多糖的提取发现，多糖提取率为3.8%～12.1%，其中以华南毛蕨多糖提取率最高，达12.1%，其次为蜈蚣草，为8.9%，肾蕨最低，仅为3.8%；多糖含量最高的是芒萁，为24.3%，海金沙其次，含量为22.5%，华南毛蕨含量最低，仅为134%[9]。该研究对江南星蕨和深绿卷柏的多糖提取发现，这2种蕨类的多糖提取率均高于上述的9种蕨类，但多糖含量与槲蕨差不多。鲁曼霞等通过水蒸气蒸馏法提取深绿卷柏发现其挥发油得率为0.38%，主要含高级烷烃、烯烃、醇、酮、酚及有机酸[10]。张焱也用水蒸气蒸馏法提取深绿卷柏挥发油，结果表明提取率约为0.23%[11]。该试验采用石油醚索氏抽提深绿卷柏的脂溶性物质，发现提取率为4.4%，远远大于水提法，这是由于脂溶性物质包括了挥发油同时还包含了其他的不挥发脂类。
蕨类植物提取物抗菌活性的研究报道较多，陈晓清等通过对9种蕨类多糖抗动植物病原菌的筛选发现，蕨类多糖提取物对动植物病原菌呈现出不同程度的抗菌活性，其抑菌圈宽度为2.8～14.5 mm[9]。许柑叶等对8种蕨类多糖抗菌的筛选表明同一种蕨类对真菌的抑菌效果优于对细菌的抑菌效果[8]。该试验结果表明江南星蕨与深绿卷柏多糖对5种受试菌表现出不同的抑制活性，其抑菌圈大小为6～22 mm，深绿卷柏多糖对真菌的抗菌活性强于细菌。蔡建秀等对20种蕨类提取物进行抗菌筛选后认为，蕨类醇提液比水提液具更强的抑菌活性，醇提液平均抑菌圈直径为11.92 mm，而水提物则为10.12 mm，抑菌活性范围在8～23 mm[12]。这与江南星蕨与深绿卷柏多糖的抑菌范围基本一致。另外，江南星蕨与深绿卷柏多糖对酵母菌的抑制活性是最强的，而蔡建秀等的研究表明20种蕨类中36%均对酵母菌没有抗菌活性，认为酵母菌的抑菌敏感度最低[12]，说明不同蕨类提取物对同一菌类的抗菌活性是不一样的，与其所含有的次生代谢物直接相关，具体的活性物质还有待于进一步的研究。
参考文献
[1] 浙江药用植物志编写组.浙江药用植物志：上册[M].杭州：浙江科学技术出版社，1980：112-113.
[2] 李培源，霍丽妮，苏炜，等.总抗氧化能力检测试剂盒（ABTS）法测定江南星蕨的抗氧化活性[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（1）：162-164.
[3] 国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草[M].上海：上海科学技术出版社，1999：44.
[4] LEE N Y，MIN H Y，LEE J，et al.Identification of a new cytotoxic biflavanone from Selaginella doederleinii[J].Chemical &Pharmaceutical Bulletin，2008，56（9）：1360-1361.
[5] 张惟杰.复合多糖生化研究技术[M].上海：上海科学技术出版社，1982.
[6] 韦芳三，李纯厚，戴明，等.索氏提取法测定海洋微藻粗脂肪含量及其优化方法的研究[J].上海海洋大学学报，2011，20（4）：619-923.
[7] ZHENG Y，CHEN Y S，LU H S.Screening for antibacterial and antifungal activities in some marine algae from the Fujian coast of Chain with three different solvents[J].China J Oceanol Limnol，2001，19（4）：327-331.
[8] 许柑叶，郑怡，陈晓清，等.8种蕨类植物多糖提取物抑菌效果的研究[J].福建师范大学学报：自然科学版，2005，21（2）：99-102.
[9] 陈晓清，许柑叶.九种蕨类植物多糖提取物抗动植物病原菌活性[J].亚热带植物科学，2007，36（1）：43-45.
[10] 鲁曼霞，黄可龙，施树云，等.3种卷柏属植物挥发性化学成分的气相色谱-质谱联用分析与比较[J].时珍国医国药，2009，20（9）：2119-2121.
[11] 张焱.积雪草苷的生物转化和深绿卷柏化学成分的初步研究[D].天津：天津大学，2007：84.
[12] 蔡建秀，吴文杰，葛清秀.20种药用蕨类植物提取液抑菌試验研究[J].亚热带植物科学，2004，33（1）：22-25.
关键词江南星蕨；深绿卷柏；多糖；脂溶性物质；提取；抗菌活性
中图分类号S567文献标识码A文章编号0517-6611（2015）21-085-02
江南星蕨（Microsorum fortunei（T.Moore）Ching）系水龍骨科蕨类植物，全草入药，具有清热解毒、祛风除湿、凉血止血、消肿止痛功效，可治疗黄疸、痢疾、尿路感染、白带、风湿关节痛、吐血、便血、跌打损伤、毒蛇咬伤等症[1]。江南星蕨乙醇、丙酮和乙酸乙酯提取物具有很强的抗氧化能力[2]。深绿卷柏（Selaginella doederleinii Hieron.）为蕨类植物门卷柏科植物，其性味甘、微苦、涩，性凉，有清热解毒、祛风除湿、活血化淤之功效，常用于治疗咽喉肿痛、肺热咳嗽、乳腺炎、湿热黄疸、风湿痹痛、外伤出血[3]。深绿卷柏具有抗肿瘤药理活性[4]。但这2种蕨类植物在抗菌方面的研究却未见报道，为此，笔者对江南星蕨和深绿卷柏中多糖和脂类的提取及其抗菌活性进行了研究，以期为进一步开发利用药用蕨类资源提供基础资料。
1材料与方法
1.1材料
试材为江南星蕨与深绿卷柏的全株，采自福建省宁德市蕉城区后山。受试菌包括2种真菌和3种细菌，真菌有产黄青霉Penicillium chrysogenum Thom和啤酒酵母Saccharomyces carlsbergensis Hansen，细菌有革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Cohn、滕黄八叠球菌Sarcina lutea Schroeter和革兰氏阴性菌大肠杆菌Escherichia coli Castellani et Chalmers。菌种来自宁德师范学院生物系微生物实验室。
1.2方法
1.2.1材料的处理。
采集蕨类植物的全株，进行种类鉴定后，将2种蕨类洗净于阴凉处自然晾干，用剪刀将其剪成较小的植物碎片，再用植物粉碎机粉碎成40目，保存备用。
1.2.2多糖的提取和含量测定。
取江南星蕨和深绿卷柏2种蕨类粉末各100 g，加入1 000 ml水，于100 ℃水浴下加热1 h，再经70～80 ℃水浴加热1～2 h过滤，弃去残渣取上清液，在70 ℃水浴下将上清液浓缩至20～30 ml，加3倍体积无水乙醇，离心取沉淀，用3%三氯乙酸溶解沉淀，离心去沉淀，在40～50 ℃水浴条件下将上清液蒸干至恒重，得到多糖并称其质量。多糖含量的测定采用硫酸苯酚法，按照参考文献[5]的方法进行。
1.2.3脂溶性物质的提取和含量测定。
脂溶性物质的提取采用石油醚（分析纯，沸程为60～90 ℃）进行索氏抽提，称取2种蕨类粉末各25 g，按照参考文献[6]的方法进行提取18 h，得到的脂溶性物质通过真空旋转蒸馏仪去除溶剂，称重。
1.2.4抗菌活性的检测与MIC的测定。
将多糖提取物配成质量溶度为0.25 g/ml的水溶液，脂溶性物质则配成0.25 g/ml的石油醚溶液，同时分别以蒸馏水和石油醚为空白对照，用于抑菌试验，抑菌试验采用圆形纸片法，按照参考文献[7]的方法来进行。
MIC的测定也采用圆形纸片法，将多糖溶液稀释成30.0、15.0、7.5、5.0、2.5 mg/ml的梯度浓度用于抑菌，以未见抑菌圈的最高浓度为最小抑菌浓度（MIC）。
2结果与分析
2.1江南星蕨与深绿卷柏提取物的提取率及其含量
江南星蕨与深绿卷柏2种蕨类的多糖提取结果（表1）表明，不同种的蕨类植物，其多糖提取率存在明显差别，江南星蕨与深绿卷柏的多糖提取率分别为13.79%和18.70%，深绿卷柏的多糖提取率略高于江南星蕨；
根据所得标准曲线回归方程Y=0.007 8X+0.247 6（R2=0.991 3），测定得到江南星蕨与深绿卷柏的多糖含量分别为12.729%和10.232%，江南星蕨的多糖含量略高于深绿卷柏。
脂溶性物质的提取中发现江南星蕨的提取率为8.4%，而深绿卷柏的脂类提取率为4.4%，由此可见，江南星蕨的脂溶性物质提取率明显高于深绿卷柏。
比较这2种物质的提取率发现多糖的提取率高于脂类提取率，可见江南星蕨与深绿卷柏这2种蕨类多糖的含量高于脂类，其中深绿卷柏这2种物质的含量差距更大，可见蕨类植物物质的含量与其环境是相关的，光线越少其多糖含量会增加，而脂类物质相对减少。
2.2江南星蕨与深绿卷柏提取物的抗菌活性
从江南星蕨与深绿卷柏2种蕨类植物多糖的抑菌圈大小（表2）可以看出，当多糖的质量溶度为0.25 mg/ml时，江南星蕨与深绿卷柏的抑菌效果较好，抑菌圈的直径均在6～22 mm。深绿卷柏多糖的抗菌活性强于江南星蕨，而江南星蕨则呈现出对5种受试菌均有抗菌活性，说明江南星蕨具有广谱抗菌性。另外，江南星蕨与深绿卷柏2种蕨类对啤酒酵母的抑制效果最好，其抑菌圈分别为18和22 mm，从菌类的敏感性来看，啤酒酵母对江南星蕨与深绿卷柏多糖较为敏感。江南星蕨多糖提取物对革兰氏阴性菌的抗菌活性强于抗革兰氏阳性菌。江南星蕨与深绿卷柏的脂溶性提取物对5种受试菌均没有抑制活性，另外空白对照也没有抑菌活性。 2.3江南星蕨与深绿卷柏多糖的最小抑菌溶度
江南星蕨与深绿卷柏多糖对5种受试菌的MIC（表3）结果表明，深绿卷柏对八叠球菌的最小抑菌大于江南星蕨，江南星蕨对5种受试菌均具有较好的抑制效果，这与前面抑菌圈的测量结果一致，其中江南星蕨对八叠球菌的MIC达5.0 mg/ml。比较2种蕨类的MIC发现，深绿卷柏对大肠杆菌的MIC小于江南星蕨，而对产黄青霉与啤酒酵母的MIC均等于江南星蕨，说明浓度梯度设计的间距太大不易区别开抑菌的效果。
3讨论
对蕨类植物多糖提取的试验表明，不同的蕨类植物多糖提取率以及含量是不一样的。许柑叶等对8种蕨类植物多糖的提取结果表明，蕨的提取率最高，为15.4%，芒萁和华南毛蕨的多糖得率也较高，分别为11.9%和10.0%，而乌蕨的得率最低，仅为2.2%[8]。陈晓清等对9种蕨类植物多糖的提取发现，多糖提取率为3.8%～12.1%，其中以华南毛蕨多糖提取率最高，达12.1%，其次为蜈蚣草，为8.9%，肾蕨最低，仅为3.8%；多糖含量最高的是芒萁，为24.3%，海金沙其次，含量为22.5%，华南毛蕨含量最低，仅为134%[9]。该研究对江南星蕨和深绿卷柏的多糖提取发现，这2种蕨类的多糖提取率均高于上述的9种蕨类，但多糖含量与槲蕨差不多。鲁曼霞等通过水蒸气蒸馏法提取深绿卷柏发现其挥发油得率为0.38%，主要含高级烷烃、烯烃、醇、酮、酚及有机酸[10]。张焱也用水蒸气蒸馏法提取深绿卷柏挥发油，结果表明提取率约为0.23%[11]。该试验采用石油醚索氏抽提深绿卷柏的脂溶性物质，发现提取率为4.4%，远远大于水提法，这是由于脂溶性物质包括了挥发油同时还包含了其他的不挥发脂类。
蕨类植物提取物抗菌活性的研究报道较多，陈晓清等通过对9种蕨类多糖抗动植物病原菌的筛选发现，蕨类多糖提取物对动植物病原菌呈现出不同程度的抗菌活性，其抑菌圈宽度为2.8～14.5 mm[9]。许柑叶等对8种蕨类多糖抗菌的筛选表明同一种蕨类对真菌的抑菌效果优于对细菌的抑菌效果[8]。该试验结果表明江南星蕨与深绿卷柏多糖对5种受试菌表现出不同的抑制活性，其抑菌圈大小为6～22 mm，深绿卷柏多糖对真菌的抗菌活性强于细菌。蔡建秀等对20种蕨类提取物进行抗菌筛选后认为，蕨类醇提液比水提液具更强的抑菌活性，醇提液平均抑菌圈直径为11.92 mm，而水提物则为10.12 mm，抑菌活性范围在8～23 mm[12]。这与江南星蕨与深绿卷柏多糖的抑菌范围基本一致。另外，江南星蕨与深绿卷柏多糖对酵母菌的抑制活性是最强的，而蔡建秀等的研究表明20种蕨类中36%均对酵母菌没有抗菌活性，认为酵母菌的抑菌敏感度最低[12]，说明不同蕨类提取物对同一菌类的抗菌活性是不一样的，与其所含有的次生代谢物直接相关，具体的活性物质还有待于进一步的研究。
参考文献
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[2] 李培源，霍丽妮，苏炜，等.总抗氧化能力检测试剂盒（ABTS）法测定江南星蕨的抗氧化活性[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（1）：162-164.
[3] 国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草[M].上海：上海科学技术出版社，1999：44.
[4] LEE N Y，MIN H Y，LEE J，et al.Identification of a new cytotoxic biflavanone from Selaginella doederleinii[J].Chemical &Pharmaceutical Bulletin，2008，56（9）：1360-1361.
[5] 张惟杰.复合多糖生化研究技术[M].上海：上海科学技术出版社，1982.
[6] 韦芳三，李纯厚，戴明，等.索氏提取法测定海洋微藻粗脂肪含量及其优化方法的研究[J].上海海洋大学学报，2011，20（4）：619-923.
[7] ZHENG Y，CHEN Y S，LU H S.Screening for antibacterial and antifungal activities in some marine algae from the Fujian coast of Chain with three different solvents[J].China J Oceanol Limnol，2001，19（4）：327-331.
[8] 许柑叶，郑怡，陈晓清，等.8种蕨类植物多糖提取物抑菌效果的研究[J].福建师范大学学报：自然科学版，2005，21（2）：99-102.
[9] 陈晓清，许柑叶.九种蕨类植物多糖提取物抗动植物病原菌活性[J].亚热带植物科学，2007，36（1）：43-45.
[10] 鲁曼霞，黄可龙，施树云，等.3种卷柏属植物挥发性化学成分的气相色谱-质谱联用分析与比较[J].时珍国医国药，2009，20（9）：2119-2121.
[11] 张焱.积雪草苷的生物转化和深绿卷柏化学成分的初步研究[D].天津：天津大学，2007：84.
[12] 蔡建秀，吴文杰，葛清秀.20种药用蕨类植物提取液抑菌試验研究[J].亚热带植物科学，2004，33（1）：22-25.