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摘要 [目的]研究柑橘黄龙病病原及其分化。 [方法]采集肇庆周边各区县柑橘黄龙病的枝、叶共计8个黄龙病样品，利用黄龙病内生菌的细菌通用引物对其16S rDNA片段进行PCR扩增，将其扩增产物纯化、回收、克隆后，转化大肠杆菌，提取质粒，进行序列测定。[结果]所克隆的序列与众多的Uncultured bacterium 都有极高的相似度，其序列在同源性檢测中，与其相似度最高的是Uncultured bacterium clone yf5180，达到91.3%。[结论]表明肇庆周边黄龙病柑橘的枝、叶内生菌可以扩增出特异性16S rDNA片段，该序列属于一个新的细菌种属。
关键词 柑橘黄龙病；内生菌；16S rDNA；基因克隆；测序；分析
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）13-040-02
Abstract [Objective] The aim was to study disease pathogen and its differentiation of citrus bacteria .[Method]By analysis of 16S rDNA of endogenous bacteria in citrus，the mechanism of HLB in citrus would be known further.The experiment would be brought out by the amplicating specific 16S rDNA fragment from endogenous bacteria .[Result]The result showed that one 1261 long fragment was gotten， and the sequencing and analysis have got known.It’s homology was 91.3% to Uncultured bacterium clone yf5180.[Conclusion] The study showed that citrus HLB branches and leaves of endogenous bacteria could amplify the specificity of 16S rDNA fragments around zhaoqing， and the fragments belonged to a new bacterial species.
Key words Citrus HLB； Endogenous bacteria； 16S rDNA； Gene cloning； Sequencing and analysis.
柑橘是世界第一大水果，主要分布在35° N以南的区域，性喜温暖湿润，有大水体增温的地域可向北推至45° N。世界上有135个国家生产柑橘，年产量10 282.2万t，面积715.3万hm2，均居百果之首，产量第1位的是巴西，为2 425.26万t，第2位美国，为1 633.52万t，中国第3，为1 078万t，再后是墨西哥、西班牙、伊朗、印度、意大利等国[1] 。
柑橘黄龙病是一种世界范围内的柑橘毁灭性病害，该病最早在我国被发现后的近100年间，已广泛分布于亚洲、非洲和美洲等地的国家和地区。黄龙病能侵染各种柑橘类植物，病树主要表现为经济寿命短，产量低，果品质劣，引起巨大的经济损失。柑橘树的经济寿命原来可达几十年，乃至上百年，但受黄龙病危害之后，柑橘树的寿命大大缩短，仅有10年左右。黄龙病曾给东南亚以及我国的广东、广西和福建3省区的柑橘产业造成严重影响，近年来该病害又有卷土重来之势[2]。
黄龙病的病原物尚不能人工培养，目前普遍认为原核生物薄壁菌门变形菌纲（Proteobacteria）α变型菌纲（Alphaproteobaeteriacea）根瘤菌目（Rhizobiales）α根瘤菌科（Rhizobiaceae）韧皮部杆菌属（Candidatus Libefibaeter）是引起黄龙病的主要病原。柑橘黄龙病无特效抑制剂，也没有抗（耐）病品种可供应用。因此，只有通过严格地进行检疫措施、使用无病苗木、及时挖除病树，以及系统、全面地防治木虱是目前防治黄龙病最有效的方法[3]。
16S rDNA是原核生物分类中最常用和最有效的方法[4]。16S rDNA序列具有高度保守性，可以用来精确鉴定原核生物之间的亲缘关系，其所蕴含的信息能反映生物界的进化关系[5]。通过比较其所特有的16S rDNA序列间的同源性差异程度可以判断种属及亲缘关系，在原核生物的鉴定和分析方面具有重要地位[6]。
为了更好地对黄龙病病原及其分化进行研究，笔者运用PCR技术对从我国广东省肇庆地区高要、四会、广宁、封开、怀集5个市县采集的40多个黄龙病感染柑橘样品进行了菌种的分离、纯化和保存，然后对其16S rDNA序列进行PCR扩增、克隆和DNA测序，并构建系统发育树。
1 材料与方法
1.1 材料
柑橘黄龙病植株内生菌来自肇庆地区，实验室分离。克隆用大肠杆菌菌种E. coli TGI、质粒由肇庆学院生物医药工程中心保存；克隆载体pMD18T Vector购自TaKaRa公司。
1.2 方法
1.2.1 柑橘内生菌分离。①从怀宁、广宁等地的柑橘果园，取回无病植株和有病植株的枝叶及土壤，按照常规细菌分离方法进行内生菌分离。②细菌培养。将取自患有黄龙病的柑橘枝、叶部分分离出的病原细菌接入到含有LB培养液的试管中活化、恒温振荡培养。
1.2.2 16S rDNA克隆。①细菌DNA提取。 将来源肇庆不同地区的柑橘内生菌基因组DNA进行提取，按照北京天根生化科技有限公司细菌基因组DNA提取试剂盒操作步骤进行。②DNA定量。空白对照为250 μl ddH2O，吸取样本1 μl加入250 μl ddH2O在紫外分光计上测定A260和A280，可得到DNA浓度，进而粗略估计样品纯度。③PCR扩增16S rDNA。 设计细菌的通用PCR 引物 27F：5′ AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3′；1429R：5′ TAGGGTTACCTTGTTACGACTT 3′。
PCR反应条件：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃ 保存。
以从肇庆周边各区县疑似患有黄龙病的柑橘枝和叶中所分离出的内生菌16S rDNA为模板，用上述引物进行PCR扩增。
④电泳检测16S rDNA片段。⑤目的基因克隆。将纯化后的PCR产物与pMD 18T载体16 ℃下连接过夜后，转化感受态细胞DH5α中，涂布于含Amp、Xgal和IPTG的LB平板上，37 ℃过夜培养。挑选白色菌落接种于含Amp的LB液体培养基中，37 ℃、200 r/min振荡过夜培养。
1.2.3 基因序列测定。菌液PCR鉴定后，将筛选的阳性单菌落送至南方基因组中心测序。
2 结果与分析
2.1 16S rDNA片段分离
从柑橘黄龙病植株中分离出内生真菌40株，细菌20株。从细菌中提取出DNA进行PCR扩增，结果扩增出1 261 nt的16S rDNA片段（图1）。
2.2 序列分析
经序列测定发现，从不同地区柑橘黄龙病植株中分离到的内生菌在健康株中也存在1 261 nt的16S rDNA片段。通过序列分析，可以推测该内生菌与众多的未能培养的细菌（Uncultured bacterium）都有极高的相似度，其中的测序结果在同源性检测中，与其相似度最高的是Uncultured bacterium clone yf5180，达到91.3%。说明此序列是一个较新的序列，是一种与已知细菌种类不同的细菌，因为目前尚未见柑橘黄龙病病原分离培养的报道，也没有明确确定柑橘黄龙病的病原菌是何种细菌，此种细菌极有可能就是柑橘黄龙病的致病菌。序列测定结果见图2。
序列分析可知，在NCBI数据库的同源性对比中，同源性达到90.5%～91.3%是未能够培养的细菌Uncultered candidated bacterGS242.seq和Uncultured bacterium clone yf5180 16S ribosomal RNA gene，同源性相差3%，即可认为是不同种（表1）。
2.3 进化树分析
分子进化树分析表明，该内生菌的16S rDNA亲缘关系与未能培养的细菌（Uncultured bacterium）更接近（图3）。
由图3可知，各菌株的同源性都在81.0%以上，最高达91.3%。目前已知细菌和植原体16S rDNA基因只要相差3%以上则可定为不同的种。与该内生菌同源性最高的是未能够培养细菌Uncultered candidated bacterGS242.seq和Uncultured bacterium clone yf5180，达到90.5%～91.3%，故可认为该内生菌虽然与未能培养的细菌（Uncultured bacterium）的亲缘关系较为接近，但该内生菌应该属于一个新的菌株。
3 结论与讨论
未能培养的细菌（Uncultured bacterium ）主要是指尚未能够完全分离培养的细菌。因为目前还没有成功分离培养柑橘黄龙病病原的报道。研究表明，未能培养的细菌在柑橘黄龙病的内生菌所占比例大于5%[7]，該内生菌可能为柑橘黄龙病的病原菌。16S rDNA 存在于所有原核生物的细胞中，它是研究细菌分类、进化和亲缘关系的重要指标，可用于进化程度不同的生物系统发育研究，特别对于不能进行人工培养的细菌，利用其进行分类是一个有力的工具。目前已知细菌和植原体16S rDNA 基因只要相差3%以上则可定为不同的种[8]。
该研究运用分子生物学的方法对广东肇庆地区柑橘黄龙病植株体的16S rDNA进行PCR扩增，并对扩增产物进行克隆、序列测定及同源关系分析，确定了该植株的分类地位。
目前，国内外学者对柑橘黄龙病植株病原进行了大量研究，以期为柑橘黄龙病的防治提供参考依据。从该研究扩增到的肇庆柑橘黄龙病植原体16S rDNA基因中发现一个特殊的序列，在NCBI数据库的同源性对比中，与其相似度最高的是Uncultered candidated bacterGS242.seq和Uncultured bacterium clone yf5180，达到90.5%～91.3%。同源性相差3%，即可认为是不同种。尽管有研究利用含有柑橘叶脉提取物的培养基能成功培养出亚洲种黄龙病病原菌，并完成其柯赫氏法则验证的报道[9]，但该试验为孤例，尚无重复成功的报道[9]。除了个例，目前还没有成功分离培养柑桔黄龙病病原的报道，所以该研究发现了一个尚未发现的细菌种属。此细菌很有可能是柑橘黄龙病的病原菌。对于此细菌的研究是一个较为有价值的课题。
参考文献
[1]田亚南，柯穗，李韬.应用电镜与PCR技术检测王官溪蜜柚黄龙病病原[J].植物病理学报，2000，30（1）： 76-81.
[2] LI W，LEVY L，HARTUNG J S.Quantitative distribution of Candidatus Liberibacter siaticus in citrus plants with citrus huanglongbing[J].Phytopathology，2009，99：139-144.
[3] 孔维文，邓晓玲，梁志慧，等.柑桔黄龙病病原DNA片段的克隆及序列分析[J].植物病理学报，2000，30（1）： 71-75.
[4] 张会敏，冯友军.一株野生细菌的16S rDNA序列分析与系统发育树的构建[J].生物信息学报，2004，8（3）：2-4.
[5] 廖晓兰，朱水芳，赵文军，等.柑橘黄龙病病原16S rDNA克隆、测序及实时荧光PCR检测方法的建立[J].农业生物技术学报，2004，12（1）： 80- 85.
[6] 单振菊，冯震，周根，等.沙田柚黄龙病病原16S rDNA片段的克隆与序列分析[J].广西农业生物科学，2006，25（1）：61-65.
[7] 王爱华，殷幼平，熊红利，等.广西柑橘黄龙病植株韧皮部内生细菌多样性分析[J].中国农业科学，2010，43（23）：4823-4833.
[8] 单振菊，冯震，周根，等.南方5省区柑橘黄龙病病原16S rDNA片段的克隆与序列分析[J].华南农业大学学报，2008，1（2）： 29.
[9] SECHLER A，SCHUENZEL E L，COOKE P，et al.Cultivation of ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’，‘Ca .L.africanus’，and’Ca.L.americanus’ associated with Huanglongbing[J].Phytopathology，2009，99（5）：480-486.
关键词 柑橘黄龙病；内生菌；16S rDNA；基因克隆；测序；分析
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）13-040-02
Abstract [Objective] The aim was to study disease pathogen and its differentiation of citrus bacteria .[Method]By analysis of 16S rDNA of endogenous bacteria in citrus，the mechanism of HLB in citrus would be known further.The experiment would be brought out by the amplicating specific 16S rDNA fragment from endogenous bacteria .[Result]The result showed that one 1261 long fragment was gotten， and the sequencing and analysis have got known.It’s homology was 91.3% to Uncultured bacterium clone yf5180.[Conclusion] The study showed that citrus HLB branches and leaves of endogenous bacteria could amplify the specificity of 16S rDNA fragments around zhaoqing， and the fragments belonged to a new bacterial species.
Key words Citrus HLB； Endogenous bacteria； 16S rDNA； Gene cloning； Sequencing and analysis.
柑橘是世界第一大水果，主要分布在35° N以南的区域，性喜温暖湿润，有大水体增温的地域可向北推至45° N。世界上有135个国家生产柑橘，年产量10 282.2万t，面积715.3万hm2，均居百果之首，产量第1位的是巴西，为2 425.26万t，第2位美国，为1 633.52万t，中国第3，为1 078万t，再后是墨西哥、西班牙、伊朗、印度、意大利等国[1] 。
柑橘黄龙病是一种世界范围内的柑橘毁灭性病害，该病最早在我国被发现后的近100年间，已广泛分布于亚洲、非洲和美洲等地的国家和地区。黄龙病能侵染各种柑橘类植物，病树主要表现为经济寿命短，产量低，果品质劣，引起巨大的经济损失。柑橘树的经济寿命原来可达几十年，乃至上百年，但受黄龙病危害之后，柑橘树的寿命大大缩短，仅有10年左右。黄龙病曾给东南亚以及我国的广东、广西和福建3省区的柑橘产业造成严重影响，近年来该病害又有卷土重来之势[2]。
黄龙病的病原物尚不能人工培养，目前普遍认为原核生物薄壁菌门变形菌纲（Proteobacteria）α变型菌纲（Alphaproteobaeteriacea）根瘤菌目（Rhizobiales）α根瘤菌科（Rhizobiaceae）韧皮部杆菌属（Candidatus Libefibaeter）是引起黄龙病的主要病原。柑橘黄龙病无特效抑制剂，也没有抗（耐）病品种可供应用。因此，只有通过严格地进行检疫措施、使用无病苗木、及时挖除病树，以及系统、全面地防治木虱是目前防治黄龙病最有效的方法[3]。
16S rDNA是原核生物分类中最常用和最有效的方法[4]。16S rDNA序列具有高度保守性，可以用来精确鉴定原核生物之间的亲缘关系，其所蕴含的信息能反映生物界的进化关系[5]。通过比较其所特有的16S rDNA序列间的同源性差异程度可以判断种属及亲缘关系，在原核生物的鉴定和分析方面具有重要地位[6]。
为了更好地对黄龙病病原及其分化进行研究，笔者运用PCR技术对从我国广东省肇庆地区高要、四会、广宁、封开、怀集5个市县采集的40多个黄龙病感染柑橘样品进行了菌种的分离、纯化和保存，然后对其16S rDNA序列进行PCR扩增、克隆和DNA测序，并构建系统发育树。
1 材料与方法
1.1 材料
柑橘黄龙病植株内生菌来自肇庆地区，实验室分离。克隆用大肠杆菌菌种E. coli TGI、质粒由肇庆学院生物医药工程中心保存；克隆载体pMD18T Vector购自TaKaRa公司。
1.2 方法
1.2.1 柑橘内生菌分离。①从怀宁、广宁等地的柑橘果园，取回无病植株和有病植株的枝叶及土壤，按照常规细菌分离方法进行内生菌分离。②细菌培养。将取自患有黄龙病的柑橘枝、叶部分分离出的病原细菌接入到含有LB培养液的试管中活化、恒温振荡培养。
1.2.2 16S rDNA克隆。①细菌DNA提取。 将来源肇庆不同地区的柑橘内生菌基因组DNA进行提取，按照北京天根生化科技有限公司细菌基因组DNA提取试剂盒操作步骤进行。②DNA定量。空白对照为250 μl ddH2O，吸取样本1 μl加入250 μl ddH2O在紫外分光计上测定A260和A280，可得到DNA浓度，进而粗略估计样品纯度。③PCR扩增16S rDNA。 设计细菌的通用PCR 引物 27F：5′ AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3′；1429R：5′ TAGGGTTACCTTGTTACGACTT 3′。
PCR反应条件：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃ 保存。
以从肇庆周边各区县疑似患有黄龙病的柑橘枝和叶中所分离出的内生菌16S rDNA为模板，用上述引物进行PCR扩增。
④电泳检测16S rDNA片段。⑤目的基因克隆。将纯化后的PCR产物与pMD 18T载体16 ℃下连接过夜后，转化感受态细胞DH5α中，涂布于含Amp、Xgal和IPTG的LB平板上，37 ℃过夜培养。挑选白色菌落接种于含Amp的LB液体培养基中，37 ℃、200 r/min振荡过夜培养。
1.2.3 基因序列测定。菌液PCR鉴定后，将筛选的阳性单菌落送至南方基因组中心测序。
2 结果与分析
2.1 16S rDNA片段分离
从柑橘黄龙病植株中分离出内生真菌40株，细菌20株。从细菌中提取出DNA进行PCR扩增，结果扩增出1 261 nt的16S rDNA片段（图1）。
2.2 序列分析
经序列测定发现，从不同地区柑橘黄龙病植株中分离到的内生菌在健康株中也存在1 261 nt的16S rDNA片段。通过序列分析，可以推测该内生菌与众多的未能培养的细菌（Uncultured bacterium）都有极高的相似度，其中的测序结果在同源性检测中，与其相似度最高的是Uncultured bacterium clone yf5180，达到91.3%。说明此序列是一个较新的序列，是一种与已知细菌种类不同的细菌，因为目前尚未见柑橘黄龙病病原分离培养的报道，也没有明确确定柑橘黄龙病的病原菌是何种细菌，此种细菌极有可能就是柑橘黄龙病的致病菌。序列测定结果见图2。
序列分析可知，在NCBI数据库的同源性对比中，同源性达到90.5%～91.3%是未能够培养的细菌Uncultered candidated bacterGS242.seq和Uncultured bacterium clone yf5180 16S ribosomal RNA gene，同源性相差3%，即可认为是不同种（表1）。
2.3 进化树分析
分子进化树分析表明，该内生菌的16S rDNA亲缘关系与未能培养的细菌（Uncultured bacterium）更接近（图3）。
由图3可知，各菌株的同源性都在81.0%以上，最高达91.3%。目前已知细菌和植原体16S rDNA基因只要相差3%以上则可定为不同的种。与该内生菌同源性最高的是未能够培养细菌Uncultered candidated bacterGS242.seq和Uncultured bacterium clone yf5180，达到90.5%～91.3%，故可认为该内生菌虽然与未能培养的细菌（Uncultured bacterium）的亲缘关系较为接近，但该内生菌应该属于一个新的菌株。
3 结论与讨论
未能培养的细菌（Uncultured bacterium ）主要是指尚未能够完全分离培养的细菌。因为目前还没有成功分离培养柑橘黄龙病病原的报道。研究表明，未能培养的细菌在柑橘黄龙病的内生菌所占比例大于5%[7]，該内生菌可能为柑橘黄龙病的病原菌。16S rDNA 存在于所有原核生物的细胞中，它是研究细菌分类、进化和亲缘关系的重要指标，可用于进化程度不同的生物系统发育研究，特别对于不能进行人工培养的细菌，利用其进行分类是一个有力的工具。目前已知细菌和植原体16S rDNA 基因只要相差3%以上则可定为不同的种[8]。
该研究运用分子生物学的方法对广东肇庆地区柑橘黄龙病植株体的16S rDNA进行PCR扩增，并对扩增产物进行克隆、序列测定及同源关系分析，确定了该植株的分类地位。
目前，国内外学者对柑橘黄龙病植株病原进行了大量研究，以期为柑橘黄龙病的防治提供参考依据。从该研究扩增到的肇庆柑橘黄龙病植原体16S rDNA基因中发现一个特殊的序列，在NCBI数据库的同源性对比中，与其相似度最高的是Uncultered candidated bacterGS242.seq和Uncultured bacterium clone yf5180，达到90.5%～91.3%。同源性相差3%，即可认为是不同种。尽管有研究利用含有柑橘叶脉提取物的培养基能成功培养出亚洲种黄龙病病原菌，并完成其柯赫氏法则验证的报道[9]，但该试验为孤例，尚无重复成功的报道[9]。除了个例，目前还没有成功分离培养柑桔黄龙病病原的报道，所以该研究发现了一个尚未发现的细菌种属。此细菌很有可能是柑橘黄龙病的病原菌。对于此细菌的研究是一个较为有价值的课题。
参考文献
[1]田亚南，柯穗，李韬.应用电镜与PCR技术检测王官溪蜜柚黄龙病病原[J].植物病理学报，2000，30（1）： 76-81.
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[6] 单振菊，冯震，周根，等.沙田柚黄龙病病原16S rDNA片段的克隆与序列分析[J].广西农业生物科学，2006，25（1）：61-65.
[7] 王爱华，殷幼平，熊红利，等.广西柑橘黄龙病植株韧皮部内生细菌多样性分析[J].中国农业科学，2010，43（23）：4823-4833.
[8] 单振菊，冯震，周根，等.南方5省区柑橘黄龙病病原16S rDNA片段的克隆与序列分析[J].华南农业大学学报，2008，1（2）： 29.
[9] SECHLER A，SCHUENZEL E L，COOKE P，et al.Cultivation of ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’，‘Ca .L.africanus’，and’Ca.L.americanus’ associated with Huanglongbing[J].Phytopathology，2009，99（5）：480-486.