论文部分内容阅读
[摘要] 目的 研究多巴胺（dopamine，DA）及其D2样受体对大鼠胰岛素分泌的影响及机制。 方法 向雄性Wistar大鼠的胆总管中注入胶原酶P消化胰腺得到胰岛组织。将胰岛组织在5 g/L的Dispase Ⅱ中消化5 min得到胰岛细胞。根据方法不同以及加入的物质不同，将胰岛组织或胰岛细胞分成对照组、2.8 G、16.7 G、多巴胺组、喹吡罗组、SKF38393组、多巴胺和喹吡罗混合液组。应用放射免疫分析法测定各组胰岛组织分泌的胰岛素含量变化；应用全细胞膜片钳技术测定各组胰岛细胞电压依赖性钾通道的电流变化；应用钙成像技术测定各组胰岛细胞内钙离子浓度的改变。 结果 多巴胺可抑制葡萄糖刺激的胰岛素分泌，该作用与D2样受体的激活有关。多巴胺可能是通过D2样受体，使KV通道激活，缩短动作电位时程，限制Ca2 进入，进而导致了胰岛素分泌的抑制。 结论 多巴胺通过D2样受体增加KV通道电流、降低细胞内Ca2 浓度，从而产生葡萄糖刺激的胰岛素分泌抑制作用。
[关键词] 多巴胺；胰岛素分泌；电压依赖性钾通道；全细胞膜片钳；钙成像
[中图分类号] R322.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）25-0030-05
[Abstract] Objective To study the effect and mechanism of dopamine（DA） and its D2-like receptors on insulin secretion in rats. Methods Collagenase P was injected into the common bile duct of male Wistar rats to obtain the pancreatic islet tissues. Islet cells were obtained by digesting the pancreatic islet tissues in 5 g/L Dispase II for 5 min. According to different methods and substances added， the islet tissues or islet cells were divided into control group， 2.8 G group， 16.7 G group， dopamine group， quinpirole group， SKF38393 group， dopamine group and quinpirole mixture group. Radioimmunoassay was used to determine the changes of insulin secretion in pancreatic islets. The whole-cell patch clamp technique was used to determine the voltage-dependent potassium currents in the islet cells of each group. Calcium imaging technique was used to determine the changes of intracellular calcium concentration in islets of each group. Results Dopamine inhibits glucose-stimulated insulin secretion. This effect is related to the activation of D2-like receptors. Dopamine may activate KV channels through D2-like receptors， shorten the action potential duration and limit Ca2 entry， which in turn leads to inhibition of insulin secretion. Conclusion Dopamine increases KV channel current and decreases intracellular Ca2 concentration through D2-like receptors， thereby producing glucose-stimulated insulin secretion inhibition.
[Key words] Dopamine； Insulin secretion； Voltage-dependent potassium currents； Whole-cell patch clamp； Calcium imaging
多巴胺作為一种神经递质，在神经和精神疾病，如精神分裂症、帕金森氏症[1]和药物成瘾等方面起着关键作用[2]。不仅如此，多巴胺对外周神经元作用后的葡萄糖和脂质代谢也尤为重要。其中，多巴胺对胰岛素分泌的影响，特别是对胰腺β细胞功能的影响研究不足。多巴胺通过激活多巴胺受体（DRs）而产生各种生物学效应。DRs属于G蛋白偶联受体家族，根据其生化和药理性质不同，将其分成五种不同的DRs亚型（D1R-D5R）和D1样（D1R、D5R）和D2样（D2R、D3R、D4R）两种亚家族[3]。研究发现，在INS-1E细胞、大鼠、小鼠和人类离体胰岛中均有多巴胺受体的存在[4]，且向啮齿类动物中注射左旋多巴会导致β细胞中多巴胺累积和抑制胰岛素分泌[5]反应的发生。在离体的胰岛上，多巴胺的类似物可抑制葡萄糖刺激的胰岛素释放，且与D2样受体有关[6]。然而，多巴胺及其受体对胰岛素分泌的影响机制仍尚不明确。本研究拟通过胰岛素分泌实验、全细胞膜片钳技术和钙成像技术深入探究多巴胺及其D2样受体对大鼠胰岛素分泌的影响及机制。 1 材料与方法
1.1 材料来源
实验设计时间为2017年4～12月，采用40只8周龄SPF级雄性Wistar大鼠，体重240 g左右，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，生产许可证号：SCXK（京）2016-0006。饲养环境：室温为22℃～25℃，湿度为（50±5）%。
1.2 实验试剂
胶原酶P（瑞士Roche，批号：11104222）；Dispase Ⅱ（美国Amresco，批号：10888700）；D-葡萄糖（中国Solarbio，批号：405A0918）；RPMI-1640培养基（加拿大BBI，批号：E600025）；HEPES（中国Solarbio，批号：710B048）；Histopaque 1077（美国Sigma，批号：RNBF 1783）；Dopamine hydrochloride（美國Sigma，批号：1110 4222）；Quinpirole hydrochloride（美国Sigma，批号：00069336）；SKF 38393 hydrochloride（美国Sigma，批号：00055189）。
1.3 实验仪器
CO2细胞培养箱（北京博奥恒信生物科技，型号：HF100）；倒置显微镜（日本OLYMPUS，型号：AE2000）；胰岛素检测试剂盒（北京北方生物技术公司，批号：20160320）；Narishige MODEL PP-830电极拉制仪（日本Narishige，型号：PP-830）；MIRO FORGE MF-830抛光仪（日本Narishige，型号：MF-200）；EPC10全自动膜片钳（德国HEKA，型号：LAMBDA 10-B）。
1.4 方法
1.4.1 胰岛组织和胰岛细胞的分离、培养 雄性Wistar大鼠处死，暴露胰腺，将1 mg/mL的胶原酶P经胆总管缓慢注入胰腺中，剥离充盈的胰腺，在38℃水浴中消化11 min，然后加入Histopaque 1077液进行梯度离心得到胰岛组织颗粒。将分离后过夜修复的胰岛用5 mg/mL的Dispase Ⅱ消化5 min得到单个胰岛细胞。将胰岛和胰岛细胞均置于含10%胎牛血清，100 μg/mL链霉素及100 U/mL青霉素的1640培养基中，在37℃，5% CO2的细胞培养箱中培养。
1.4.2 胰岛素分泌实验 配制适量的KRBH溶液，根据分组加入不同浓度的糖溶液和药物配制出胰岛孵育液（每组7个Ep管）。标记Ep管，每管加入7个圆形光滑、大小均匀的完整胰岛。然后加入含2.8 mmol/L葡萄糖的KRBH溶液500 μL，置于细胞培养箱中预孵育，30 min后弃掉上清液。接着，向每组Ep管中分别加入含KRBH的2.8 mmol/L葡萄糖液（即2.8 G组）、16.7 mmol/L葡萄糖液（即16.7 G组）、16.7 mmol/L葡萄糖 10 μmmol/L DA混合液（即16.7 G 10 μmol/L DA组）、16.7 mmol /L葡萄糖 10 μmmol/L的喹吡罗混合液（即16.7 G 10 μmol/L Quin组）、16.7 mmol/L葡萄糖 10 μmol/L SKF38393（即16.7 G 10 μmol/L SKF38393组）以及16.7 mmol /L葡萄糖 10 μmmol/L DA 10 μmmol/L喹吡罗的混合液（即16.7 G 10 μmol/L DA 10 μmol/L Quin组）各500 μL，置于细胞培养箱中孵育30 min，收集上清液，用放射免疫试剂盒检测胰岛素的含量。
1.4.3 膜片钳实验 用电极拉制仪和MIRO FORGE抛光仪，拉制抛光电极，使得充有电极内液的电极电阻为4～7 MΩ。打开PULSE软件，在设定好的全细胞电压钳模式下记录各参数的值。电容≥7 pF的细胞，此细胞被认为是β细胞[7]。在电阻达到高阻封接（GΩ）后，负压破膜，并将细胞膜电位钳制在-70 mV，记录在-70～80 mV，每10 mV一个步接，400 ms内电压依赖性钾（KV）通道的电流变化。
1.4.4 钙成像实验 配制新鲜的KRBH溶液，根据分组加入不同浓度的糖溶液和不同药物，分别加入到灌流装置中。将细胞浸润在2 μmol/L的Fura-2AM荧光探针染料中，置于细胞培养箱染色30 min。将激光共聚焦装置的激发波长设定为340 nm/380 nm，发射波长为510 nm。将细胞置于37℃恒温浴槽中，持续灌流给予2.8 mmol/L葡萄糖（即2.8 G）、16.7 mmol/L葡萄糖（即16.7 G）和10 μmmol/L 的DA（以16.7 G溶解）或10 μmmol/L 喹吡罗（Quinpirole，Quin），以不同灌流液下F340/F380的荧光强度比值反映细胞内钙离子浓度的变化。
1.5 统计学分析
实验数据采用均数±标准差（x±s）表示，并用Sigma Plot 12.5软件进行分析，One way ANOVA 和t-text进行检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 DA及Quinpirole对大鼠胰岛素分泌的影响
16.7 mmol/L的葡萄糖环境中胰岛素分泌量与2.8 mmol/L葡萄糖组相比明显增加（P<0.001）。而向16.7 mmol/L的葡萄糖中加入DA（10 μmmol/L）后与16.7 mmol/L的葡萄糖组相比明显地抑制了胰岛素的分泌（P<0.001）；同样条件下加入D2样受体激动剂Quinpirole（Quin，10 μmmol/L）也产生了抑分泌作用（P<0.001）。当DA与Quinpirole同时存在时，抑制胰岛素的分泌作用与多巴胺组相比没有进一步的增加（P>0.05）。见表1。 2.2 SKF38393对大鼠胰岛素分泌的影响
16.7 mmol/L葡萄糖组的胰岛素分泌量与2.8 mmol/L葡萄糖组相比明显增加（P<0.01）。而在16.7 mmol/L的葡萄糖环境中的D1样受体激动剂SKF38393（10 μmmol/L）对胰岛素的分泌量并未产生明显的改变（P >0.05）。见表2。
2.3 DA及Quinpirole对胰岛β细胞电压依赖性钾通道的影响
与对照组相比，DA（10 μmmol/L）组明显增加电压依赖性钾通道（KV）电流（P<0.01）。D2样受体激动剂Quinpirole（Quin，10 μmmol/L）组也可促进KV通道电流的增加（P<0.01）。DA与Quinpirole的混合液组，与对照组相比可增加KV通道的电流（P<0.01），而与DA组相比并未使KV通道电流进一步增加。见表3，图1。
2.4 SKF38393對胰岛β细胞电压依赖性钾通道的影响
通过全细胞电压钳技术，记录细胞电压依赖性钾（KV）通道电流发现，与对照组相比，D1样受体激动剂SKF38393（10 μmmol/L）组对KV通道的电流并未产生明显影响（P>0.05）。见表4和图2。
2.5 DA及Quinpirole对胰岛β细胞内Ca2 浓度的影响
利用荧光指示剂Fura-2AM，来反映细胞内Ca2 浓度。结果显示，16.7 mmol/L葡萄糖与DA（10 μmmol/L）灌流混合液组与单独的16.7 mmol/L葡萄糖组相比可显著降低细胞内Ca2 浓度；同样，在16.7 mmol/L葡萄糖中的Quinpirole（Quin，10 μmmol/L）也显著降低了细胞内Ca2 浓度。当药物被从灌流液中去除后，DA降低细胞内Ca2 浓度的作用被逆转。见图3。
3 讨论
临床数据表明，在帕金森病患者中，多巴胺前体左旋多巴的治疗可降低口服葡萄糖耐量试验期间的胰岛素分泌[8]。一些研究还报道了左旋多巴注入啮齿动物可导致多巴胺在胰岛β细胞中的蓄积和胰岛素分泌的抑制[9]。这些都为多巴胺对葡萄糖刺激的胰岛素分泌具有抑制作用提供了依据。本研究证实，多巴胺在离体的胰岛组织中对大鼠胰岛素的分泌有抑制作用。这些结果与INS-1E细胞中进行的研究相一致[10]。然而，多巴胺对胰岛素分泌调节的潜在机制仍尚不明确。
胰腺β细胞分泌胰岛素是保持健康个体葡萄糖稳态的基本过程。在葡萄糖刺激胰腺β细胞分泌胰岛素的过程中，葡萄糖经线粒体代谢产生ATP，促进ATP敏感性内向整流钾通道闭合，导致细胞膜去极化[11]。当去极化到一定程度时，电压依赖性钙通道开放使胞内的Ca2 浓度升高，诱导了胰岛素的分泌。在这个过程中，电压依赖性钾（KV）通道对胰岛素分泌的调控起到重要的负反馈调节作用[12，13]，且除了葡萄糖刺激外，G蛋白偶联受体（GPCR）在调节胰岛素释放过程中也发挥了重要作用。D2样受体作为G蛋白偶联受体，已证实存在于人类、大鼠、小鼠和INS-1E的胰腺β细胞[6，10]。在啮齿动物和人类的胰腺细胞中发现，多巴胺代谢相关的酶即泡状单胺转运蛋白2型（VMAT2）也有表达[14]。更有直接证据发现，D2R在哺乳动物细胞系INS-1 832/13中被敲除，会导致胰岛素分泌增加[15]，Rubi等[10]也证实了外源性多巴胺可以抑制胰腺中葡萄糖刺激的胰岛素分泌，且该机制与胰岛上D2样受体的表达有关。然而，多巴胺抑制胰腺胰岛素分泌的分子机制仍然未知。本研究中，通过应用D2样受体激动剂喹吡罗（Quinpirole）和D1样受体激动剂SKF 38393在16.7 mmol/L葡萄糖环境中刺激离体大鼠的胰岛组织发现，SKF38393对胰岛素分泌无影响，而喹吡罗则产生了类似于多巴胺的胰岛素分泌抑制作用；且在喹吡罗存在的条件下，多巴胺的加入并没有使胰岛素的分泌进一步抑制。这就暗示我们多巴胺主要是通过激活D2样受体而产生抑制胰岛素分泌的作用的，因为如果D1样受体发挥关键作用，多巴胺的加入可使抑分泌作用进一步加强。
KV通道参与可兴奋细胞的复极化过程，对胰岛素分泌的调控起负反馈作用[16]。KV通道的抑制可使细胞的动作电位时程延长，允许更多的Ca2 进入胞内，从而增强胰岛素分泌[17]。然而，在本研究中，我们发现D1样受体激动剂SKF38393对KV通道电流无影响；多巴胺及D2样受体激动剂喹吡罗可促进KV通道电流的增加，且该作用主要与D2样受体有关。
细胞内钙活动是触发葡萄糖刺激的胰岛素分泌的主要信号[18]。正如我们预期的那样，我们的钙成像实验表明多巴胺和D2样受体激动剂喹吡罗均使细胞内Ca2 浓度可逆性降低，这与我们的研究结果一致。
综上所述，这些结果共同表明多巴胺可抑制葡萄糖刺激的胰岛素分泌，该作用与D2样受体的激活有关。多巴胺可能是通过D2样受体，使KV通道激活，缩短了动作电位时程，限制了Ca2 进入，进而导致了胰岛素分泌的抑制。
[参考文献]
[1] Callier S，Snapyan M，Le CS，et al. Evolution and cell biology of dopamine receptors in vertebrates[J]. Biol Cell，2003，95（7）：489-502.
[2] Nettersheim FS，Loehrer PA，Weber I，et al. Dopamine substitution alters effective connectivity of cortical prefrontal，premotor，and motor regions during complex bimanual finger movements in Parkinson’s disease[J]. Neuroimage， 2018. [3] CLB K， Ralff MD，Lulla AR，et al. Role of Dopamine Receptors in the Anticancer Activity of ONC201[J]. Neoplasia，2018，20（1）：80-91.
[4] Arneric SP，Chow SA，Long JP，et al. Inhibition of insulin release from rat pancreatic islets by drugs that are analogues of dopamine[J]. Diabetes， 1984，33（9）：888-893.
[5] Ericson LE，Hakanson R，Lundquist I. Accumulation of dopamine in mouse pancreatic B-cells following injection of L-DOPA. Localization to secretory granules and inhibition of insulin secretion[J]. Diabetologia，1977，13（2）：117-124.
[6] Nogueira CR，Machado UF，Curi R，et al. Modulation of insulin secretion and 45Ca2 efflux by dopamine in glucose-stimulated pancreatic islets[J]. Gen Pharmacol，1994， 25（5）：909-916.
[7] G？觟pel S，Kanno T，Barg S，et al. Voltage-gated and resting membrane currents recorded from B-cells in intact mouse pancreatic islets[J]. J Physiol，1999，521，（3）：717-728.
[8] Rosati G，Maioli M，Aiello I，et al. Effects of long-term L-dopa therapy on carbohydrate metabolism in patients with Parkinson’s disease[J]. Eur Neurol，1976，14（3）：229-239.
[9] Steele KE， Prokopowicz GP， Schweitzer MA， et al. Alterations of central dopamine receptors before and after gastric bypass surgery[J]. Obes Surg，2010，20（3）：369-374.
[10] Rubí B，Ljubicic S，Pournourmohammadi S，et al. Dopamine D2-like receptors are expressed in pancreatic beta cells and mediate inhibition of insulin secretion[J]. J Biol Chem，2005，280（44）：36824-36832.
[11] Sha Y，Zhang Y，Cao J，et al. Loureirin B promotes insulin secretion through inhibition of KATP channel and influx of intracellular calcium[J]. J Cell Biochem， 2018， 119（2）：2012-2021.
[12] Jacobson DA，Kuznetsov A， Lopez JP， et al. Kv2.1 ablation alters glucose-induced islet electrical activity， enhancing insulin secretion[J]. Cell Metab，2007，6（3）：229-235.
[13] Greitzer-Antes D，Xie L，Qin T，et al. Kv2.1 clusters on β-cell plasma membrane act as reservoirs that replenish pools of newcomer insulin granule through their interaction with syntaxin-3[J].J Biol Chem，2018，293（18）：6893-6904.
[14] Saisho Y，Harris PE，Butler AE，et al. Relationship between pancreatic vesicular monoamine transporter 2 （VMAT2） and insulin expression in human pancreas[J]. J Mol Histol，2008，39（5）：543-551.
[15] Wu W，Shang J，Feng Y，et al. Identification of glucose-dependant insulin secretion targets in pancreatic beta cells by combining defined-mechanism compound library screening and siRNA gene silencing[J]. J Biomol Screen， 2008，13（2）：128-134.
[16] Liu Y，Zhong X，Ding Y，et al. Inhibition of voltage-dependent potassium channels mediates cAMP-potentiated insulin secretion in rat pancreatic β cells[J].Islets，2017，9（2）：11-18.
[17] Gao J，Zhong X，Ding Y，et al. Inhibition of voltage-gated potassium channels mediates uncarboxylated osteocalcin-regulated insulin secretion in rat pancreatic β cells[J].Eur J Pharmacol，2016，777：41-48.
[18] Grodsky GM，Bennett LL. Cation requirements for insulin secretion in the isolated perfused pancreas[J]. Diabetes，1966，15（12）：910-913.
（收稿日期：2018-03-24）
[关键词] 多巴胺；胰岛素分泌；电压依赖性钾通道；全细胞膜片钳；钙成像
[中图分类号] R322.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）25-0030-05
[Abstract] Objective To study the effect and mechanism of dopamine（DA） and its D2-like receptors on insulin secretion in rats. Methods Collagenase P was injected into the common bile duct of male Wistar rats to obtain the pancreatic islet tissues. Islet cells were obtained by digesting the pancreatic islet tissues in 5 g/L Dispase II for 5 min. According to different methods and substances added， the islet tissues or islet cells were divided into control group， 2.8 G group， 16.7 G group， dopamine group， quinpirole group， SKF38393 group， dopamine group and quinpirole mixture group. Radioimmunoassay was used to determine the changes of insulin secretion in pancreatic islets. The whole-cell patch clamp technique was used to determine the voltage-dependent potassium currents in the islet cells of each group. Calcium imaging technique was used to determine the changes of intracellular calcium concentration in islets of each group. Results Dopamine inhibits glucose-stimulated insulin secretion. This effect is related to the activation of D2-like receptors. Dopamine may activate KV channels through D2-like receptors， shorten the action potential duration and limit Ca2 entry， which in turn leads to inhibition of insulin secretion. Conclusion Dopamine increases KV channel current and decreases intracellular Ca2 concentration through D2-like receptors， thereby producing glucose-stimulated insulin secretion inhibition.
[Key words] Dopamine； Insulin secretion； Voltage-dependent potassium currents； Whole-cell patch clamp； Calcium imaging
多巴胺作為一种神经递质，在神经和精神疾病，如精神分裂症、帕金森氏症[1]和药物成瘾等方面起着关键作用[2]。不仅如此，多巴胺对外周神经元作用后的葡萄糖和脂质代谢也尤为重要。其中，多巴胺对胰岛素分泌的影响，特别是对胰腺β细胞功能的影响研究不足。多巴胺通过激活多巴胺受体（DRs）而产生各种生物学效应。DRs属于G蛋白偶联受体家族，根据其生化和药理性质不同，将其分成五种不同的DRs亚型（D1R-D5R）和D1样（D1R、D5R）和D2样（D2R、D3R、D4R）两种亚家族[3]。研究发现，在INS-1E细胞、大鼠、小鼠和人类离体胰岛中均有多巴胺受体的存在[4]，且向啮齿类动物中注射左旋多巴会导致β细胞中多巴胺累积和抑制胰岛素分泌[5]反应的发生。在离体的胰岛上，多巴胺的类似物可抑制葡萄糖刺激的胰岛素释放，且与D2样受体有关[6]。然而，多巴胺及其受体对胰岛素分泌的影响机制仍尚不明确。本研究拟通过胰岛素分泌实验、全细胞膜片钳技术和钙成像技术深入探究多巴胺及其D2样受体对大鼠胰岛素分泌的影响及机制。 1 材料与方法
1.1 材料来源
实验设计时间为2017年4～12月，采用40只8周龄SPF级雄性Wistar大鼠，体重240 g左右，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，生产许可证号：SCXK（京）2016-0006。饲养环境：室温为22℃～25℃，湿度为（50±5）%。
1.2 实验试剂
胶原酶P（瑞士Roche，批号：11104222）；Dispase Ⅱ（美国Amresco，批号：10888700）；D-葡萄糖（中国Solarbio，批号：405A0918）；RPMI-1640培养基（加拿大BBI，批号：E600025）；HEPES（中国Solarbio，批号：710B048）；Histopaque 1077（美国Sigma，批号：RNBF 1783）；Dopamine hydrochloride（美國Sigma，批号：1110 4222）；Quinpirole hydrochloride（美国Sigma，批号：00069336）；SKF 38393 hydrochloride（美国Sigma，批号：00055189）。
1.3 实验仪器
CO2细胞培养箱（北京博奥恒信生物科技，型号：HF100）；倒置显微镜（日本OLYMPUS，型号：AE2000）；胰岛素检测试剂盒（北京北方生物技术公司，批号：20160320）；Narishige MODEL PP-830电极拉制仪（日本Narishige，型号：PP-830）；MIRO FORGE MF-830抛光仪（日本Narishige，型号：MF-200）；EPC10全自动膜片钳（德国HEKA，型号：LAMBDA 10-B）。
1.4 方法
1.4.1 胰岛组织和胰岛细胞的分离、培养 雄性Wistar大鼠处死，暴露胰腺，将1 mg/mL的胶原酶P经胆总管缓慢注入胰腺中，剥离充盈的胰腺，在38℃水浴中消化11 min，然后加入Histopaque 1077液进行梯度离心得到胰岛组织颗粒。将分离后过夜修复的胰岛用5 mg/mL的Dispase Ⅱ消化5 min得到单个胰岛细胞。将胰岛和胰岛细胞均置于含10%胎牛血清，100 μg/mL链霉素及100 U/mL青霉素的1640培养基中，在37℃，5% CO2的细胞培养箱中培养。
1.4.2 胰岛素分泌实验 配制适量的KRBH溶液，根据分组加入不同浓度的糖溶液和药物配制出胰岛孵育液（每组7个Ep管）。标记Ep管，每管加入7个圆形光滑、大小均匀的完整胰岛。然后加入含2.8 mmol/L葡萄糖的KRBH溶液500 μL，置于细胞培养箱中预孵育，30 min后弃掉上清液。接着，向每组Ep管中分别加入含KRBH的2.8 mmol/L葡萄糖液（即2.8 G组）、16.7 mmol/L葡萄糖液（即16.7 G组）、16.7 mmol/L葡萄糖 10 μmmol/L DA混合液（即16.7 G 10 μmol/L DA组）、16.7 mmol /L葡萄糖 10 μmmol/L的喹吡罗混合液（即16.7 G 10 μmol/L Quin组）、16.7 mmol/L葡萄糖 10 μmol/L SKF38393（即16.7 G 10 μmol/L SKF38393组）以及16.7 mmol /L葡萄糖 10 μmmol/L DA 10 μmmol/L喹吡罗的混合液（即16.7 G 10 μmol/L DA 10 μmol/L Quin组）各500 μL，置于细胞培养箱中孵育30 min，收集上清液，用放射免疫试剂盒检测胰岛素的含量。
1.4.3 膜片钳实验 用电极拉制仪和MIRO FORGE抛光仪，拉制抛光电极，使得充有电极内液的电极电阻为4～7 MΩ。打开PULSE软件，在设定好的全细胞电压钳模式下记录各参数的值。电容≥7 pF的细胞，此细胞被认为是β细胞[7]。在电阻达到高阻封接（GΩ）后，负压破膜，并将细胞膜电位钳制在-70 mV，记录在-70～80 mV，每10 mV一个步接，400 ms内电压依赖性钾（KV）通道的电流变化。
1.4.4 钙成像实验 配制新鲜的KRBH溶液，根据分组加入不同浓度的糖溶液和不同药物，分别加入到灌流装置中。将细胞浸润在2 μmol/L的Fura-2AM荧光探针染料中，置于细胞培养箱染色30 min。将激光共聚焦装置的激发波长设定为340 nm/380 nm，发射波长为510 nm。将细胞置于37℃恒温浴槽中，持续灌流给予2.8 mmol/L葡萄糖（即2.8 G）、16.7 mmol/L葡萄糖（即16.7 G）和10 μmmol/L 的DA（以16.7 G溶解）或10 μmmol/L 喹吡罗（Quinpirole，Quin），以不同灌流液下F340/F380的荧光强度比值反映细胞内钙离子浓度的变化。
1.5 统计学分析
实验数据采用均数±标准差（x±s）表示，并用Sigma Plot 12.5软件进行分析，One way ANOVA 和t-text进行检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 DA及Quinpirole对大鼠胰岛素分泌的影响
16.7 mmol/L的葡萄糖环境中胰岛素分泌量与2.8 mmol/L葡萄糖组相比明显增加（P<0.001）。而向16.7 mmol/L的葡萄糖中加入DA（10 μmmol/L）后与16.7 mmol/L的葡萄糖组相比明显地抑制了胰岛素的分泌（P<0.001）；同样条件下加入D2样受体激动剂Quinpirole（Quin，10 μmmol/L）也产生了抑分泌作用（P<0.001）。当DA与Quinpirole同时存在时，抑制胰岛素的分泌作用与多巴胺组相比没有进一步的增加（P>0.05）。见表1。 2.2 SKF38393对大鼠胰岛素分泌的影响
16.7 mmol/L葡萄糖组的胰岛素分泌量与2.8 mmol/L葡萄糖组相比明显增加（P<0.01）。而在16.7 mmol/L的葡萄糖环境中的D1样受体激动剂SKF38393（10 μmmol/L）对胰岛素的分泌量并未产生明显的改变（P >0.05）。见表2。
2.3 DA及Quinpirole对胰岛β细胞电压依赖性钾通道的影响
与对照组相比，DA（10 μmmol/L）组明显增加电压依赖性钾通道（KV）电流（P<0.01）。D2样受体激动剂Quinpirole（Quin，10 μmmol/L）组也可促进KV通道电流的增加（P<0.01）。DA与Quinpirole的混合液组，与对照组相比可增加KV通道的电流（P<0.01），而与DA组相比并未使KV通道电流进一步增加。见表3，图1。
2.4 SKF38393對胰岛β细胞电压依赖性钾通道的影响
通过全细胞电压钳技术，记录细胞电压依赖性钾（KV）通道电流发现，与对照组相比，D1样受体激动剂SKF38393（10 μmmol/L）组对KV通道的电流并未产生明显影响（P>0.05）。见表4和图2。
2.5 DA及Quinpirole对胰岛β细胞内Ca2 浓度的影响
利用荧光指示剂Fura-2AM，来反映细胞内Ca2 浓度。结果显示，16.7 mmol/L葡萄糖与DA（10 μmmol/L）灌流混合液组与单独的16.7 mmol/L葡萄糖组相比可显著降低细胞内Ca2 浓度；同样，在16.7 mmol/L葡萄糖中的Quinpirole（Quin，10 μmmol/L）也显著降低了细胞内Ca2 浓度。当药物被从灌流液中去除后，DA降低细胞内Ca2 浓度的作用被逆转。见图3。
3 讨论
临床数据表明，在帕金森病患者中，多巴胺前体左旋多巴的治疗可降低口服葡萄糖耐量试验期间的胰岛素分泌[8]。一些研究还报道了左旋多巴注入啮齿动物可导致多巴胺在胰岛β细胞中的蓄积和胰岛素分泌的抑制[9]。这些都为多巴胺对葡萄糖刺激的胰岛素分泌具有抑制作用提供了依据。本研究证实，多巴胺在离体的胰岛组织中对大鼠胰岛素的分泌有抑制作用。这些结果与INS-1E细胞中进行的研究相一致[10]。然而，多巴胺对胰岛素分泌调节的潜在机制仍尚不明确。
胰腺β细胞分泌胰岛素是保持健康个体葡萄糖稳态的基本过程。在葡萄糖刺激胰腺β细胞分泌胰岛素的过程中，葡萄糖经线粒体代谢产生ATP，促进ATP敏感性内向整流钾通道闭合，导致细胞膜去极化[11]。当去极化到一定程度时，电压依赖性钙通道开放使胞内的Ca2 浓度升高，诱导了胰岛素的分泌。在这个过程中，电压依赖性钾（KV）通道对胰岛素分泌的调控起到重要的负反馈调节作用[12，13]，且除了葡萄糖刺激外，G蛋白偶联受体（GPCR）在调节胰岛素释放过程中也发挥了重要作用。D2样受体作为G蛋白偶联受体，已证实存在于人类、大鼠、小鼠和INS-1E的胰腺β细胞[6，10]。在啮齿动物和人类的胰腺细胞中发现，多巴胺代谢相关的酶即泡状单胺转运蛋白2型（VMAT2）也有表达[14]。更有直接证据发现，D2R在哺乳动物细胞系INS-1 832/13中被敲除，会导致胰岛素分泌增加[15]，Rubi等[10]也证实了外源性多巴胺可以抑制胰腺中葡萄糖刺激的胰岛素分泌，且该机制与胰岛上D2样受体的表达有关。然而，多巴胺抑制胰腺胰岛素分泌的分子机制仍然未知。本研究中，通过应用D2样受体激动剂喹吡罗（Quinpirole）和D1样受体激动剂SKF 38393在16.7 mmol/L葡萄糖环境中刺激离体大鼠的胰岛组织发现，SKF38393对胰岛素分泌无影响，而喹吡罗则产生了类似于多巴胺的胰岛素分泌抑制作用；且在喹吡罗存在的条件下，多巴胺的加入并没有使胰岛素的分泌进一步抑制。这就暗示我们多巴胺主要是通过激活D2样受体而产生抑制胰岛素分泌的作用的，因为如果D1样受体发挥关键作用，多巴胺的加入可使抑分泌作用进一步加强。
KV通道参与可兴奋细胞的复极化过程，对胰岛素分泌的调控起负反馈作用[16]。KV通道的抑制可使细胞的动作电位时程延长，允许更多的Ca2 进入胞内，从而增强胰岛素分泌[17]。然而，在本研究中，我们发现D1样受体激动剂SKF38393对KV通道电流无影响；多巴胺及D2样受体激动剂喹吡罗可促进KV通道电流的增加，且该作用主要与D2样受体有关。
细胞内钙活动是触发葡萄糖刺激的胰岛素分泌的主要信号[18]。正如我们预期的那样，我们的钙成像实验表明多巴胺和D2样受体激动剂喹吡罗均使细胞内Ca2 浓度可逆性降低，这与我们的研究结果一致。
综上所述，这些结果共同表明多巴胺可抑制葡萄糖刺激的胰岛素分泌，该作用与D2样受体的激活有关。多巴胺可能是通过D2样受体，使KV通道激活，缩短了动作电位时程，限制了Ca2 进入，进而导致了胰岛素分泌的抑制。
[参考文献]
[1] Callier S，Snapyan M，Le CS，et al. Evolution and cell biology of dopamine receptors in vertebrates[J]. Biol Cell，2003，95（7）：489-502.
[2] Nettersheim FS，Loehrer PA，Weber I，et al. Dopamine substitution alters effective connectivity of cortical prefrontal，premotor，and motor regions during complex bimanual finger movements in Parkinson’s disease[J]. Neuroimage， 2018. [3] CLB K， Ralff MD，Lulla AR，et al. Role of Dopamine Receptors in the Anticancer Activity of ONC201[J]. Neoplasia，2018，20（1）：80-91.
[4] Arneric SP，Chow SA，Long JP，et al. Inhibition of insulin release from rat pancreatic islets by drugs that are analogues of dopamine[J]. Diabetes， 1984，33（9）：888-893.
[5] Ericson LE，Hakanson R，Lundquist I. Accumulation of dopamine in mouse pancreatic B-cells following injection of L-DOPA. Localization to secretory granules and inhibition of insulin secretion[J]. Diabetologia，1977，13（2）：117-124.
[6] Nogueira CR，Machado UF，Curi R，et al. Modulation of insulin secretion and 45Ca2 efflux by dopamine in glucose-stimulated pancreatic islets[J]. Gen Pharmacol，1994， 25（5）：909-916.
[7] G？觟pel S，Kanno T，Barg S，et al. Voltage-gated and resting membrane currents recorded from B-cells in intact mouse pancreatic islets[J]. J Physiol，1999，521，（3）：717-728.
[8] Rosati G，Maioli M，Aiello I，et al. Effects of long-term L-dopa therapy on carbohydrate metabolism in patients with Parkinson’s disease[J]. Eur Neurol，1976，14（3）：229-239.
[9] Steele KE， Prokopowicz GP， Schweitzer MA， et al. Alterations of central dopamine receptors before and after gastric bypass surgery[J]. Obes Surg，2010，20（3）：369-374.
[10] Rubí B，Ljubicic S，Pournourmohammadi S，et al. Dopamine D2-like receptors are expressed in pancreatic beta cells and mediate inhibition of insulin secretion[J]. J Biol Chem，2005，280（44）：36824-36832.
[11] Sha Y，Zhang Y，Cao J，et al. Loureirin B promotes insulin secretion through inhibition of KATP channel and influx of intracellular calcium[J]. J Cell Biochem， 2018， 119（2）：2012-2021.
[12] Jacobson DA，Kuznetsov A， Lopez JP， et al. Kv2.1 ablation alters glucose-induced islet electrical activity， enhancing insulin secretion[J]. Cell Metab，2007，6（3）：229-235.
[13] Greitzer-Antes D，Xie L，Qin T，et al. Kv2.1 clusters on β-cell plasma membrane act as reservoirs that replenish pools of newcomer insulin granule through their interaction with syntaxin-3[J].J Biol Chem，2018，293（18）：6893-6904.
[14] Saisho Y，Harris PE，Butler AE，et al. Relationship between pancreatic vesicular monoamine transporter 2 （VMAT2） and insulin expression in human pancreas[J]. J Mol Histol，2008，39（5）：543-551.
[15] Wu W，Shang J，Feng Y，et al. Identification of glucose-dependant insulin secretion targets in pancreatic beta cells by combining defined-mechanism compound library screening and siRNA gene silencing[J]. J Biomol Screen， 2008，13（2）：128-134.
[16] Liu Y，Zhong X，Ding Y，et al. Inhibition of voltage-dependent potassium channels mediates cAMP-potentiated insulin secretion in rat pancreatic β cells[J].Islets，2017，9（2）：11-18.
[17] Gao J，Zhong X，Ding Y，et al. Inhibition of voltage-gated potassium channels mediates uncarboxylated osteocalcin-regulated insulin secretion in rat pancreatic β cells[J].Eur J Pharmacol，2016，777：41-48.
[18] Grodsky GM，Bennett LL. Cation requirements for insulin secretion in the isolated perfused pancreas[J]. Diabetes，1966，15（12）：910-913.
（收稿日期：2018-03-24）