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【摘要】 目的 检测含钛合金和钴铬合金烤瓷熔附金属全冠(PFM)修复前后犬龈沟液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)的表达,观察两种非贵金属烤瓷合金的生物学性能。方法 将6只犬随机分为两组,分别行含钛合金和钴铬合金PFM修复,分别于修复前、修复后1、2、3个月采集龈沟液,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测其TNF-α和IL-6的表达。结果 含钛合金修复后1、3个月,TNF-α的表达有所增加(P<0.05)。钴铬合金修复前后,TNF-α的表达无明显改变(P>0.05)。两组修复前后IL-6的表达均无明显改变(P>0.05)。结论 含钛合金较钴铬合金更容易导致牙周组织的炎性改变。
【关键词】 烤瓷熔附金属全冠;肿瘤坏死因子-α;白细胞介素-6
文章编号:1004-7484(2013)-10-5511-02
烤瓷熔附金属全冠(Porcelain fused to metal,PFM)是一种比较理想的修复体,兼有瓷全冠的美观和金属全冠的强度[1],近年来已广泛应用于临床。在口腔环境中,烤瓷合金会析出金属离子,刺激牙周组织;不同合金由于成分及金相不同,对牙周组织的影响存在较大差异。以往对于烤瓷合金的研究多集中在贵金属合金和非贵金属合金之间,而非贵金属合金之间的比较则报道较少。含钛合金和钴铬合金是目前临床常用的非贵金属烤瓷合金材料,本文旨在探讨两种合金材料PFM修复对牙周组织的影响。通过观察龈沟液(gingival crevical fluid,GCF)中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的表达,评估含钛合金和钴铬合金的生物学性能。
1 资料与方法
1.1 实验动物分组 成年健康本地杂种犬6只(均为雄性,体重12-14kg,由遵义医学院动物实验中心提供。实验过程中对动物的处置符合伦理学要求[2]),随机分为A、B两组,按部位记录法将每只犬的牙弓分为四个区,以每只犬B区侧切牙、尖牙及D区尖牙为实验对象,每组9颗牙,并从实验牙对侧同名牙中随机抽出9颗牙成为C组。即A组:含钛合金组,B组:钴铬合金组,C组:空白对照组。
1.2 建立PFM修复模型
1.2.1 犬齿龈上洁治、龈下刮治。
1.2.2 牙体预备 洁治3周后取犬牙列原始模型于加工烤瓷牙时对照,然后按要求备牙:牙合面预备2mm,轴面预备1.5mm,肩台宽1.0mm,颈缘位于龈下0.5mm。
1.2.3 制取模型,送义齿加工中心制作烤瓷牙。
1.2.4 试戴、粘固烤瓷全冠。
1.3 样本采集与检测
1.3.1 分别于修复前、修复后1个月、2个月和3个月采集龈沟液 将WhatmanⅢ号滤纸裁成2mm宽,15mm长的纸条,待犬全麻后即刻采集,用镊子持滤纸条沿实验牙颊侧龈向轻轻放入龈沟内至有轻微阻力,经30秒后取出(如有血迹则弃之重取),放入0.5mlEP管中并加入250μl生理盐水。37℃恒温摇床中每3秒摇动1次,60分钟后去除滤纸条,作好标记,-70℃低温冰箱保存。
1.3.2 采用双抗体夹心ELISA法检测TNF-α和IL-6的浓度 ①实验前30min取出冻存的GCF样本,平衡至室温。②向标准品中加入0.5ml蒸馏水并混均,配制成20ng/ml的溶液,设立标准管8管,第1管加入标本稀释液900μl,其余各管加入标本稀释液500μl,然后依次进行对倍稀释,第8管为空白对照。③加样:加入100μl标准品、100μl待测样品于相应酶标板孔中,每个样品设2个平行孔。将反应板充分混匀后置37℃120min。④洗板:甩尽板内液体,用洗涤液洗涤反应板(每孔内加入350μl洗涤液),并去除水滴(在厚叠吸水纸上拍干),反复洗涤5次。⑤每孔中加入第一抗体工作液100μl。将反应板充分混匀后置37℃60min。⑥洗板:同步骤④。⑦每孔加酶标抗体工作液100μl,将反应板置37℃60min。洗板。⑧每孔加入底物工作液100μl,置37℃暗处反应15min。每孔加入100μl终止液,混匀。⑨30min内用酶标仪在450nm处测吸光值,每样品取3孔平均值。以OD值为纵坐标、以标准品浓度为横坐标,绘制标准曲线,并根据样品的OD值计算出样品的相应浓度。
1.4 统计学处理 数据以均数±标准差(χ±s)来表示,采用单因素方差分析(one-way analysis of variance,one-way ANOVA)进行统计学处理,检验水准α=0.05;所有统计均应用分析软件SPSS13.0完成。
2 结 果
2.1 PFM修复前后各组龈沟液中TNF-α的表达 修复后1个月,含钛合金烤瓷全冠组GCF中TNF-α的表达量与对照组相比有所增高(P<0.05),钴铬合金烤瓷全冠组GCF中TNF-α的表达量与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。修复后2个月,两组GCF中TNF-α的表达量与对照组相比差异均无统计学意义(P>0.05)。修复后3个月,含钛合金烤瓷全冠组GCF中TNF-α的表达量与对照组相比有所增高(P<0.05),钴铬合金烤瓷全冠组GCF中TNF-α的表达量与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05),见表1。
3 讨 论
金属烤瓷修复体与牙周组织关系密切,它们相互依赖、相互作用。传统的检测牙周组织健康状况的方法,主要是依赖一些临床参数,如探诊深度、牙龈指数等。这些参数只能描述牙周组织改变的结果,而不能反映牙周组织目前的活动状态和未来的活动。龈沟是游离龈与牙面之间形成的间隙,其内有龈沟液(GCF)存在,牙周炎症时GCF的量会明显增加[3]。观察和研究GCF的成份及含量既简便又无创,且可重复操作,是临床检测PFM修复后牙周组织损伤状况的一种新方向,具有广阔的应用前景。研究发现GCF内含有多种化学物质,其中TNF-α和IL-6是两种与牙周生物学相关的重要细胞因子。TNF-α是由激活单核/巨噬细胞、脂肪细胞、NK细胞、B细胞等产生的一种具有多种生物活性的因子,离体激活体实验显示,TNF-α能激发骨吸收,抑制骨形成,刺激产生蛋白酶和前列腺素[4]。TNF-α被认为是介导炎症前细胞因子的代表,是一种很有前瞻性的探查牙周炎症和宿主反应的指标,其含量变化可提示牙周炎症的早期变化。Mutsumi等[5]研究指出,TNF-α能刺激宿主细胞产生白细胞介素-8和单核细胞趋化蛋白,激活炎症应答。IL-6是一种多功能细胞因子,是肝脏合成CRP的主要诱导者,可聚集炎性细胞、活化并促进炎性介质的释放;激活中性粒细胞,加重牙周炎性反应[6]。吴亚菲等[7]研究发现,在牙龈炎症的早期,IL-6的表达并不会大幅增加,而在牙周炎患者的GCF中,IL-6的含量随着附着丧失和牙周袋深度的增加而显著增加,与牙龈炎症的程度无明显关系;并认为IL-6的表达水平是判断牙周病变严重程度的重要指征。 本实验以犬为研究对象,按统一标准行PFM修复,避免了临床患者个体差异大、修复后回访率过低等问题。研究显示:含钛合金修复后1、3个月,TNF-α的表达有所增加(P<0.05),牙周组织炎性改变增强。钴铬合金修复前后,TNF-α的表达无明显改变(P>0.05)。两组修复前后IL-6的表达均无明显改变(P>0.05),两种合金均没有造成严重牙周损害的倾向。提示含钛合金较钴铬合金更容易引起牙周组织的炎性改变,其生物学性能较差。对于含钛合金组TNF-α的表达呈先升高后降低最后再次升高的波动,可能的原因是合金表面钝化膜的形成。研究显示,当合金表面逐渐钝化,生成的钝化膜对材料起到保护作用,合金的腐蚀速度减慢[8]。修复后2个月,由于钝化膜的形成,金属离子的析出减少,牙周组织的炎性改变减弱;但由于析出的金属离子总量在不断增加,修复后3个月,牙周组织的炎性改变再次增强。
参考文献
[1] 赵铱民,陈吉华.口腔修复学[M].第7版.北京,人民卫生出版社,2012:76.
[2] 中华人民共和国科学技术部,关于善待实验动物的指导性意见,2006-09-30.
[3] Msanori Nishikawa,Yoshinori Yanaguchi,Kazusada Yoshitake,et al.Effects of TNF and prostaglandin E2 on the expression of MMPs in human periodontal ligament fibroblasts[J].Journal of Periodontal Research,2002,37:167-176.
[4] Jansson H,Lindholm E,Lindh C,et al.Type 2 diabetes and risk for periodontal disease:a role for dental health awareness[J].J Clin Periodontal,2006,33:408-414.
[5] Mutsumi M,Sato S,Kitagawa S,et a1.Cytokine expression in rat molar gingival periodontal tissues after topical application of lipopolysaccharide[J].Histochem Cell Biol,2001,116(1):57-62.
[6] Wypasek E,Undas A,Sniezek-Maciejewska M,et al.The increased plasma C-reactive protein and interleukin-6 levels in patients undergoing coronary artery bypass grafting surgery are associated with the interleukin-6-174G>C gene polymorphism[J].Ann Clin Biochem,2010,47(4):343-349.
[7] 吴亚菲,赵川江,张静仪,等.牙龈沟液中白介素-6含量与牙周炎关系的研究[J].华西医大学报,2000,31:49-496.
[8] MatkoviT,MatkoviP,Malina J.Effects of Ni and Mo on the microstructure and some other properties of Co-Cr dental alloys[J].J Alloys Compounds,2004,366(1-2):293.
【关键词】 烤瓷熔附金属全冠;肿瘤坏死因子-α;白细胞介素-6
文章编号:1004-7484(2013)-10-5511-02
烤瓷熔附金属全冠(Porcelain fused to metal,PFM)是一种比较理想的修复体,兼有瓷全冠的美观和金属全冠的强度[1],近年来已广泛应用于临床。在口腔环境中,烤瓷合金会析出金属离子,刺激牙周组织;不同合金由于成分及金相不同,对牙周组织的影响存在较大差异。以往对于烤瓷合金的研究多集中在贵金属合金和非贵金属合金之间,而非贵金属合金之间的比较则报道较少。含钛合金和钴铬合金是目前临床常用的非贵金属烤瓷合金材料,本文旨在探讨两种合金材料PFM修复对牙周组织的影响。通过观察龈沟液(gingival crevical fluid,GCF)中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的表达,评估含钛合金和钴铬合金的生物学性能。
1 资料与方法
1.1 实验动物分组 成年健康本地杂种犬6只(均为雄性,体重12-14kg,由遵义医学院动物实验中心提供。实验过程中对动物的处置符合伦理学要求[2]),随机分为A、B两组,按部位记录法将每只犬的牙弓分为四个区,以每只犬B区侧切牙、尖牙及D区尖牙为实验对象,每组9颗牙,并从实验牙对侧同名牙中随机抽出9颗牙成为C组。即A组:含钛合金组,B组:钴铬合金组,C组:空白对照组。
1.2 建立PFM修复模型
1.2.1 犬齿龈上洁治、龈下刮治。
1.2.2 牙体预备 洁治3周后取犬牙列原始模型于加工烤瓷牙时对照,然后按要求备牙:牙合面预备2mm,轴面预备1.5mm,肩台宽1.0mm,颈缘位于龈下0.5mm。
1.2.3 制取模型,送义齿加工中心制作烤瓷牙。
1.2.4 试戴、粘固烤瓷全冠。
1.3 样本采集与检测
1.3.1 分别于修复前、修复后1个月、2个月和3个月采集龈沟液 将WhatmanⅢ号滤纸裁成2mm宽,15mm长的纸条,待犬全麻后即刻采集,用镊子持滤纸条沿实验牙颊侧龈向轻轻放入龈沟内至有轻微阻力,经30秒后取出(如有血迹则弃之重取),放入0.5mlEP管中并加入250μl生理盐水。37℃恒温摇床中每3秒摇动1次,60分钟后去除滤纸条,作好标记,-70℃低温冰箱保存。
1.3.2 采用双抗体夹心ELISA法检测TNF-α和IL-6的浓度 ①实验前30min取出冻存的GCF样本,平衡至室温。②向标准品中加入0.5ml蒸馏水并混均,配制成20ng/ml的溶液,设立标准管8管,第1管加入标本稀释液900μl,其余各管加入标本稀释液500μl,然后依次进行对倍稀释,第8管为空白对照。③加样:加入100μl标准品、100μl待测样品于相应酶标板孔中,每个样品设2个平行孔。将反应板充分混匀后置37℃120min。④洗板:甩尽板内液体,用洗涤液洗涤反应板(每孔内加入350μl洗涤液),并去除水滴(在厚叠吸水纸上拍干),反复洗涤5次。⑤每孔中加入第一抗体工作液100μl。将反应板充分混匀后置37℃60min。⑥洗板:同步骤④。⑦每孔加酶标抗体工作液100μl,将反应板置37℃60min。洗板。⑧每孔加入底物工作液100μl,置37℃暗处反应15min。每孔加入100μl终止液,混匀。⑨30min内用酶标仪在450nm处测吸光值,每样品取3孔平均值。以OD值为纵坐标、以标准品浓度为横坐标,绘制标准曲线,并根据样品的OD值计算出样品的相应浓度。
1.4 统计学处理 数据以均数±标准差(χ±s)来表示,采用单因素方差分析(one-way analysis of variance,one-way ANOVA)进行统计学处理,检验水准α=0.05;所有统计均应用分析软件SPSS13.0完成。
2 结 果
2.1 PFM修复前后各组龈沟液中TNF-α的表达 修复后1个月,含钛合金烤瓷全冠组GCF中TNF-α的表达量与对照组相比有所增高(P<0.05),钴铬合金烤瓷全冠组GCF中TNF-α的表达量与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。修复后2个月,两组GCF中TNF-α的表达量与对照组相比差异均无统计学意义(P>0.05)。修复后3个月,含钛合金烤瓷全冠组GCF中TNF-α的表达量与对照组相比有所增高(P<0.05),钴铬合金烤瓷全冠组GCF中TNF-α的表达量与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05),见表1。
3 讨 论
金属烤瓷修复体与牙周组织关系密切,它们相互依赖、相互作用。传统的检测牙周组织健康状况的方法,主要是依赖一些临床参数,如探诊深度、牙龈指数等。这些参数只能描述牙周组织改变的结果,而不能反映牙周组织目前的活动状态和未来的活动。龈沟是游离龈与牙面之间形成的间隙,其内有龈沟液(GCF)存在,牙周炎症时GCF的量会明显增加[3]。观察和研究GCF的成份及含量既简便又无创,且可重复操作,是临床检测PFM修复后牙周组织损伤状况的一种新方向,具有广阔的应用前景。研究发现GCF内含有多种化学物质,其中TNF-α和IL-6是两种与牙周生物学相关的重要细胞因子。TNF-α是由激活单核/巨噬细胞、脂肪细胞、NK细胞、B细胞等产生的一种具有多种生物活性的因子,离体激活体实验显示,TNF-α能激发骨吸收,抑制骨形成,刺激产生蛋白酶和前列腺素[4]。TNF-α被认为是介导炎症前细胞因子的代表,是一种很有前瞻性的探查牙周炎症和宿主反应的指标,其含量变化可提示牙周炎症的早期变化。Mutsumi等[5]研究指出,TNF-α能刺激宿主细胞产生白细胞介素-8和单核细胞趋化蛋白,激活炎症应答。IL-6是一种多功能细胞因子,是肝脏合成CRP的主要诱导者,可聚集炎性细胞、活化并促进炎性介质的释放;激活中性粒细胞,加重牙周炎性反应[6]。吴亚菲等[7]研究发现,在牙龈炎症的早期,IL-6的表达并不会大幅增加,而在牙周炎患者的GCF中,IL-6的含量随着附着丧失和牙周袋深度的增加而显著增加,与牙龈炎症的程度无明显关系;并认为IL-6的表达水平是判断牙周病变严重程度的重要指征。 本实验以犬为研究对象,按统一标准行PFM修复,避免了临床患者个体差异大、修复后回访率过低等问题。研究显示:含钛合金修复后1、3个月,TNF-α的表达有所增加(P<0.05),牙周组织炎性改变增强。钴铬合金修复前后,TNF-α的表达无明显改变(P>0.05)。两组修复前后IL-6的表达均无明显改变(P>0.05),两种合金均没有造成严重牙周损害的倾向。提示含钛合金较钴铬合金更容易引起牙周组织的炎性改变,其生物学性能较差。对于含钛合金组TNF-α的表达呈先升高后降低最后再次升高的波动,可能的原因是合金表面钝化膜的形成。研究显示,当合金表面逐渐钝化,生成的钝化膜对材料起到保护作用,合金的腐蚀速度减慢[8]。修复后2个月,由于钝化膜的形成,金属离子的析出减少,牙周组织的炎性改变减弱;但由于析出的金属离子总量在不断增加,修复后3个月,牙周组织的炎性改变再次增强。
参考文献
[1] 赵铱民,陈吉华.口腔修复学[M].第7版.北京,人民卫生出版社,2012:76.
[2] 中华人民共和国科学技术部,关于善待实验动物的指导性意见,2006-09-30.
[3] Msanori Nishikawa,Yoshinori Yanaguchi,Kazusada Yoshitake,et al.Effects of TNF and prostaglandin E2 on the expression of MMPs in human periodontal ligament fibroblasts[J].Journal of Periodontal Research,2002,37:167-176.
[4] Jansson H,Lindholm E,Lindh C,et al.Type 2 diabetes and risk for periodontal disease:a role for dental health awareness[J].J Clin Periodontal,2006,33:408-414.
[5] Mutsumi M,Sato S,Kitagawa S,et a1.Cytokine expression in rat molar gingival periodontal tissues after topical application of lipopolysaccharide[J].Histochem Cell Biol,2001,116(1):57-62.
[6] Wypasek E,Undas A,Sniezek-Maciejewska M,et al.The increased plasma C-reactive protein and interleukin-6 levels in patients undergoing coronary artery bypass grafting surgery are associated with the interleukin-6-174G>C gene polymorphism[J].Ann Clin Biochem,2010,47(4):343-349.
[7] 吴亚菲,赵川江,张静仪,等.牙龈沟液中白介素-6含量与牙周炎关系的研究[J].华西医大学报,2000,31:49-496.
[8] MatkoviT,MatkoviP,Malina J.Effects of Ni and Mo on the microstructure and some other properties of Co-Cr dental alloys[J].J Alloys Compounds,2004,366(1-2):293.