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【摘要】 目的 检测含钛合金和钴铬合金烤瓷熔附金属全冠（PFM）修复前后犬龈沟液中肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素6（IL-6）的表达，观察两种非贵金属烤瓷合金的生物学性能。方法 将6只犬随机分为两组，分别行含钛合金和钴铬合金PFM修复，分别于修复前、修复后1、2、3个月采集龈沟液，用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测其TNF-α和IL-6的表达。结果 含钛合金修复后1、3个月，TNF-α的表达有所增加（P<0.05）。钴铬合金修复前后，TNF-α的表达无明显改变（P>0.05）。两组修复前后IL-6的表达均无明显改变（P>0.05）。结论 含钛合金较钴铬合金更容易导致牙周组织的炎性改变。
【关键词】 烤瓷熔附金属全冠；肿瘤坏死因子-α；白细胞介素-6
文章编号：1004-7484（2013）-10-5511-02
烤瓷熔附金属全冠（Porcelain fused to metal，PFM）是一种比较理想的修复体，兼有瓷全冠的美观和金属全冠的强度[1]，近年来已广泛应用于临床。在口腔环境中，烤瓷合金会析出金属离子，刺激牙周组织；不同合金由于成分及金相不同，对牙周组织的影响存在较大差异。以往对于烤瓷合金的研究多集中在贵金属合金和非贵金属合金之间，而非贵金属合金之间的比较则报道较少。含钛合金和钴铬合金是目前临床常用的非贵金属烤瓷合金材料，本文旨在探讨两种合金材料PFM修复对牙周组织的影响。通过观察龈沟液（gingival crevical fluid，GCF）中肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）的表达，评估含钛合金和钴铬合金的生物学性能。
1 资料与方法
1.1 实验动物分组 成年健康本地杂种犬6只（均为雄性，体重12-14kg，由遵义医学院动物实验中心提供。实验过程中对动物的处置符合伦理学要求[2]），随机分为A、B两组，按部位记录法将每只犬的牙弓分为四个区，以每只犬B区侧切牙、尖牙及D区尖牙为实验对象，每组9颗牙，并从实验牙对侧同名牙中随机抽出9颗牙成为C组。即A组：含钛合金组，B组：钴铬合金组，C组：空白对照组。
1.2 建立PFM修复模型
1.2.1 犬齿龈上洁治、龈下刮治。
1.2.2 牙体预备 洁治3周后取犬牙列原始模型于加工烤瓷牙时对照，然后按要求备牙：牙合面预备2mm，轴面预备1.5mm，肩台宽1.0mm，颈缘位于龈下0.5mm。
1.2.3 制取模型，送义齿加工中心制作烤瓷牙。
1.2.4 试戴、粘固烤瓷全冠。
1.3 样本采集与检测
1.3.1 分别于修复前、修复后1个月、2个月和3个月采集龈沟液 将WhatmanⅢ号滤纸裁成2mm宽，15mm长的纸条，待犬全麻后即刻采集，用镊子持滤纸条沿实验牙颊侧龈向轻轻放入龈沟内至有轻微阻力，经30秒后取出（如有血迹则弃之重取），放入0.5mlEP管中并加入250μl生理盐水。37℃恒温摇床中每3秒摇动1次，60分钟后去除滤纸条，作好标记，-70℃低温冰箱保存。
1.3.2 采用双抗体夹心ELISA法检测TNF-α和IL-6的浓度 ①实验前30min取出冻存的GCF样本，平衡至室温。②向标准品中加入0.5ml蒸馏水并混均，配制成20ng/ml的溶液，设立标准管8管，第1管加入标本稀释液900μl，其余各管加入标本稀释液500μl，然后依次进行对倍稀释，第8管为空白对照。③加样：加入100μl标准品、100μl待测样品于相应酶标板孔中，每个样品设2个平行孔。将反应板充分混匀后置37℃120min。④洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板（每孔内加入350μl洗涤液），并去除水滴（在厚叠吸水纸上拍干），反复洗涤5次。⑤每孔中加入第一抗体工作液100μl。将反应板充分混匀后置37℃60min。⑥洗板：同步骤④。⑦每孔加酶标抗体工作液100μl，将反应板置37℃60min。洗板。⑧每孔加入底物工作液100μl，置37℃暗处反应15min。每孔加入100μl终止液，混匀。⑨30min内用酶标仪在450nm处测吸光值，每样品取3孔平均值。以OD值为纵坐标、以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线，并根据样品的OD值计算出样品的相应浓度。
1.4 统计学处理 数据以均数±标准差（χ±s）来表示，采用单因素方差分析（one-way analysis of variance，one-way ANOVA）进行统计学处理，检验水准α=0.05；所有统计均应用分析软件SPSS13.0完成。
2 结 果
2.1 PFM修复前后各组龈沟液中TNF-α的表达 修复后1个月，含钛合金烤瓷全冠组GCF中TNF-α的表达量与对照组相比有所增高（P<0.05），钴铬合金烤瓷全冠组GCF中TNF-α的表达量与对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）。修复后2个月，两组GCF中TNF-α的表达量与对照组相比差异均无统计学意义（P>0.05）。修复后3个月，含钛合金烤瓷全冠组GCF中TNF-α的表达量与对照组相比有所增高（P<0.05），钴铬合金烤瓷全冠组GCF中TNF-α的表达量与对照组相比差异无统计学意义（P>0.05），见表1。
3 讨 论
金属烤瓷修复体与牙周组织关系密切，它们相互依赖、相互作用。传统的检测牙周组织健康状况的方法，主要是依赖一些临床参数，如探诊深度、牙龈指数等。这些参数只能描述牙周组织改变的结果，而不能反映牙周组织目前的活动状态和未来的活动。龈沟是游离龈与牙面之间形成的间隙，其内有龈沟液（GCF）存在，牙周炎症时GCF的量会明显增加[3]。观察和研究GCF的成份及含量既简便又无创，且可重复操作，是临床检测PFM修复后牙周组织损伤状况的一种新方向，具有广阔的应用前景。研究发现GCF内含有多种化学物质，其中TNF-α和IL-6是两种与牙周生物学相关的重要细胞因子。TNF-α是由激活单核/巨噬细胞、脂肪细胞、NK细胞、B细胞等产生的一种具有多种生物活性的因子，离体激活体实验显示，TNF-α能激发骨吸收，抑制骨形成，刺激产生蛋白酶和前列腺素[4]。TNF-α被认为是介导炎症前细胞因子的代表，是一种很有前瞻性的探查牙周炎症和宿主反应的指标，其含量变化可提示牙周炎症的早期变化。Mutsumi等[5]研究指出，TNF-α能刺激宿主细胞产生白细胞介素-8和单核细胞趋化蛋白，激活炎症应答。IL-6是一种多功能细胞因子，是肝脏合成CRP的主要诱导者，可聚集炎性细胞、活化并促进炎性介质的释放；激活中性粒细胞，加重牙周炎性反应[6]。吴亚菲等[7]研究发现，在牙龈炎症的早期，IL-6的表达并不会大幅增加，而在牙周炎患者的GCF中，IL-6的含量随着附着丧失和牙周袋深度的增加而显著增加，与牙龈炎症的程度无明显关系；并认为IL-6的表达水平是判断牙周病变严重程度的重要指征。 本实验以犬为研究对象，按统一标准行PFM修复，避免了临床患者个体差异大、修复后回访率过低等问题。研究显示：含钛合金修复后1、3个月，TNF-α的表达有所增加（P<0.05），牙周组织炎性改变增强。钴铬合金修复前后，TNF-α的表达无明显改变（P>0.05）。两组修复前后IL-6的表达均无明显改变（P>0.05），两种合金均没有造成严重牙周损害的倾向。提示含钛合金较钴铬合金更容易引起牙周组织的炎性改变，其生物学性能较差。对于含钛合金组TNF-α的表达呈先升高后降低最后再次升高的波动，可能的原因是合金表面钝化膜的形成。研究显示，当合金表面逐渐钝化，生成的钝化膜对材料起到保护作用，合金的腐蚀速度减慢[8]。修复后2个月，由于钝化膜的形成，金属离子的析出减少，牙周组织的炎性改变减弱；但由于析出的金属离子总量在不断增加，修复后3个月，牙周组织的炎性改变再次增强。
参考文献
[1] 赵铱民，陈吉华.口腔修复学[M].第7版.北京，人民卫生出版社，2012：76.
[2] 中华人民共和国科学技术部，关于善待实验动物的指导性意见，2006-09-30.
[3] Msanori Nishikawa，Yoshinori Yanaguchi，Kazusada Yoshitake，et al.Effects of TNF and prostaglandin E2 on the expression of MMPs in human periodontal ligament fibroblasts[J].Journal of Periodontal Research，2002，37：167-176.
[4] Jansson H，Lindholm E，Lindh C，et al.Type 2 diabetes and risk for periodontal disease：a role for dental health awareness[J].J Clin Periodontal，2006，33：408-414.
[5] Mutsumi M，Sato S，Kitagawa S，et a1.Cytokine expression in rat molar gingival periodontal tissues after topical application of lipopolysaccharide[J].Histochem Cell Biol，2001，116（1）：57-62.
[6] Wypasek E，Undas A，Sniezek-Maciejewska M，et al.The increased plasma C-reactive protein and interleukin-6 levels in patients undergoing coronary artery bypass grafting surgery are associated with the interleukin-6-174G>C gene polymorphism[J].Ann Clin Biochem，2010，47（4）：343-349.
[7] 吴亚菲，赵川江，张静仪，等.牙龈沟液中白介素-6含量与牙周炎关系的研究[J].华西医大学报，2000，31：49-496.
[8] MatkoviT，MatkoviP，Malina J.Effects of Ni and Mo on the microstructure and some other properties of Co-Cr dental alloys[J].J Alloys Compounds，2004，366（1-2）：293.
【关键词】 烤瓷熔附金属全冠；肿瘤坏死因子-α；白细胞介素-6
文章编号：1004-7484（2013）-10-5511-02
烤瓷熔附金属全冠（Porcelain fused to metal，PFM）是一种比较理想的修复体，兼有瓷全冠的美观和金属全冠的强度[1]，近年来已广泛应用于临床。在口腔环境中，烤瓷合金会析出金属离子，刺激牙周组织；不同合金由于成分及金相不同，对牙周组织的影响存在较大差异。以往对于烤瓷合金的研究多集中在贵金属合金和非贵金属合金之间，而非贵金属合金之间的比较则报道较少。含钛合金和钴铬合金是目前临床常用的非贵金属烤瓷合金材料，本文旨在探讨两种合金材料PFM修复对牙周组织的影响。通过观察龈沟液（gingival crevical fluid，GCF）中肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）的表达，评估含钛合金和钴铬合金的生物学性能。
1 资料与方法
1.1 实验动物分组 成年健康本地杂种犬6只（均为雄性，体重12-14kg，由遵义医学院动物实验中心提供。实验过程中对动物的处置符合伦理学要求[2]），随机分为A、B两组，按部位记录法将每只犬的牙弓分为四个区，以每只犬B区侧切牙、尖牙及D区尖牙为实验对象，每组9颗牙，并从实验牙对侧同名牙中随机抽出9颗牙成为C组。即A组：含钛合金组，B组：钴铬合金组，C组：空白对照组。
1.2 建立PFM修复模型
1.2.1 犬齿龈上洁治、龈下刮治。
1.2.2 牙体预备 洁治3周后取犬牙列原始模型于加工烤瓷牙时对照，然后按要求备牙：牙合面预备2mm，轴面预备1.5mm，肩台宽1.0mm，颈缘位于龈下0.5mm。
1.2.3 制取模型，送义齿加工中心制作烤瓷牙。
1.2.4 试戴、粘固烤瓷全冠。
1.3 样本采集与检测
1.3.1 分别于修复前、修复后1个月、2个月和3个月采集龈沟液 将WhatmanⅢ号滤纸裁成2mm宽，15mm长的纸条，待犬全麻后即刻采集，用镊子持滤纸条沿实验牙颊侧龈向轻轻放入龈沟内至有轻微阻力，经30秒后取出（如有血迹则弃之重取），放入0.5mlEP管中并加入250μl生理盐水。37℃恒温摇床中每3秒摇动1次，60分钟后去除滤纸条，作好标记，-70℃低温冰箱保存。
1.3.2 采用双抗体夹心ELISA法检测TNF-α和IL-6的浓度 ①实验前30min取出冻存的GCF样本，平衡至室温。②向标准品中加入0.5ml蒸馏水并混均，配制成20ng/ml的溶液，设立标准管8管，第1管加入标本稀释液900μl，其余各管加入标本稀释液500μl，然后依次进行对倍稀释，第8管为空白对照。③加样：加入100μl标准品、100μl待测样品于相应酶标板孔中，每个样品设2个平行孔。将反应板充分混匀后置37℃120min。④洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板（每孔内加入350μl洗涤液），并去除水滴（在厚叠吸水纸上拍干），反复洗涤5次。⑤每孔中加入第一抗体工作液100μl。将反应板充分混匀后置37℃60min。⑥洗板：同步骤④。⑦每孔加酶标抗体工作液100μl，将反应板置37℃60min。洗板。⑧每孔加入底物工作液100μl，置37℃暗处反应15min。每孔加入100μl终止液，混匀。⑨30min内用酶标仪在450nm处测吸光值，每样品取3孔平均值。以OD值为纵坐标、以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线，并根据样品的OD值计算出样品的相应浓度。
1.4 统计学处理 数据以均数±标准差（χ±s）来表示，采用单因素方差分析（one-way analysis of variance，one-way ANOVA）进行统计学处理，检验水准α=0.05；所有统计均应用分析软件SPSS13.0完成。
2 结 果
2.1 PFM修复前后各组龈沟液中TNF-α的表达 修复后1个月，含钛合金烤瓷全冠组GCF中TNF-α的表达量与对照组相比有所增高（P<0.05），钴铬合金烤瓷全冠组GCF中TNF-α的表达量与对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）。修复后2个月，两组GCF中TNF-α的表达量与对照组相比差异均无统计学意义（P>0.05）。修复后3个月，含钛合金烤瓷全冠组GCF中TNF-α的表达量与对照组相比有所增高（P<0.05），钴铬合金烤瓷全冠组GCF中TNF-α的表达量与对照组相比差异无统计学意义（P>0.05），见表1。
3 讨 论
金属烤瓷修复体与牙周组织关系密切，它们相互依赖、相互作用。传统的检测牙周组织健康状况的方法，主要是依赖一些临床参数，如探诊深度、牙龈指数等。这些参数只能描述牙周组织改变的结果，而不能反映牙周组织目前的活动状态和未来的活动。龈沟是游离龈与牙面之间形成的间隙，其内有龈沟液（GCF）存在，牙周炎症时GCF的量会明显增加[3]。观察和研究GCF的成份及含量既简便又无创，且可重复操作，是临床检测PFM修复后牙周组织损伤状况的一种新方向，具有广阔的应用前景。研究发现GCF内含有多种化学物质，其中TNF-α和IL-6是两种与牙周生物学相关的重要细胞因子。TNF-α是由激活单核/巨噬细胞、脂肪细胞、NK细胞、B细胞等产生的一种具有多种生物活性的因子，离体激活体实验显示，TNF-α能激发骨吸收，抑制骨形成，刺激产生蛋白酶和前列腺素[4]。TNF-α被认为是介导炎症前细胞因子的代表，是一种很有前瞻性的探查牙周炎症和宿主反应的指标，其含量变化可提示牙周炎症的早期变化。Mutsumi等[5]研究指出，TNF-α能刺激宿主细胞产生白细胞介素-8和单核细胞趋化蛋白，激活炎症应答。IL-6是一种多功能细胞因子，是肝脏合成CRP的主要诱导者，可聚集炎性细胞、活化并促进炎性介质的释放；激活中性粒细胞，加重牙周炎性反应[6]。吴亚菲等[7]研究发现，在牙龈炎症的早期，IL-6的表达并不会大幅增加，而在牙周炎患者的GCF中，IL-6的含量随着附着丧失和牙周袋深度的增加而显著增加，与牙龈炎症的程度无明显关系；并认为IL-6的表达水平是判断牙周病变严重程度的重要指征。 本实验以犬为研究对象，按统一标准行PFM修复，避免了临床患者个体差异大、修复后回访率过低等问题。研究显示：含钛合金修复后1、3个月，TNF-α的表达有所增加（P<0.05），牙周组织炎性改变增强。钴铬合金修复前后，TNF-α的表达无明显改变（P>0.05）。两组修复前后IL-6的表达均无明显改变（P>0.05），两种合金均没有造成严重牙周损害的倾向。提示含钛合金较钴铬合金更容易引起牙周组织的炎性改变，其生物学性能较差。对于含钛合金组TNF-α的表达呈先升高后降低最后再次升高的波动，可能的原因是合金表面钝化膜的形成。研究显示，当合金表面逐渐钝化，生成的钝化膜对材料起到保护作用，合金的腐蚀速度减慢[8]。修复后2个月，由于钝化膜的形成，金属离子的析出减少，牙周组织的炎性改变减弱；但由于析出的金属离子总量在不断增加，修复后3个月，牙周组织的炎性改变再次增强。
参考文献
[1] 赵铱民，陈吉华.口腔修复学[M].第7版.北京，人民卫生出版社，2012：76.
[2] 中华人民共和国科学技术部，关于善待实验动物的指导性意见，2006-09-30.
[3] Msanori Nishikawa，Yoshinori Yanaguchi，Kazusada Yoshitake，et al.Effects of TNF and prostaglandin E2 on the expression of MMPs in human periodontal ligament fibroblasts[J].Journal of Periodontal Research，2002，37：167-176.
[4] Jansson H，Lindholm E，Lindh C，et al.Type 2 diabetes and risk for periodontal disease：a role for dental health awareness[J].J Clin Periodontal，2006，33：408-414.
[5] Mutsumi M，Sato S，Kitagawa S，et a1.Cytokine expression in rat molar gingival periodontal tissues after topical application of lipopolysaccharide[J].Histochem Cell Biol，2001，116（1）：57-62.
[6] Wypasek E，Undas A，Sniezek-Maciejewska M，et al.The increased plasma C-reactive protein and interleukin-6 levels in patients undergoing coronary artery bypass grafting surgery are associated with the interleukin-6-174G>C gene polymorphism[J].Ann Clin Biochem，2010，47（4）：343-349.
[7] 吴亚菲，赵川江，张静仪，等.牙龈沟液中白介素-6含量与牙周炎关系的研究[J].华西医大学报，2000，31：49-496.
[8] MatkoviT，MatkoviP，Malina J.Effects of Ni and Mo on the microstructure and some other properties of Co-Cr dental alloys[J].J Alloys Compounds，2004，366（1-2）：293.