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摘要：目的 优选感甦合剂的提取工艺。方法 采用正交试验法，以感甦合剂主要药效成分绿原酸、葛根素及干膏收率作为评价指标，优选提取工艺。结果 最优提取工艺为：6倍加水量，提取3次，每次提取1 h。结论 优选的提取工艺稳定、合理、可行。
关键词：感甦合剂；提取工艺；绿原酸；葛根素；正交试验
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2012.10.017
中图分类号：R283.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）10-0043-03
“感甦”为成都中医药大学附属医院国医大师郭子光教授治疗外感发热的经典方，由金银花、葛根、竹叶柴胡、防风等8种药味组成，具有清热解毒、解表退热等功效，临床用于发热恶寒、寒热往来、潮热等症状。本处方以汤剂形式在临床上使用多年，疗效确切。以保证疗效、用药方便为前提，再结合液体制剂吸收度高、药效发挥迅速等特点[1]，将本处方开发成合剂。对处方中药材的药用成分的理化性质和药效作用进行综合分析并进行预试验后，选择以水为溶剂进行提取，以君药金银花主要药效成分绿原酸、臣药葛根主要药效成分葛根素及干膏收率为考察指标，采用正交试验优选提取工艺，为本制剂的开发研究提供工艺技术参数。
1 仪器与试药
HP1100 series高效液相色谱仪（G1322A在线真空脱气装置、G1311A四元梯度泵、G1313A标准自动进样器、G1316A柱温箱、G1315A DAD检测器、Chemstation工作站，美国惠普公司）；BP211D电子分析天平（十万分之一，德国Satoriüs公司）；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；RE-S2C型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）。甲醇和乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
金银花、葛根等药材由四川新荷花中药饮片股份有限公司提供，经成都中医药大学附属医院药剂科鉴定，均符合2010年版《中华人民共和国药典》（一部）及地方标准的规定；绿原酸对照品（批号110753-200413）、葛根素对照品（批号110752- 200712）均由中国药品生物制品检定所提供。
2 方法与结果
2.1 试验设计
根据预试验结果，以加水量（A）、提取时间（B）和提取次数（C）为考察因素，采用正交试验法，以绿原酸含量、葛根素含量和干膏收率为考察指标。根据因素水平表，按L9（34）正交表进
2.2 样品提取液的制备
按处方比例的2倍量称取9份混合药材，按拟定的正交试验方案进行试验，分别加入各自规定量的水，浸泡至透心后，按规定的提取时间和次数进行操作，过滤，合并滤液，滤液减压浓缩至500 mL，备用。
2.3 绿原酸含量测定
2.3.1 色谱条件 依利特C18色谱柱（Hypersil BDS，4.6 mm×150 mm，5 ?m）；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（10∶90）；流速：0.8 mL/min；检测波长：327 nm；柱温：30 ℃。理论塔板数按绿原酸计算应不低于1 000[2]。
2.3.2 对照品溶液制备 精密称取绿原酸对照品3.21 mg，置25 mL棕色量瓶中，加50%甲醇溶解并定容至刻度，制成绿原酸含量为0.128 4 mg/mL的对照品溶液。
2.3.3 供试品溶液制备 分别精密吸取“2.2”项下浓缩液各5 mL，置100 mL棕色量瓶中，用50%甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，用0.45 ?m微孔滤膜滤过，作为绿原酸供试品溶液。
2.3.4 线性关系考察 分别精密吸取绿原酸对照品溶液1、2、5、10、15、20 ?L注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定绿原酸峰面积，以峰面积为纵坐标、进样量为横坐标绘制标准曲线，计算得回归方程Y=1 873.2X-3.154 3，r=0.999 9，结果表明，绿原酸进样量在0.128 4～2.568 ?g范围内与峰面积呈良好的线性关系。
2.3.5 测定法 取上述对照品溶液和供试品溶液，精密吸取10 ?L注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录峰面积，采用外标一点法计算绿原酸含量。绿原酸对照品溶液和供试品溶液在色谱图相同保留时间处出现相应色谱峰，且分离度大于1.5，见图1。
2.4 葛根素含量测定
2.4.1 色谱条件 Boston ODS C18色谱柱（4.6 mm×250 mm， 5 ?m）；流动相：甲醇-水（27∶73）；流速：0.8 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：250 nm。理论塔板数不低于4 000[3]。
2.4.2 对照品溶液制备 精密称取葛根素对照品3.78 mg，加30%乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，制成葛根素含量为0.075 6 mg/mL的对照品溶液。
2.4.3 供试品溶液制备 分别精密量取“2.2”项下浓缩液5 mL，置50 mL量瓶中，加50%甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，用0.45 ?m微孔滤膜滤过，作为葛根素供试品溶液。
2.4.4 线性关系考察 精密称取葛根素对照品10.12 mg，置25 mL量瓶中，加30%乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，制成0.404 8 mg/mL的葛根素对照品溶液。分别精密吸取上述葛根素对照品溶液1、2、5、10、15、25 mL，置25 mL量瓶中，加30%乙醇稀释并定容至刻度，分别精密吸取5 ?L注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定葛根素峰面积，以峰面积为纵坐标、进样浓度（mg/mL）为横坐标绘制标准曲线，计算得回归方程Y=49 837X-63.91，r=0.999 9，结果表明，葛根素进样浓度在0.016 192～0.404 8 mg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。 2.4.5 测定法 取上述对照品溶液和供试品溶液，精密吸取5 ?L注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录峰面积，采用外标一点法计算葛根素含量。葛根素对照品溶液和供试品溶液在色谱图的相同保留时间处出现相应的色谱峰，且分离度大于1.5，见图2。
2.5 干膏收率
分别精密量取“2.2”项下浓缩液各20 mL，分别置于已干燥至恒重的蒸发皿中（设重量为M1），水浴蒸干，残渣于105 ℃烘箱中干燥3 h，取出，置干燥器中冷却30 min，迅速精密称重，记录重量（设恒重后蒸发皿重量为M2），计算干膏收率[4]。
2.6 结果与分析
以绿原酸含量、葛根素含量及干膏收率三者综合加权评分为指标，考察各因素对提取工艺的影响。综合评分=（绿原酸含量/绿原酸含量最大值）×35+（葛根素含量/葛根素含量最大值）×35+（干膏收率/干膏收率最大值）×30。正交试验结果见表2，方差分析见表3、表4。
由表2直观分析可知，影响提取效果的因素顺序为提取次数（C）>加水量（A）>提取时间（B），最佳提取工艺为A3B3C1。由表3和表4方差分析可知，提取次数（C）对提取效果有统计学意义，且影响极为显著，为主要因素；加水量（A）、提取时间（B）对提取效果的影响无统计学意义，为次要因素。直观分析、方差分析及生产实际情况综合考虑，将加水量调整为6倍节约成本，提取时间调整为1 h简化工艺。因此，最优提取工艺为A1B1C1，即6倍加水量，煎煮3次，每次煎煮1 h。
2.7 验证试验
为验证优选的提取工艺是否稳定、合理、可行，按上述最优提取工艺A1B1C1，按处方比例放大10倍，进行3批次重复提取试验，结果见表5。
由表5可知，3批样品绿原酸转移率为86.279 4%、平均含量为3.345 0%，葛根素转移率为86.567 3%、平均含量为0.255 6%，干膏平均收率为32.096 1%，且RSD均小于5.00%，表明该提取工艺稳定、合理、可行。
3 讨论
对金银花、竹叶柴胡药材进行绿原酸含量测定，竹叶柴胡中绿原酸含量为0.036 6%、金银花中绿原酸含量为3.878 7%；按处方比例计算，处方中竹叶柴胡所含绿原酸量仅为绿原酸总量的0.625 1%，因此，在计算绿原酸转移率时可忽略不计。
方中药材成分水溶性强，出膏率大，因而将干膏收率作为评价指标之一，并在综合加权评分时赋予干膏收率30%的比重；同时本指标的考察也为后期浓缩工艺和澄清工艺的研究提供试验依据。
采用单因素法考察了不同流速（0.8、1.0 mL/min）、柱温（25、30 ℃）及流动相[甲醇-水（27∶73）、甲醇-水（36∶64）]对葛根素含量测定的影响。其他条件相同，流速为0.8 mL/min时，对照品和样品的塔板数及分离度均高于流速为1.0 mL/min时；其他条件相同，柱温为30 ℃时，对照品和样品的主峰对称因子和塔板数高于柱温为25 ℃时；其他条件相同，流动相为甲醇-水（27∶73）时，样品主峰的对称因子较流动相为甲醇-水（36∶64）时高。最终选定流速0.8 mL/min、柱温30 ℃、流动相甲醇-水（27∶73）为葛根素含量测定条件。
参考文献：
[1] 张兆旺.中药药剂学[M].北京：中国中医药出版社，2003：184.
[2] 周海燕，李丹.高效液相色谱法测定清开灵注射液中绿原酸含量[J].中国药业，2011，20（1）：36.
[3] 徐强，章曙丹，冯瑛.HPLC测定糖肾颗粒中葛根素的含量[J].中成药， 2007，29（4）：621-623.
[4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：附录ⅩA.
（收稿日期：2012-05-24，编辑：陈静）
关键词：感甦合剂；提取工艺；绿原酸；葛根素；正交试验
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2012.10.017
中图分类号：R283.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）10-0043-03
“感甦”为成都中医药大学附属医院国医大师郭子光教授治疗外感发热的经典方，由金银花、葛根、竹叶柴胡、防风等8种药味组成，具有清热解毒、解表退热等功效，临床用于发热恶寒、寒热往来、潮热等症状。本处方以汤剂形式在临床上使用多年，疗效确切。以保证疗效、用药方便为前提，再结合液体制剂吸收度高、药效发挥迅速等特点[1]，将本处方开发成合剂。对处方中药材的药用成分的理化性质和药效作用进行综合分析并进行预试验后，选择以水为溶剂进行提取，以君药金银花主要药效成分绿原酸、臣药葛根主要药效成分葛根素及干膏收率为考察指标，采用正交试验优选提取工艺，为本制剂的开发研究提供工艺技术参数。
1 仪器与试药
HP1100 series高效液相色谱仪（G1322A在线真空脱气装置、G1311A四元梯度泵、G1313A标准自动进样器、G1316A柱温箱、G1315A DAD检测器、Chemstation工作站，美国惠普公司）；BP211D电子分析天平（十万分之一，德国Satoriüs公司）；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；RE-S2C型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）。甲醇和乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
金银花、葛根等药材由四川新荷花中药饮片股份有限公司提供，经成都中医药大学附属医院药剂科鉴定，均符合2010年版《中华人民共和国药典》（一部）及地方标准的规定；绿原酸对照品（批号110753-200413）、葛根素对照品（批号110752- 200712）均由中国药品生物制品检定所提供。
2 方法与结果
2.1 试验设计
根据预试验结果，以加水量（A）、提取时间（B）和提取次数（C）为考察因素，采用正交试验法，以绿原酸含量、葛根素含量和干膏收率为考察指标。根据因素水平表，按L9（34）正交表进
2.2 样品提取液的制备
按处方比例的2倍量称取9份混合药材，按拟定的正交试验方案进行试验，分别加入各自规定量的水，浸泡至透心后，按规定的提取时间和次数进行操作，过滤，合并滤液，滤液减压浓缩至500 mL，备用。
2.3 绿原酸含量测定
2.3.1 色谱条件 依利特C18色谱柱（Hypersil BDS，4.6 mm×150 mm，5 ?m）；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（10∶90）；流速：0.8 mL/min；检测波长：327 nm；柱温：30 ℃。理论塔板数按绿原酸计算应不低于1 000[2]。
2.3.2 对照品溶液制备 精密称取绿原酸对照品3.21 mg，置25 mL棕色量瓶中，加50%甲醇溶解并定容至刻度，制成绿原酸含量为0.128 4 mg/mL的对照品溶液。
2.3.3 供试品溶液制备 分别精密吸取“2.2”项下浓缩液各5 mL，置100 mL棕色量瓶中，用50%甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，用0.45 ?m微孔滤膜滤过，作为绿原酸供试品溶液。
2.3.4 线性关系考察 分别精密吸取绿原酸对照品溶液1、2、5、10、15、20 ?L注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定绿原酸峰面积，以峰面积为纵坐标、进样量为横坐标绘制标准曲线，计算得回归方程Y=1 873.2X-3.154 3，r=0.999 9，结果表明，绿原酸进样量在0.128 4～2.568 ?g范围内与峰面积呈良好的线性关系。
2.3.5 测定法 取上述对照品溶液和供试品溶液，精密吸取10 ?L注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录峰面积，采用外标一点法计算绿原酸含量。绿原酸对照品溶液和供试品溶液在色谱图相同保留时间处出现相应色谱峰，且分离度大于1.5，见图1。
2.4 葛根素含量测定
2.4.1 色谱条件 Boston ODS C18色谱柱（4.6 mm×250 mm， 5 ?m）；流动相：甲醇-水（27∶73）；流速：0.8 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：250 nm。理论塔板数不低于4 000[3]。
2.4.2 对照品溶液制备 精密称取葛根素对照品3.78 mg，加30%乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，制成葛根素含量为0.075 6 mg/mL的对照品溶液。
2.4.3 供试品溶液制备 分别精密量取“2.2”项下浓缩液5 mL，置50 mL量瓶中，加50%甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，用0.45 ?m微孔滤膜滤过，作为葛根素供试品溶液。
2.4.4 线性关系考察 精密称取葛根素对照品10.12 mg，置25 mL量瓶中，加30%乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，制成0.404 8 mg/mL的葛根素对照品溶液。分别精密吸取上述葛根素对照品溶液1、2、5、10、15、25 mL，置25 mL量瓶中，加30%乙醇稀释并定容至刻度，分别精密吸取5 ?L注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定葛根素峰面积，以峰面积为纵坐标、进样浓度（mg/mL）为横坐标绘制标准曲线，计算得回归方程Y=49 837X-63.91，r=0.999 9，结果表明，葛根素进样浓度在0.016 192～0.404 8 mg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。 2.4.5 测定法 取上述对照品溶液和供试品溶液，精密吸取5 ?L注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录峰面积，采用外标一点法计算葛根素含量。葛根素对照品溶液和供试品溶液在色谱图的相同保留时间处出现相应的色谱峰，且分离度大于1.5，见图2。
2.5 干膏收率
分别精密量取“2.2”项下浓缩液各20 mL，分别置于已干燥至恒重的蒸发皿中（设重量为M1），水浴蒸干，残渣于105 ℃烘箱中干燥3 h，取出，置干燥器中冷却30 min，迅速精密称重，记录重量（设恒重后蒸发皿重量为M2），计算干膏收率[4]。
2.6 结果与分析
以绿原酸含量、葛根素含量及干膏收率三者综合加权评分为指标，考察各因素对提取工艺的影响。综合评分=（绿原酸含量/绿原酸含量最大值）×35+（葛根素含量/葛根素含量最大值）×35+（干膏收率/干膏收率最大值）×30。正交试验结果见表2，方差分析见表3、表4。
由表2直观分析可知，影响提取效果的因素顺序为提取次数（C）>加水量（A）>提取时间（B），最佳提取工艺为A3B3C1。由表3和表4方差分析可知，提取次数（C）对提取效果有统计学意义，且影响极为显著，为主要因素；加水量（A）、提取时间（B）对提取效果的影响无统计学意义，为次要因素。直观分析、方差分析及生产实际情况综合考虑，将加水量调整为6倍节约成本，提取时间调整为1 h简化工艺。因此，最优提取工艺为A1B1C1，即6倍加水量，煎煮3次，每次煎煮1 h。
2.7 验证试验
为验证优选的提取工艺是否稳定、合理、可行，按上述最优提取工艺A1B1C1，按处方比例放大10倍，进行3批次重复提取试验，结果见表5。
由表5可知，3批样品绿原酸转移率为86.279 4%、平均含量为3.345 0%，葛根素转移率为86.567 3%、平均含量为0.255 6%，干膏平均收率为32.096 1%，且RSD均小于5.00%，表明该提取工艺稳定、合理、可行。
3 讨论
对金银花、竹叶柴胡药材进行绿原酸含量测定，竹叶柴胡中绿原酸含量为0.036 6%、金银花中绿原酸含量为3.878 7%；按处方比例计算，处方中竹叶柴胡所含绿原酸量仅为绿原酸总量的0.625 1%，因此，在计算绿原酸转移率时可忽略不计。
方中药材成分水溶性强，出膏率大，因而将干膏收率作为评价指标之一，并在综合加权评分时赋予干膏收率30%的比重；同时本指标的考察也为后期浓缩工艺和澄清工艺的研究提供试验依据。
采用单因素法考察了不同流速（0.8、1.0 mL/min）、柱温（25、30 ℃）及流动相[甲醇-水（27∶73）、甲醇-水（36∶64）]对葛根素含量测定的影响。其他条件相同，流速为0.8 mL/min时，对照品和样品的塔板数及分离度均高于流速为1.0 mL/min时；其他条件相同，柱温为30 ℃时，对照品和样品的主峰对称因子和塔板数高于柱温为25 ℃时；其他条件相同，流动相为甲醇-水（27∶73）时，样品主峰的对称因子较流动相为甲醇-水（36∶64）时高。最终选定流速0.8 mL/min、柱温30 ℃、流动相甲醇-水（27∶73）为葛根素含量测定条件。
参考文献：
[1] 张兆旺.中药药剂学[M].北京：中国中医药出版社，2003：184.
[2] 周海燕，李丹.高效液相色谱法测定清开灵注射液中绿原酸含量[J].中国药业，2011，20（1）：36.
[3] 徐强，章曙丹，冯瑛.HPLC测定糖肾颗粒中葛根素的含量[J].中成药， 2007，29（4）：621-623.
[4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：附录ⅩA.
（收稿日期：2012-05-24，编辑：陈静）