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【中图分类号】R155【文献标识码】A【文章编号】1550-1868（2015）04
【摘要】目的：研究药品中金黄色葡萄球菌快速、有效的检验方法。方法：选取临床常用的7种药品为研究对象，在接种金黄色葡萄球菌以后，进行增菌培养。随后采用平板分离、实时荧光PCR技术分别进行检验，并对两种检验结果进行统计与比较。结果：对于阳性样本，平板法以及实时荧光PCR法的检出率均达到了100%。结论：实时荧光PCR技术具有准确、快速等显著优势，与平板法结合应用，可在快速检验药品金黄色葡萄球菌中发挥出重要作用。
【关键词】实时荧光PCR技术；药品；金黄色葡萄球菌
作为人类的一种重要病原菌，金黄色葡萄球菌是是革兰氏阳性菌的代表，可引起肺炎、心包炎、局部化脓感染以及脓毒症等全身感染，平板分离法为此种病原菌当前常用的检验方法。近些年来，随着分子生物学以及检测免疫学等技术的进步与发展，PCR（聚合酶链式反应）技术在微生物检测中得到了较为广泛的应用[1]。其中，实时荧光PCR技术指的是借助荧光信号对PCR整个进程进行实时监测，具有非常强特异性，对于PCR污染问题，可起到有效的解决作用[2]。本实验对实时荧光PCR技术与平板分离两种方法的应用展开比较与研究，以期探寻出药品金黄色葡萄球菌的快速、准确检验方法。具体操作如下。
1资料与方法
1.1试验材料
选取临床常用的7种药品为研究对象，主要有75%的乙醇溶液、0.1%的苯扎澳按溶液、醋酸氟轻松乳膏、复方醋酸地塞米松乳膏、磷酸钠盐灌肠液、哈西奈德溶以及硼酸冰片滴耳液。选取由中国药品检定所提供的第二代金黄色葡萄球菌菌种；培养基包括甘露醇氯化钠琼脂、pH值为7.0的氯化钠蛋白胨缓冲液以及营养肉汤。试剂则选用由杜邦公司提供的实时荧光PCR试剂盒，主要包括PCR反应体系、裂解液、酶、探针以及引物；检测仪器则选用型号为HTY601的集菌仪及全自动病原微生物的检测系统。
1.2检验方法
（1）制备菌液：将9ml浓度为0.9%的氯化钠溶液加进经过24h温度为36摄氏度培养的1ml金黄色葡萄球菌的肉汤增菌液中，在进行十倍的稀释，直到活菌数处于10至100cfu/ml的范围内，以备使用。
（2）制备供试液：首先，在90ml的pH为7的氯化钠蛋白胨缓冲溶液中加入10ml样品，经混匀后，即为1：10的液体供试液；其次，在含有20ml的无菌玻璃珠及无菌十四烷酸异丙醋瓶中加入10g样品，并振荡溶解供试品，随后将100ml温度为45摄氏度的氯化钠蛋白胨缓冲溶液加入其中，充分振荡后静置，待样品分层明显后，将水层作为1：10的乳膏类供试液。
（3）培养增菌
以金黄色葡萄球菌生长受到供试品抑制程度的不同为依据，采取常规、薄膜过滤以及培养基稀释等不同的样品增菌培养方法，并将1ml已经稀释好的菌液加进各组培养液中。同时将加上等量菌液的营养肉汤培养基作为阳性对照组，并将无菌肉汤培养基作为阴性对照组，两组的培养基同时放置于36度的环境中接受为期24小时的培养。
（4）筛选菌种
其一，平板分离法。在甘露醇氧化钠琼脂平板上接种肉汤增菌液，并在36摄氏度的环境下培养24h至72h，次日对平板上典型菌落的出现情况进行观察。在甘露醇氧化钠琼脂的平板上，金黄色葡萄球菌典型菌落的主要特点有：颜色为金黄色、圆形的凸起，外圈存在黄色环，边缘整体，且菌落的直径在0.8mm左右。
其二，实时荧光PCR检测法。在200μl的裂解液中加入5μl的增菌液，其裂解时间为1h，在经过95℃的裂解，以及10分钟的灭活处理后，迅速将裂解液的温度冷却到4℃，并在PCR反应体系中加入30ml的裂解液，立即上机开展PCR反应操作，反应主要包括两个步骤，一是在95℃的温度下预变性2分钟，二是在95℃温度下预变性15秒，随后再在60℃下预变性1分钟，对荧光信号进行收集，并扩增循环重复第二个步骤40次左右，反应的时间为1个半小时左右。
2结果
平板法以及实时荧光PCR法的对阳性样本的检出率均达高达100%，本实验7种加菌药品的培养情况以及目标菌的筛选结果具体如表1所示。
3结论
随着生物学技术及临床检测技术的飞速发展，实时荧光PCR技术在食品安全以及疾病诊断领域的金黄色葡萄球菌的检验中得到了广泛的应用，并取得了理想的效果[3]。在本实验中，笔者选取了具有代表性的两种外用药品膏剂以及液体，在经过人工接种阳性菌之后，以金黄色葡萄球菌生长受到供试品抑制程度的不同为依据，分别应用三种方法来培养增菌。其中，两种检验方法均在7中供试品中检出了金黄色葡萄球菌，且检出率均高达100%，这说明对于某些临床药品中含有的金黄色葡萄球菌，实时荧光PCR技术可起到准确、快速的检测作用。
相比于检测时间为24h至72h的传统平板分离检测法，应用实时荧光PCR技术仅需1h的检测时间即可，极大程度上降低了筛选目标菌的时间。由于在不同环境下，微生物具备不同的形态，因而采取平板分离法具备较高的漏检可能，而荧光PCR法的检测基础为遗传信息，稳定性比较高。同时，平板法需借助检验人员业务水平方能很好鉴定出可疑的菌落形态；而对于荧光PCR法而言，其有效将定性检验转化为了量化荧光信号强度的检验，大大简化了判断实验结果的过程。
综上所述，实时荧光PCR技术具有准确、快速等显著优势，与平板法结合应用，可在快速检验药品金黄色葡萄球菌中发挥出重要作用。
参考文献
[1]袁桂兴，温剑.金黄色葡萄球菌的快速检测方法[J].生物技术通报，2013，23（06）：75-76.
[2]徐德顺，胡霞清.食品中沙门菌实时荧光PCR快速检测方法的研究[J].中国预防医学杂志，2013.9（10）：870-873.
[3]刘婷婷，王鲁华，裴琳.实时荧光PCR技术快速检验药品中金黄色葡萄球菌[J].中国药师，2013，16（06）：922-923.
【摘要】目的：研究药品中金黄色葡萄球菌快速、有效的检验方法。方法：选取临床常用的7种药品为研究对象，在接种金黄色葡萄球菌以后，进行增菌培养。随后采用平板分离、实时荧光PCR技术分别进行检验，并对两种检验结果进行统计与比较。结果：对于阳性样本，平板法以及实时荧光PCR法的检出率均达到了100%。结论：实时荧光PCR技术具有准确、快速等显著优势，与平板法结合应用，可在快速检验药品金黄色葡萄球菌中发挥出重要作用。
【关键词】实时荧光PCR技术；药品；金黄色葡萄球菌
作为人类的一种重要病原菌，金黄色葡萄球菌是是革兰氏阳性菌的代表，可引起肺炎、心包炎、局部化脓感染以及脓毒症等全身感染，平板分离法为此种病原菌当前常用的检验方法。近些年来，随着分子生物学以及检测免疫学等技术的进步与发展，PCR（聚合酶链式反应）技术在微生物检测中得到了较为广泛的应用[1]。其中，实时荧光PCR技术指的是借助荧光信号对PCR整个进程进行实时监测，具有非常强特异性，对于PCR污染问题，可起到有效的解决作用[2]。本实验对实时荧光PCR技术与平板分离两种方法的应用展开比较与研究，以期探寻出药品金黄色葡萄球菌的快速、准确检验方法。具体操作如下。
1资料与方法
1.1试验材料
选取临床常用的7种药品为研究对象，主要有75%的乙醇溶液、0.1%的苯扎澳按溶液、醋酸氟轻松乳膏、复方醋酸地塞米松乳膏、磷酸钠盐灌肠液、哈西奈德溶以及硼酸冰片滴耳液。选取由中国药品检定所提供的第二代金黄色葡萄球菌菌种；培养基包括甘露醇氯化钠琼脂、pH值为7.0的氯化钠蛋白胨缓冲液以及营养肉汤。试剂则选用由杜邦公司提供的实时荧光PCR试剂盒，主要包括PCR反应体系、裂解液、酶、探针以及引物；检测仪器则选用型号为HTY601的集菌仪及全自动病原微生物的检测系统。
1.2检验方法
（1）制备菌液：将9ml浓度为0.9%的氯化钠溶液加进经过24h温度为36摄氏度培养的1ml金黄色葡萄球菌的肉汤增菌液中，在进行十倍的稀释，直到活菌数处于10至100cfu/ml的范围内，以备使用。
（2）制备供试液：首先，在90ml的pH为7的氯化钠蛋白胨缓冲溶液中加入10ml样品，经混匀后，即为1：10的液体供试液；其次，在含有20ml的无菌玻璃珠及无菌十四烷酸异丙醋瓶中加入10g样品，并振荡溶解供试品，随后将100ml温度为45摄氏度的氯化钠蛋白胨缓冲溶液加入其中，充分振荡后静置，待样品分层明显后，将水层作为1：10的乳膏类供试液。
（3）培养增菌
以金黄色葡萄球菌生长受到供试品抑制程度的不同为依据，采取常规、薄膜过滤以及培养基稀释等不同的样品增菌培养方法，并将1ml已经稀释好的菌液加进各组培养液中。同时将加上等量菌液的营养肉汤培养基作为阳性对照组，并将无菌肉汤培养基作为阴性对照组，两组的培养基同时放置于36度的环境中接受为期24小时的培养。
（4）筛选菌种
其一，平板分离法。在甘露醇氧化钠琼脂平板上接种肉汤增菌液，并在36摄氏度的环境下培养24h至72h，次日对平板上典型菌落的出现情况进行观察。在甘露醇氧化钠琼脂的平板上，金黄色葡萄球菌典型菌落的主要特点有：颜色为金黄色、圆形的凸起，外圈存在黄色环，边缘整体，且菌落的直径在0.8mm左右。
其二，实时荧光PCR检测法。在200μl的裂解液中加入5μl的增菌液，其裂解时间为1h，在经过95℃的裂解，以及10分钟的灭活处理后，迅速将裂解液的温度冷却到4℃，并在PCR反应体系中加入30ml的裂解液，立即上机开展PCR反应操作，反应主要包括两个步骤，一是在95℃的温度下预变性2分钟，二是在95℃温度下预变性15秒，随后再在60℃下预变性1分钟，对荧光信号进行收集，并扩增循环重复第二个步骤40次左右，反应的时间为1个半小时左右。
2结果
平板法以及实时荧光PCR法的对阳性样本的检出率均达高达100%，本实验7种加菌药品的培养情况以及目标菌的筛选结果具体如表1所示。
3结论
随着生物学技术及临床检测技术的飞速发展，实时荧光PCR技术在食品安全以及疾病诊断领域的金黄色葡萄球菌的检验中得到了广泛的应用，并取得了理想的效果[3]。在本实验中，笔者选取了具有代表性的两种外用药品膏剂以及液体，在经过人工接种阳性菌之后，以金黄色葡萄球菌生长受到供试品抑制程度的不同为依据，分别应用三种方法来培养增菌。其中，两种检验方法均在7中供试品中检出了金黄色葡萄球菌，且检出率均高达100%，这说明对于某些临床药品中含有的金黄色葡萄球菌，实时荧光PCR技术可起到准确、快速的检测作用。
相比于检测时间为24h至72h的传统平板分离检测法，应用实时荧光PCR技术仅需1h的检测时间即可，极大程度上降低了筛选目标菌的时间。由于在不同环境下，微生物具备不同的形态，因而采取平板分离法具备较高的漏检可能，而荧光PCR法的检测基础为遗传信息，稳定性比较高。同时，平板法需借助检验人员业务水平方能很好鉴定出可疑的菌落形态；而对于荧光PCR法而言，其有效将定性检验转化为了量化荧光信号强度的检验，大大简化了判断实验结果的过程。
综上所述，实时荧光PCR技术具有准确、快速等显著优势，与平板法结合应用，可在快速检验药品金黄色葡萄球菌中发挥出重要作用。
参考文献
[1]袁桂兴，温剑.金黄色葡萄球菌的快速检测方法[J].生物技术通报，2013，23（06）：75-76.
[2]徐德顺，胡霞清.食品中沙门菌实时荧光PCR快速检测方法的研究[J].中国预防医学杂志，2013.9（10）：870-873.
[3]刘婷婷，王鲁华，裴琳.实时荧光PCR技术快速检验药品中金黄色葡萄球菌[J].中国药师，2013，16（06）：922-923.