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摘 要 WUSCHEL（WUS）基因是植物干细胞的标志基因。采用同源克隆法结合RACE技术从马银花愈伤组织中克隆得到RoWUS cDNA全长序列，采用染色体步移法克隆得到该基因的启动子序列，登录号分别为KF365488、KF861578。马银花RoWUS cDNA全长1 123 bp，编码302个氨基酸；DNA序列2 001 bp，包含2个内含子和3个外显子；启动子序列3 122 bp。生物信息学分析表明：RoWUS亚细胞定位于细胞核，是不稳定的亲水蛋白，无信号肽，具有跨膜结构，包含homeodomain功能位点。系统进化树分析结果表明：RoWUS单独形成一个分支，与葡萄、大豆和苜蓿的亲缘关系最近。对RoWUS的启动子进行分析表明，该启动子除了含有丰富的TATA-box和CAAT-box等基本元件以外，还含有多个光响应元件、逆境胁迫响应元件、激素应答元件和其他功能元件。qPCR结果表明：RoWUS基因在马银花愈伤组织不同生长时期中呈先上升后下降的趋势，在第5个继代周期时表达量最高。外源赤霉素和脱落酸浓度为15 mg/L时表达量最高，说明RoWUS基因在该浓度时对赤霉素和脱落酸的响应最强。
关键词 马银花；愈伤组织；WUS；启动子；基因克隆；生物信息学分析；荧光定量PCR
中图分类号 S685.21 文献标识码 A
Abstract The WUSCHEL（WUS）gene was a plant stem cell marker gene. The RoWUS gene was cloned from the callus of Rhododendron ovatum Planch by the homologous cloning and RACE technology（GenBank：KF365488）. The complete cDNA sequence was 1 123 bp，encoding 302 amino acids. The DNA sequence of RoWUS was 2 001 bp which included 3 exons and 2 introns. The RoWUS promoter fragment was cloned from the callus of R. ovatum Planch by the genome walking（GenBank：KF861578），and the sequence was 3 122 bp. Bioinformatics analysis showed that the protein was likely a kind of hydrophilcity and unstable protein which located in the nucleus. The protein had transmembrane structure without signal peptide，which obtained a homeodomain functional site. The phylogenetic tree analysis showed that RoWUS has the closest relationship with Vitis vinifera，Glycine max and Medicago truncatula. The promoter software analysis showed that the promoter fragment contained a number of TATA-box，CAAT-box elements and many other promoter elements，such as light response elements，environmental stress response elements，hormone response elements and some function unknown elements. The qPCR results indicated that RoWUS showed a downward trend after the first rising at different culture stages in R. ovatum Planch callus. It expressed at the highest levels in the 5th cycle. The RoWUS gene had strong response under the hormone treatments of GA3 and ABA，and the peak of expression level appeared at 15 mg/L GA3 and ABA.
Key words Rhododendron ovatum； Callus； WUSCHEL； Promoter； Cloning； Bioinformatics； qPCR
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.10.017
植物干细胞是植物器官发育的源泉，其产生的子细胞具有持续分裂能力并能进行自我更新，是顶端生长过程中必不可少的[1-4]。WUSCHEL（WUS）基因能使它周围的细胞具有干细胞的特征，是植物干细胞的决定基因，该基因的表达与干细胞的形成和器官的发生有密切关系[5]。WUS基因在茎端分生组织中心表达能诱导分生组织细胞增殖，该基因编码一个同源异型结构域（homeodomain）蛋白，此蛋白在多种生物中都存在，参与发育过程并且决定细胞的类型[5]。WUS基因通过与转录阻遏物结合来抑制分化，使茎端分生组织中的干细胞保持未分化状态，既能保持干细胞的多能性特征，又能维持分生组织的形态以及功能的完整，在植物器官和组织的生长过程中对干细胞的维持和分化的调控起到极为重要的作用[6-15]。最近的研究结果表明，WUS基因在番茄花的形态发育、器官鉴别、花离层区和器官脱落过程以及控制番茄小室的数量中起到重要调控作用[16-17]。WUS突变体形成的茎端分生组织不具有正常功能，可能导致叶序混乱、茎和花的分生组织提前终止等现象发生，多数情况下花的大部分器官缺失只形成一个雄蕊，不产生心皮[18-19]。 马银花（Rhododendron ovatum Planch）是杜鹃花科（Ericaceae）杜鹃花属（Rhododendron）常绿灌木或小乔木，为杜鹃花属中的中国特有种，世界著名的观赏花卉。马银花主产江苏、浙江、广东、广西等省（区）海拔1 000 m以下的灌丛中，除了具有很高的园林价值之外，还具有一定的药用价值，具有消热利湿的功效。目前已从拟南芥、番茄、萝卜等物种中克隆得到了WUS基因[20-25]，但已分离出的木本植物WUS基因还相当少。迄今为止，杜鹃花中还没有进行该基因的相关研究，也还未见愈伤组织中克隆得到该基因的相关报道。为了深入研究RoWUS基因在马银花愈伤组织形成过程中对干细胞的维持和分化的调控作用，本研究以马银花试管苗为材料诱导愈伤组织，从愈伤组织中分离和克隆RoWUS基因及启动子，对其进行生物信息学分析，并通过qPCR法研究其在马银花愈伤组织生长过程中的表达规律及外源激素处理对该基因的表达情况，为进一步探讨马银花RoWUS在愈伤组织形成过程中的调控机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
以福建农林大学园艺植物生物工程研究所提供的马银花（Rhododendron ovatum Planch.）无菌试管苗为材料诱导愈伤组织，取继代20 d左右的松散愈伤组织用于总RNA的提取及后续试验。
1.2 方法
1.2.1 马银花愈伤组织DNA及总RNA的提取 愈伤组织DNA的提取采用改良CTAB法，总RNA使用柱式植物RNAOUT2.0（TIANDZ）试剂盒（北京天恩泽公司）提取，然后运用超微量核酸检测仪（ND lite）检测样品浓度和纯度，以1.0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA和RNA完整性。
1.2.2 马银花愈伤组织cDNA合成 采用RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas）试剂盒的方法进行逆转录合成第一链cDNA，用于保守区及3′-RACE的扩增；5′-RACE cDNA 第一链的合成参照Clontech公司SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒的说明书。
1.2.3 引物设计与PCR扩增 RoWUS保守区引物设计及PCR扩增：在NCBI数据库中获得拟南芥、大豆、甜橙、葡萄等的基因序列，利用DNA MAN6.0软件对其进行同源比对分析，在保守区域设计上下游引物RoWUS-F、RoWUS-R，以反转录第一链cDNA为模板进行PCR扩增反应。
RoWUS 3′-RACE和5′-RACE引物设计及PCR扩增：根据已得到的RoWUS基因保守区核苷酸序列设计2条3′-RACE正向特异引物RoWUS 3′GSP1、RoWUS 3′GSP2，结合GeneRacerTM 3′Primer和GeneRacerTM 3′Nested Primer引物，以反转录第一链cDNA为模板进行二轮PCR反应扩增3′末端序列；再分别设计2条5′-RACE反向特异引物RoWUS 5′GSP1、RoWUS 5′GSP2，结合UPM引物，以反转录得到的5′端cDNA为模板进行二轮PCR反应扩增5'末端序列。
RoWUS ORF验证及gDNA引物设计及PCR扩增：在拼接得到的马银花RoWUS全长序列的3′和5′端分别设计上下游特异引物ORF-F、ORF-R，以反转录第一链cDNA为模板对ORF进行验证。同时利用该ORF验证引物，以马银花愈伤组织DNA为模板进行PCR扩增得到该基因的DNA序列。
RoWUS启动子引物设计及PCR扩增：在已克隆得到的RoWUS DNA序列的5′端设计3条同向特异引物SP1、SP2、SP3。参照Genome Walking Kit（TaKaRa）的方法，首先以DNA为模板，用SP1与AP1进行第一轮热不对称PCR反应；然后以第一轮PCR产物为模板，用SP2与AP1进行第二轮热不对称PCR反应；再以第二轮PCR产物为模板，用SP3与AP1进行第三轮热不对称PCR反应。
所有引物均由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。引物序列、退火温度、扩增目的片段大小及扩增用途见表1。
PCR扩增体系：RoWUS基因克隆PCR体系为cDNA模板1 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，2×Prime STARR GC Buffer（Mg2+ plus）12.5 μL，dNTPs Mixture（2.5 mmol/L）2 μL，PrimeSTARR HS DNA polymerase（2.5 U/μL）0.25 μL，ddH2O 7.25 μL，总计25 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性45 s，退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min。根据扩增的目的片段大小不同PCR程序进行适当调整。启动子克隆PCR体系参考Genome Walking Kit（Takara）说明书。
1.2.4 目的片段的回收、克隆和测序 PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后割胶回收目的产物，回收方法参照EzgeneTM Gel/PCR Extraction Kit（BIOMIGA）说明书。取4 μL目的产物与1 μL pEASYTM-Blunt Zero进行连接，然后转化至50 μL Trans-T1感受态细胞，挑取单克隆于菌液中过夜培养，菌液经PCR鉴定后送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。
1.2.5 马银花愈伤组织RoWUS基因的生物信息学分析及启动子序列分析 在NCBI数据库中对测序结果进行BLAST比对分析。使用DNA MAN6.0拼接序列并对其氨基酸序列进行推导。采用ExPASy Protparam预测编码蛋白的理化性质；以PredictProtein进行亚细胞定位；蛋白质信号肽预测采用SignaIP 4.1 Server；采用TMpred预测蛋白质跨膜结构；NetPhos 2.0 Serve预测蛋白质磷酸化位点；ScanProsite预测蛋白质的功能位点；经InterProScan预测蛋白质的保守结构域；以PHD在线软件预测蛋白质二级结构；利用SWISSMODEL对三维结构进行预测；采用MEGA5.0软件构建系统进化树。利用Neural Network Promoter Prediction（http：//www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html）软件对RoWUS基因可能的核心启动子位置及可能存在的转录起始位点进行分析；使用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）结合PLACE（http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalup.html）软件对该启动子序列潜在的顺式作用元件进行分析。 1.2.6 马银花愈伤组织不同生长时期RoWUS的定量表达分析 以EF-1a为内参基因，检测RoWUS在马银花愈伤组织不同生长时期的表达情况。本试验采用TaKaRa SYBR ExScriptTM 试剂和罗氏LightCycler480仪器，使用柱式植物RNAOUT2.0（TIANDZ）试剂盒（北京天恩泽公司）提取马银花愈伤组织不同继代周期（第1、3、5、7、9、40、45代）的总RNA，并用SYBR ExScriptTM RT-PCR试剂盒（TAKARA公司）合成cDNA，根据荧光引物设计原则设计上下游引物进行PCR扩增。qPCR反应体系和扩增程序参照Lin等的方法[26]。反应结束后进行扩增曲线和溶解曲线等分析，检测引物的特异性，各不同生长时期的cDNA模板混合样以不同梯度稀释（5×、25×、125×、625×），进行标准曲线制作，获得扩增效率等相关参数。然后将不同生长时期的马银花愈伤组织cDNA分别稀释成10倍样进行荧光定量PCR，每个样本重复3次。qPCR引物见表1。
1.2.7 外源GA3和ABA处理下RoWUS的定量表达分析 以EF-1a为内参基因，检测马银花愈伤组织RoWUS在不同浓度GA3（0、5、10、15、20 mg/L）和ABA（0、5、10、15、20 mg/L）处理24 h后的表达情况。试验方法同1.2.6。
2 结果与分析
2.1 马银花愈伤组织RoWUS cDNA、gDNA及启动子序列的获得
经巢式PCR扩增得到与预期一致的保守片段，测序表明该序列长度为199 bp，NCBI数据库比对结果表明，该片段与蓖麻、葡萄、杨树、矮牵牛等的WUS基因序列具有较高的同源性，初步推断克隆得到马银花愈伤组织RoWUS的部分序列。经二轮PCR扩增后分别得到204 bp 5′-RACE序列和825 bp 3′-RACE序列，其中5′-UTR长度为101 bp，3′-UTR长度为94 bp，终止密码子为TAA， Poly（A）尾长18 bp。
序列拼接得到RoWUS全长序列为1 123 bp，对拼接结果进行PCR验证得到约900 bp目的片段，测序表明验证产物长度为922 bp，包括完整的开放阅读框，与拼接结果相符（图1、2）。将RoWUS的核苷酸序列在NCBI中进行BLAST比对，结果表明该序列与葡萄、毛果杨、番茄、向日葵的同源性分别达到87%、86%、85%、84%，说明所得片段为WUS基因，将其命名为RoWUS，GenBank登录号：KF365488。
对马银花基因组DNA进行PCR扩增得到一条大约2 000 bp的片段（图1），测序表明该片段大小为2 001 bp。DNAMAN 分析表明，该序列包含2个内含子和3个外显子，3个外显子序列与cDNA序列一致，在DNA序列上的位点分别是1～370；831～946；1 579～2 001。所有内含子的剪切位点均符合真核生物“GT-AG”规则。
经三轮巢式PCR扩增得到约3 500 bp的启动子序列（图1），测序结果显示该片段长度为3 427 bp。根据DNA序列拼接结果和NCBI比对结果，表明所得序列为该基因的启动子序列，RoWUS 5′端调控序列长度为3 122 bp，该序列在GenBank上的序列号为KF861578。
2.2 生物信息学分析
ProtParam预测可知马银花RoWUS的分子式为C1 444H2 186N416O477S13，由4 536个原子构成，包括302个氨基酸，相对分子量为33.4 ku，理论等电点（pI）5.81，带正电的氨基酸（Arg+Lys）有25个，带负电的氨基酸（Asp+Glu）有30个，总平均疏水性为-0.830，属于亲水蛋白，此蛋白不稳定系数达到58.52，是一个不稳定蛋白。
SignaIP 4.1 Server预测可知马银花RoWUS蛋白无信号肽。经TMpred软件预测RoWUS在164～183处形成一个由内向外的跨膜螺旋。PredictProtein亚细胞定位表明，RoWUS定位于细胞核的可能性最高。根据NCBI-CDS对马银花愈伤组织RoWUS结构域分析的结果，该蛋白属于同源异型结构域（homeodomain）蛋白超级家族，包含homeodomain功能位点（图2）。Coils软件预测结果显示RoWUS可能形成卷曲螺旋。NetPhos 2.0 Serve软件预测结果表明RoWUS含有23个蛋白磷酸化位点，其中丝氨酸（Ser）13个，苏氨酸（Thr）3个，酪氨酸（Tyr）7个。PHD软件预测表明RoWUS二级结构以无规则卷曲结构为主，所占的比例为74.83%，其次为α螺旋结构占15.23%，延伸链所占的比例较少，为9.93%。SWISSMODEL三维结构预测显示，RoWUS的主要结构元件是无规则卷曲、α螺旋和延伸链（图3）。
将马银花RoWUS的氨基酸序列在NCBI中进行在线Blast，结果显示马银花RoWUS氨基酸序列与无油樟（Amborella trichopoda）、毛果杨（Populus trichocarpa）、水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）的同源性分别达到了93%、86%、79%、75%，比对结果表明马银花RoWUS与其他物种该基因同源性较高。为了研究RoWUS的进化关系，本研究选取大豆、葡萄、番茄、毛白杨、银杏等18种植物的WUS氨基酸序列，运用MEGA5.0软件的邻位相连法（NJ）构建WUS的系统进化树（图4）。进化结果表明，WUSCHEL根据种属关系被分为两大类，其中被子植物聚为一类、裸子植物聚为另一类。在被子植物中水稻和玉米等单子叶植物聚为一类，其他双子叶植物聚为另一类。马银花单独形成一个分支，与葡萄、大豆和苜蓿的亲缘关系较近，与樟子松、银杏等裸子植物亲缘关系较远。 2.3 马银花RoWUS启动子序列及其结构分析
马银花RoWUS启动子具有3 122 bp的核苷酸序列，Neural Network Promoter Prediction预测到该启动子具有多个核心启动子区域，其中最可能的核心启动子区域为GTCGTTCATATATATATTTATGC
CCGATCAATCTGATTTTTCTCTGCGAT，可能的转录起始位点位于翻译起始位点ATG上游的-1 381 bp处的T（将起始密码子ATG中的A定义为位+1）。
PlantCARE顺式元件分析表明，该序列存在大量的调控元件，其中核心元件TATA-Box有57个、CAAT-Box有27个。 此外，还存在多个光响应元件AE-box、G-Box、I-box、L-box、AT1-motif、ATCT-motif、GAG-motif、GATA-motif、TCCC-motif、TCT-motif和Sp1；激素应答元件P-box、TATC-box、TCA-element、TGA-element和ABRE；逆境胁迫响应元件ARE、TC-rich repeat、MBS及circadian，另外还存在一些其他功能的元件。
2.4 马银花愈伤组织不同生长时期RoWUS的定量表达分析
qPCR结果经扩增曲线和溶解曲线分析结果表明，EF-1a引物和qPCR引物特异性好，标准曲线符合试验要求。马银花愈伤组织不同生长时期RoWUS的相对表达情况见图5。由图5可以看出，RoWUS在马银花愈伤组织各个继代周期都有表达，且呈现先升高后下降的变化趋势，最后趋于稳定状态。RoWUS在第1代之后表达量缓慢上升，第3代之后急剧上升，在第5代时表达量达到峰值，此时细胞处于分裂旺盛期。第5代之后表达量迅速下降，从第7代之后表达量没有明显变化。
2.5 外源GA3和ABA处理下RoWUS的定量表达分析
马银花愈伤组织RoWUS在不同浓度赤霉素和脱落酸处理下的定量表达情况见图6。试验结果表明，赤霉素浓度较低时RoWUS的响应比较弱，随着赤霉素浓度的升高RoWUS对赤霉素响应逐渐增强，在浓度为15 mg/L时表达量达到峰值，浓度进一步增加时又降低。这可能是试验所用的培养基中含有活性较高的细胞分裂素和一定浓度的生长素导致的。用低浓度脱落酸处理时RoWUS相对表达量较稳定，但是当ABA浓度从10 mg/L增加到15 mg/L时RoWUS的相对表达量迅速上升，在15 mg/L时达到峰值。说明RoWUS在脱落酸浓度为15 mg/L时响应最强，可以促进愈伤组织细胞快速分裂。
3 讨论与结论
3.1 马银花愈伤组织RoWUS的功能推测
对马银花RoWUS的氨基酸序列进行生物信息学分析发现马银花RoWUS蛋白具有跨膜螺旋，不含信号肽，属于可溶性的亲水蛋白。亚细胞定位表明，RoWUS蛋白主要在细胞核内发挥作用，这与谭文勃等[5]的研究结论一致。马银花RoWUS结构域分析发现该蛋白属于同源异型结构域（homeodomain）蛋白超级家族，包含homeodomain功能位点。研究发现多种生物中都存在同源异型结构域蛋白，番茄、狗蔷薇等的WUS蛋白也含有高度保守的homeodomain结构域[16，23]，该结构域可以以单体或异源二聚体的方式与DNA序列特异性结合，参与真核生物的发育过程，在茎尖分生组织中通过调控可塑性干细胞来决定细胞类型，从而在许多器官的生长和发育过程中发挥重要的调控作用[5]。
研究结果表明，WUS基因能使其周围的细胞具有干细胞的特征，是植物干细胞的决定基因[5]，而本试验从马银花愈伤组织中分离得到RoWUS，表明存在WUS这个标志基因的表达，说明马银花愈伤组织可能是干细胞。结构分析表明，RoWUS蛋白具有与拟南芥相似的二三级结构，都是由无规则卷曲、α螺旋和延伸链组成，由此可以推测他们在功能方面具有相似性。林庆光等[27-28]研究发现WUS的编码产物是调控植物干细胞数量的内源性信号分子，在拟南芥体胚发生中起促进作用。Gallois等[29]的研究结果表明WUS的异位表达会在异位产生干细胞并且抑制这些干细胞的分化。因此，在马银花愈伤组织的发生过程中，RoWUS基因在干细胞维持和分化的调控途径中也可能起到极其重要的作用。
3.2 马银花RoWUS基因启动子的潜在功能
生物信息学软件预测表明，马银花愈伤组织RoWUS启动子的转录活性受到多种环境因素和激素的诱导。预测结果显示RoWUS启动子包含多个调控区域，这与Baurle等[30]的研究结果一致，这些调控区域在该基因的转录水平以及组织特异性方面起到重要的调控作用。植物干细胞的分化除了产生地上和地下器官以外，也会根据内外环境信号来决定器官的发生、生长以及衰老等生物学过程。很多植物的侧根干细胞都是木质部顶端的中柱鞘细胞，它们受生长素等因子的诱导，被激活后进入细胞分裂过程[31]。李传友等[32]研究发现在拟南芥的侧根干细胞和根尖生长点中，生长素和激素在干细胞的建立和维持中起到重要作用。Shani和Castellano[33-34]研究发现生长素是影响干细胞微环境的外源性信号，能调控茎尖干细胞的分化、促进器官原基形成。马银花RoWUS启动子含有多种激素应答元件，赤霉素对植物的各个生长发育阶段起到重要影响，水杨酸在植物的抗旱、抗盐、抗病等逆境条件下起到重要调控作用[35]。因此，该启动子对马银花愈伤组织中干细胞的分化也可能具有一定的调控作用。
3.3 马银花愈伤组织不同生长时期RoWUS的表达模式
植物愈伤组织形成过程可分为诱导期、分裂期和分化期。在诱导期时，外植体上已分化的活细胞在外源激素和其他刺激因素的作用下，细胞的大小没有明显改变。在分裂期时细胞快速分裂成子细胞。当细胞继续培养时候，愈伤组织细胞停止分裂，进入分化期，此时细胞的体积相对稳定，不再减少，生长旺盛的愈伤组织呈乳白色、白色或浅绿色，老化的很容易转化为黄色或褐色[36]。大量研究已经明确WUS基因可以促进细胞分裂。本研究中RoWUS基因在第3代以前相对表达量较低，此时愈伤组织细胞较硬，致密性强，水分少，细胞分裂能力较弱，在培养基上生长很慢。从第3代以后RoWUS基因相对表达量迅速升高，并在第5代达到最高峰，此时愈伤组织细胞松软，水分比较多而且透明，说明此时大部分细胞处于分裂期，细胞分裂能力强，能快速分裂成小细胞。随着继代周期代数增加，RoWUS基因相对表达量又迅速下降并趋于稳定，说明大部分愈伤组织细胞处于分化期，出现形态和功能各异的细胞。 3.4 外源GA3和ABA促进马银花愈伤组织RoWUS的表达
许多研究结果表明，增加细胞分裂素浓度和降低赤霉素浓度可以调控分生组织中WUS基因的表达，这对于分生组织的保持和器官的形成是非常重要的[37]。但高浓度细胞分裂素与低浓度赤霉素比值在茎顶端分生组织调控模式中也不是唯一的方式，对于多数植物而言，该模式可以促进器官分化。本研究中，低浓度时RoWUS基因对赤霉素和脱落酸响应比较弱，随着浓度的提高，RoWUS基因对赤霉素和脱落酸的响应逐渐增强，这可能是因为本试验采用的培养基配方中含有活性很强的细胞分裂素TDZ和一定浓度的生长素NAA，从而影响了细胞分裂素与低浓度赤霉素比值，另外，本研究采用的试验材料为愈伤组织，与前人采用的材料不同，这也可能是导致RoWUS的相对表达量随着激素浓度升高而上升的原因。RoWUS的相对表达量在赤霉素和脱落酸浓度为15 mg/L时达到峰值，说明此浓度时该基因中GA3和ABA元件的响应最强，可以促进愈伤组织细胞快速分裂。当浓度进一步增加时，RoWUS基因对赤霉素和脱落酸的响应又减弱，可能是激素浓度过高时对愈伤组织产生了毒害作用。
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关键词 马银花；愈伤组织；WUS；启动子；基因克隆；生物信息学分析；荧光定量PCR
中图分类号 S685.21 文献标识码 A
Abstract The WUSCHEL（WUS）gene was a plant stem cell marker gene. The RoWUS gene was cloned from the callus of Rhododendron ovatum Planch by the homologous cloning and RACE technology（GenBank：KF365488）. The complete cDNA sequence was 1 123 bp，encoding 302 amino acids. The DNA sequence of RoWUS was 2 001 bp which included 3 exons and 2 introns. The RoWUS promoter fragment was cloned from the callus of R. ovatum Planch by the genome walking（GenBank：KF861578），and the sequence was 3 122 bp. Bioinformatics analysis showed that the protein was likely a kind of hydrophilcity and unstable protein which located in the nucleus. The protein had transmembrane structure without signal peptide，which obtained a homeodomain functional site. The phylogenetic tree analysis showed that RoWUS has the closest relationship with Vitis vinifera，Glycine max and Medicago truncatula. The promoter software analysis showed that the promoter fragment contained a number of TATA-box，CAAT-box elements and many other promoter elements，such as light response elements，environmental stress response elements，hormone response elements and some function unknown elements. The qPCR results indicated that RoWUS showed a downward trend after the first rising at different culture stages in R. ovatum Planch callus. It expressed at the highest levels in the 5th cycle. The RoWUS gene had strong response under the hormone treatments of GA3 and ABA，and the peak of expression level appeared at 15 mg/L GA3 and ABA.
Key words Rhododendron ovatum； Callus； WUSCHEL； Promoter； Cloning； Bioinformatics； qPCR
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.10.017
植物干细胞是植物器官发育的源泉，其产生的子细胞具有持续分裂能力并能进行自我更新，是顶端生长过程中必不可少的[1-4]。WUSCHEL（WUS）基因能使它周围的细胞具有干细胞的特征，是植物干细胞的决定基因，该基因的表达与干细胞的形成和器官的发生有密切关系[5]。WUS基因在茎端分生组织中心表达能诱导分生组织细胞增殖，该基因编码一个同源异型结构域（homeodomain）蛋白，此蛋白在多种生物中都存在，参与发育过程并且决定细胞的类型[5]。WUS基因通过与转录阻遏物结合来抑制分化，使茎端分生组织中的干细胞保持未分化状态，既能保持干细胞的多能性特征，又能维持分生组织的形态以及功能的完整，在植物器官和组织的生长过程中对干细胞的维持和分化的调控起到极为重要的作用[6-15]。最近的研究结果表明，WUS基因在番茄花的形态发育、器官鉴别、花离层区和器官脱落过程以及控制番茄小室的数量中起到重要调控作用[16-17]。WUS突变体形成的茎端分生组织不具有正常功能，可能导致叶序混乱、茎和花的分生组织提前终止等现象发生，多数情况下花的大部分器官缺失只形成一个雄蕊，不产生心皮[18-19]。 马银花（Rhododendron ovatum Planch）是杜鹃花科（Ericaceae）杜鹃花属（Rhododendron）常绿灌木或小乔木，为杜鹃花属中的中国特有种，世界著名的观赏花卉。马银花主产江苏、浙江、广东、广西等省（区）海拔1 000 m以下的灌丛中，除了具有很高的园林价值之外，还具有一定的药用价值，具有消热利湿的功效。目前已从拟南芥、番茄、萝卜等物种中克隆得到了WUS基因[20-25]，但已分离出的木本植物WUS基因还相当少。迄今为止，杜鹃花中还没有进行该基因的相关研究，也还未见愈伤组织中克隆得到该基因的相关报道。为了深入研究RoWUS基因在马银花愈伤组织形成过程中对干细胞的维持和分化的调控作用，本研究以马银花试管苗为材料诱导愈伤组织，从愈伤组织中分离和克隆RoWUS基因及启动子，对其进行生物信息学分析，并通过qPCR法研究其在马银花愈伤组织生长过程中的表达规律及外源激素处理对该基因的表达情况，为进一步探讨马银花RoWUS在愈伤组织形成过程中的调控机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
以福建农林大学园艺植物生物工程研究所提供的马银花（Rhododendron ovatum Planch.）无菌试管苗为材料诱导愈伤组织，取继代20 d左右的松散愈伤组织用于总RNA的提取及后续试验。
1.2 方法
1.2.1 马银花愈伤组织DNA及总RNA的提取 愈伤组织DNA的提取采用改良CTAB法，总RNA使用柱式植物RNAOUT2.0（TIANDZ）试剂盒（北京天恩泽公司）提取，然后运用超微量核酸检测仪（ND lite）检测样品浓度和纯度，以1.0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA和RNA完整性。
1.2.2 马银花愈伤组织cDNA合成 采用RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas）试剂盒的方法进行逆转录合成第一链cDNA，用于保守区及3′-RACE的扩增；5′-RACE cDNA 第一链的合成参照Clontech公司SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒的说明书。
1.2.3 引物设计与PCR扩增 RoWUS保守区引物设计及PCR扩增：在NCBI数据库中获得拟南芥、大豆、甜橙、葡萄等的基因序列，利用DNA MAN6.0软件对其进行同源比对分析，在保守区域设计上下游引物RoWUS-F、RoWUS-R，以反转录第一链cDNA为模板进行PCR扩增反应。
RoWUS 3′-RACE和5′-RACE引物设计及PCR扩增：根据已得到的RoWUS基因保守区核苷酸序列设计2条3′-RACE正向特异引物RoWUS 3′GSP1、RoWUS 3′GSP2，结合GeneRacerTM 3′Primer和GeneRacerTM 3′Nested Primer引物，以反转录第一链cDNA为模板进行二轮PCR反应扩增3′末端序列；再分别设计2条5′-RACE反向特异引物RoWUS 5′GSP1、RoWUS 5′GSP2，结合UPM引物，以反转录得到的5′端cDNA为模板进行二轮PCR反应扩增5'末端序列。
RoWUS ORF验证及gDNA引物设计及PCR扩增：在拼接得到的马银花RoWUS全长序列的3′和5′端分别设计上下游特异引物ORF-F、ORF-R，以反转录第一链cDNA为模板对ORF进行验证。同时利用该ORF验证引物，以马银花愈伤组织DNA为模板进行PCR扩增得到该基因的DNA序列。
RoWUS启动子引物设计及PCR扩增：在已克隆得到的RoWUS DNA序列的5′端设计3条同向特异引物SP1、SP2、SP3。参照Genome Walking Kit（TaKaRa）的方法，首先以DNA为模板，用SP1与AP1进行第一轮热不对称PCR反应；然后以第一轮PCR产物为模板，用SP2与AP1进行第二轮热不对称PCR反应；再以第二轮PCR产物为模板，用SP3与AP1进行第三轮热不对称PCR反应。
所有引物均由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。引物序列、退火温度、扩增目的片段大小及扩增用途见表1。
PCR扩增体系：RoWUS基因克隆PCR体系为cDNA模板1 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，2×Prime STARR GC Buffer（Mg2+ plus）12.5 μL，dNTPs Mixture（2.5 mmol/L）2 μL，PrimeSTARR HS DNA polymerase（2.5 U/μL）0.25 μL，ddH2O 7.25 μL，总计25 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性45 s，退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min。根据扩增的目的片段大小不同PCR程序进行适当调整。启动子克隆PCR体系参考Genome Walking Kit（Takara）说明书。
1.2.4 目的片段的回收、克隆和测序 PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后割胶回收目的产物，回收方法参照EzgeneTM Gel/PCR Extraction Kit（BIOMIGA）说明书。取4 μL目的产物与1 μL pEASYTM-Blunt Zero进行连接，然后转化至50 μL Trans-T1感受态细胞，挑取单克隆于菌液中过夜培养，菌液经PCR鉴定后送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。
1.2.5 马银花愈伤组织RoWUS基因的生物信息学分析及启动子序列分析 在NCBI数据库中对测序结果进行BLAST比对分析。使用DNA MAN6.0拼接序列并对其氨基酸序列进行推导。采用ExPASy Protparam预测编码蛋白的理化性质；以PredictProtein进行亚细胞定位；蛋白质信号肽预测采用SignaIP 4.1 Server；采用TMpred预测蛋白质跨膜结构；NetPhos 2.0 Serve预测蛋白质磷酸化位点；ScanProsite预测蛋白质的功能位点；经InterProScan预测蛋白质的保守结构域；以PHD在线软件预测蛋白质二级结构；利用SWISSMODEL对三维结构进行预测；采用MEGA5.0软件构建系统进化树。利用Neural Network Promoter Prediction（http：//www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html）软件对RoWUS基因可能的核心启动子位置及可能存在的转录起始位点进行分析；使用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）结合PLACE（http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalup.html）软件对该启动子序列潜在的顺式作用元件进行分析。 1.2.6 马银花愈伤组织不同生长时期RoWUS的定量表达分析 以EF-1a为内参基因，检测RoWUS在马银花愈伤组织不同生长时期的表达情况。本试验采用TaKaRa SYBR ExScriptTM 试剂和罗氏LightCycler480仪器，使用柱式植物RNAOUT2.0（TIANDZ）试剂盒（北京天恩泽公司）提取马银花愈伤组织不同继代周期（第1、3、5、7、9、40、45代）的总RNA，并用SYBR ExScriptTM RT-PCR试剂盒（TAKARA公司）合成cDNA，根据荧光引物设计原则设计上下游引物进行PCR扩增。qPCR反应体系和扩增程序参照Lin等的方法[26]。反应结束后进行扩增曲线和溶解曲线等分析，检测引物的特异性，各不同生长时期的cDNA模板混合样以不同梯度稀释（5×、25×、125×、625×），进行标准曲线制作，获得扩增效率等相关参数。然后将不同生长时期的马银花愈伤组织cDNA分别稀释成10倍样进行荧光定量PCR，每个样本重复3次。qPCR引物见表1。
1.2.7 外源GA3和ABA处理下RoWUS的定量表达分析 以EF-1a为内参基因，检测马银花愈伤组织RoWUS在不同浓度GA3（0、5、10、15、20 mg/L）和ABA（0、5、10、15、20 mg/L）处理24 h后的表达情况。试验方法同1.2.6。
2 结果与分析
2.1 马银花愈伤组织RoWUS cDNA、gDNA及启动子序列的获得
经巢式PCR扩增得到与预期一致的保守片段，测序表明该序列长度为199 bp，NCBI数据库比对结果表明，该片段与蓖麻、葡萄、杨树、矮牵牛等的WUS基因序列具有较高的同源性，初步推断克隆得到马银花愈伤组织RoWUS的部分序列。经二轮PCR扩增后分别得到204 bp 5′-RACE序列和825 bp 3′-RACE序列，其中5′-UTR长度为101 bp，3′-UTR长度为94 bp，终止密码子为TAA， Poly（A）尾长18 bp。
序列拼接得到RoWUS全长序列为1 123 bp，对拼接结果进行PCR验证得到约900 bp目的片段，测序表明验证产物长度为922 bp，包括完整的开放阅读框，与拼接结果相符（图1、2）。将RoWUS的核苷酸序列在NCBI中进行BLAST比对，结果表明该序列与葡萄、毛果杨、番茄、向日葵的同源性分别达到87%、86%、85%、84%，说明所得片段为WUS基因，将其命名为RoWUS，GenBank登录号：KF365488。
对马银花基因组DNA进行PCR扩增得到一条大约2 000 bp的片段（图1），测序表明该片段大小为2 001 bp。DNAMAN 分析表明，该序列包含2个内含子和3个外显子，3个外显子序列与cDNA序列一致，在DNA序列上的位点分别是1～370；831～946；1 579～2 001。所有内含子的剪切位点均符合真核生物“GT-AG”规则。
经三轮巢式PCR扩增得到约3 500 bp的启动子序列（图1），测序结果显示该片段长度为3 427 bp。根据DNA序列拼接结果和NCBI比对结果，表明所得序列为该基因的启动子序列，RoWUS 5′端调控序列长度为3 122 bp，该序列在GenBank上的序列号为KF861578。
2.2 生物信息学分析
ProtParam预测可知马银花RoWUS的分子式为C1 444H2 186N416O477S13，由4 536个原子构成，包括302个氨基酸，相对分子量为33.4 ku，理论等电点（pI）5.81，带正电的氨基酸（Arg+Lys）有25个，带负电的氨基酸（Asp+Glu）有30个，总平均疏水性为-0.830，属于亲水蛋白，此蛋白不稳定系数达到58.52，是一个不稳定蛋白。
SignaIP 4.1 Server预测可知马银花RoWUS蛋白无信号肽。经TMpred软件预测RoWUS在164～183处形成一个由内向外的跨膜螺旋。PredictProtein亚细胞定位表明，RoWUS定位于细胞核的可能性最高。根据NCBI-CDS对马银花愈伤组织RoWUS结构域分析的结果，该蛋白属于同源异型结构域（homeodomain）蛋白超级家族，包含homeodomain功能位点（图2）。Coils软件预测结果显示RoWUS可能形成卷曲螺旋。NetPhos 2.0 Serve软件预测结果表明RoWUS含有23个蛋白磷酸化位点，其中丝氨酸（Ser）13个，苏氨酸（Thr）3个，酪氨酸（Tyr）7个。PHD软件预测表明RoWUS二级结构以无规则卷曲结构为主，所占的比例为74.83%，其次为α螺旋结构占15.23%，延伸链所占的比例较少，为9.93%。SWISSMODEL三维结构预测显示，RoWUS的主要结构元件是无规则卷曲、α螺旋和延伸链（图3）。
将马银花RoWUS的氨基酸序列在NCBI中进行在线Blast，结果显示马银花RoWUS氨基酸序列与无油樟（Amborella trichopoda）、毛果杨（Populus trichocarpa）、水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）的同源性分别达到了93%、86%、79%、75%，比对结果表明马银花RoWUS与其他物种该基因同源性较高。为了研究RoWUS的进化关系，本研究选取大豆、葡萄、番茄、毛白杨、银杏等18种植物的WUS氨基酸序列，运用MEGA5.0软件的邻位相连法（NJ）构建WUS的系统进化树（图4）。进化结果表明，WUSCHEL根据种属关系被分为两大类，其中被子植物聚为一类、裸子植物聚为另一类。在被子植物中水稻和玉米等单子叶植物聚为一类，其他双子叶植物聚为另一类。马银花单独形成一个分支，与葡萄、大豆和苜蓿的亲缘关系较近，与樟子松、银杏等裸子植物亲缘关系较远。 2.3 马银花RoWUS启动子序列及其结构分析
马银花RoWUS启动子具有3 122 bp的核苷酸序列，Neural Network Promoter Prediction预测到该启动子具有多个核心启动子区域，其中最可能的核心启动子区域为GTCGTTCATATATATATTTATGC
CCGATCAATCTGATTTTTCTCTGCGAT，可能的转录起始位点位于翻译起始位点ATG上游的-1 381 bp处的T（将起始密码子ATG中的A定义为位+1）。
PlantCARE顺式元件分析表明，该序列存在大量的调控元件，其中核心元件TATA-Box有57个、CAAT-Box有27个。 此外，还存在多个光响应元件AE-box、G-Box、I-box、L-box、AT1-motif、ATCT-motif、GAG-motif、GATA-motif、TCCC-motif、TCT-motif和Sp1；激素应答元件P-box、TATC-box、TCA-element、TGA-element和ABRE；逆境胁迫响应元件ARE、TC-rich repeat、MBS及circadian，另外还存在一些其他功能的元件。
2.4 马银花愈伤组织不同生长时期RoWUS的定量表达分析
qPCR结果经扩增曲线和溶解曲线分析结果表明，EF-1a引物和qPCR引物特异性好，标准曲线符合试验要求。马银花愈伤组织不同生长时期RoWUS的相对表达情况见图5。由图5可以看出，RoWUS在马银花愈伤组织各个继代周期都有表达，且呈现先升高后下降的变化趋势，最后趋于稳定状态。RoWUS在第1代之后表达量缓慢上升，第3代之后急剧上升，在第5代时表达量达到峰值，此时细胞处于分裂旺盛期。第5代之后表达量迅速下降，从第7代之后表达量没有明显变化。
2.5 外源GA3和ABA处理下RoWUS的定量表达分析
马银花愈伤组织RoWUS在不同浓度赤霉素和脱落酸处理下的定量表达情况见图6。试验结果表明，赤霉素浓度较低时RoWUS的响应比较弱，随着赤霉素浓度的升高RoWUS对赤霉素响应逐渐增强，在浓度为15 mg/L时表达量达到峰值，浓度进一步增加时又降低。这可能是试验所用的培养基中含有活性较高的细胞分裂素和一定浓度的生长素导致的。用低浓度脱落酸处理时RoWUS相对表达量较稳定，但是当ABA浓度从10 mg/L增加到15 mg/L时RoWUS的相对表达量迅速上升，在15 mg/L时达到峰值。说明RoWUS在脱落酸浓度为15 mg/L时响应最强，可以促进愈伤组织细胞快速分裂。
3 讨论与结论
3.1 马银花愈伤组织RoWUS的功能推测
对马银花RoWUS的氨基酸序列进行生物信息学分析发现马银花RoWUS蛋白具有跨膜螺旋，不含信号肽，属于可溶性的亲水蛋白。亚细胞定位表明，RoWUS蛋白主要在细胞核内发挥作用，这与谭文勃等[5]的研究结论一致。马银花RoWUS结构域分析发现该蛋白属于同源异型结构域（homeodomain）蛋白超级家族，包含homeodomain功能位点。研究发现多种生物中都存在同源异型结构域蛋白，番茄、狗蔷薇等的WUS蛋白也含有高度保守的homeodomain结构域[16，23]，该结构域可以以单体或异源二聚体的方式与DNA序列特异性结合，参与真核生物的发育过程，在茎尖分生组织中通过调控可塑性干细胞来决定细胞类型，从而在许多器官的生长和发育过程中发挥重要的调控作用[5]。
研究结果表明，WUS基因能使其周围的细胞具有干细胞的特征，是植物干细胞的决定基因[5]，而本试验从马银花愈伤组织中分离得到RoWUS，表明存在WUS这个标志基因的表达，说明马银花愈伤组织可能是干细胞。结构分析表明，RoWUS蛋白具有与拟南芥相似的二三级结构，都是由无规则卷曲、α螺旋和延伸链组成，由此可以推测他们在功能方面具有相似性。林庆光等[27-28]研究发现WUS的编码产物是调控植物干细胞数量的内源性信号分子，在拟南芥体胚发生中起促进作用。Gallois等[29]的研究结果表明WUS的异位表达会在异位产生干细胞并且抑制这些干细胞的分化。因此，在马银花愈伤组织的发生过程中，RoWUS基因在干细胞维持和分化的调控途径中也可能起到极其重要的作用。
3.2 马银花RoWUS基因启动子的潜在功能
生物信息学软件预测表明，马银花愈伤组织RoWUS启动子的转录活性受到多种环境因素和激素的诱导。预测结果显示RoWUS启动子包含多个调控区域，这与Baurle等[30]的研究结果一致，这些调控区域在该基因的转录水平以及组织特异性方面起到重要的调控作用。植物干细胞的分化除了产生地上和地下器官以外，也会根据内外环境信号来决定器官的发生、生长以及衰老等生物学过程。很多植物的侧根干细胞都是木质部顶端的中柱鞘细胞，它们受生长素等因子的诱导，被激活后进入细胞分裂过程[31]。李传友等[32]研究发现在拟南芥的侧根干细胞和根尖生长点中，生长素和激素在干细胞的建立和维持中起到重要作用。Shani和Castellano[33-34]研究发现生长素是影响干细胞微环境的外源性信号，能调控茎尖干细胞的分化、促进器官原基形成。马银花RoWUS启动子含有多种激素应答元件，赤霉素对植物的各个生长发育阶段起到重要影响，水杨酸在植物的抗旱、抗盐、抗病等逆境条件下起到重要调控作用[35]。因此，该启动子对马银花愈伤组织中干细胞的分化也可能具有一定的调控作用。
3.3 马银花愈伤组织不同生长时期RoWUS的表达模式
植物愈伤组织形成过程可分为诱导期、分裂期和分化期。在诱导期时，外植体上已分化的活细胞在外源激素和其他刺激因素的作用下，细胞的大小没有明显改变。在分裂期时细胞快速分裂成子细胞。当细胞继续培养时候，愈伤组织细胞停止分裂，进入分化期，此时细胞的体积相对稳定，不再减少，生长旺盛的愈伤组织呈乳白色、白色或浅绿色，老化的很容易转化为黄色或褐色[36]。大量研究已经明确WUS基因可以促进细胞分裂。本研究中RoWUS基因在第3代以前相对表达量较低，此时愈伤组织细胞较硬，致密性强，水分少，细胞分裂能力较弱，在培养基上生长很慢。从第3代以后RoWUS基因相对表达量迅速升高，并在第5代达到最高峰，此时愈伤组织细胞松软，水分比较多而且透明，说明此时大部分细胞处于分裂期，细胞分裂能力强，能快速分裂成小细胞。随着继代周期代数增加，RoWUS基因相对表达量又迅速下降并趋于稳定，说明大部分愈伤组织细胞处于分化期，出现形态和功能各异的细胞。 3.4 外源GA3和ABA促进马银花愈伤组织RoWUS的表达
许多研究结果表明，增加细胞分裂素浓度和降低赤霉素浓度可以调控分生组织中WUS基因的表达，这对于分生组织的保持和器官的形成是非常重要的[37]。但高浓度细胞分裂素与低浓度赤霉素比值在茎顶端分生组织调控模式中也不是唯一的方式，对于多数植物而言，该模式可以促进器官分化。本研究中，低浓度时RoWUS基因对赤霉素和脱落酸响应比较弱，随着浓度的提高，RoWUS基因对赤霉素和脱落酸的响应逐渐增强，这可能是因为本试验采用的培养基配方中含有活性很强的细胞分裂素TDZ和一定浓度的生长素NAA，从而影响了细胞分裂素与低浓度赤霉素比值，另外，本研究采用的试验材料为愈伤组织，与前人采用的材料不同，这也可能是导致RoWUS的相对表达量随着激素浓度升高而上升的原因。RoWUS的相对表达量在赤霉素和脱落酸浓度为15 mg/L时达到峰值，说明此浓度时该基因中GA3和ABA元件的响应最强，可以促进愈伤组织细胞快速分裂。当浓度进一步增加时，RoWUS基因对赤霉素和脱落酸的响应又减弱，可能是激素浓度过高时对愈伤组织产生了毒害作用。
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