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[摘 要] 激光共聚焦扫描显微镜是一种领先的实验手段，已经得到了广泛的应用，因此掌握其操作使用方法和进行基本的维护十分重要。介绍了激光共聚焦扫描显微镜系统硬件和软件部分的构成；荧光样品的制备及要求；样品进行普通拍摄时光路、荧光检测通道及图像采集等参数的设置；最后在仪器的维护与管理上提出应保持室内整洁且温湿度适宜，同时在操作使用上应按严格的操作规范进行。
[关 键 词] Zeiss LSM710；激光共聚焦显微镜；操作使用；管理
[中图分类号] TH742 [文献标志码] A [文章编号] 2096-0603（2018）07-0234-02
激光共聚焦扫描显微镜是一种现代化的光学显微镜，它在生物、医学及工业等领域已有广泛的应用。与普通光学显微镜不同的是，它以极细的激光束（点光源）替代传统的汞灯或长效金属卤素灯（场光源）作为激发光，具有良好的汇聚性，且激光束激发的样品区域大大缩小，减少了同一视野内相邻样品之间的发射信号干扰，其分辨力提高了30%～40%。此外，激光共聚焦扫描显微镜在检测器前，焦平面的共轭位置加装Pinhole。由于只有来自焦平面的发射光信号可以在共轭位置汇聚，穿过Pinhole，而来自非焦平面的发射光信号在共轭位置是发散的，绝大部分被Pinhole阻挡，所以检测器只能接收来自焦平面的发射光信号。这样，激光共聚焦扫描显微镜在很大程度上限制了来自非焦平面的信号干扰，大大增强了图像的信噪比。
湖南农业大学园艺园林学院配置的是Zeiss LSM710倒置激光共聚焦显镜。文章以倒置共聚焦显微为例，介绍了其硬软件的构成，荧光样品的制备要求、样品拍摄的参数设置及仪器的维护与管理。
一、激光共聚焦扫描显微镜系统的组成
激光共聚焦扫描显微镜系统由硬件和软件部分组成，其中硬件部分为电动荧光显微镜、扫描检测单元、激光器、电脑工作站，软件部分为ZEN操作分析软件。
（一）显微镜硬件部分
1.激光器。激光器覆盖范围较广，能够满足多种荧光样品成像需求，一般有四种，即近紫外Diode固体激光器405nm、蓝激光Argon多线激光器458/488/514nm、绿激光He-Ne激光器543nm、红激光He-Ne激光器633nm。
2.电动荧光显微镜。电动荧光显微镜分为正置显微镜和倒置显微镜，物镜有低倍和高倍，低倍物镜为5倍、10倍和20倍；高倍物镜为40倍、63倍油镜和100倍油镜。
3.荧光扫描检测器。检测器检测范围为400～800nm，DIC通道1个，而光谱型荧光检测器能在可见光范围一次性全光谱扫描，其通道有34个。
4.电脑工作站。电脑工作站有Real Time PC 和User PC，Real Time PC是硬件与软件间的连接器。
（二）显微镜软件部分
激光共聚焦扫描显微镜软件有ZEN2011软件，ZEN软件分为Zen2011 Black和Zen2011 Blue。电脑开机进入操作系统界面后，双击桌面共聚焦软件ZEN图标，进入ZEN界面，弹出对话框可选择“Start System”和“Image Processing”。“Start System”为初始化整个系统，用于激光扫描取图、分析等。“Image Processing”为不启动共聚焦扫描硬件，用于已存图像数据的处理、分析。
软件的工具栏有不同的主页面，分别为Locate、Acquisition、FCS、Processing和Maintain。Locate主页面用于目镜下观察样品，可以控制显微镜部分的电动元件，方便用户完成样品观察。Acquisition主页面用于图像扫描，包含了扫描图像所需的各种参数设置。FCS主页面只在LSM 780和Confocor中出现，用于荧光相关光谱的检测和分析。Processing主页面包含了软件提供的图像处理工具。
Maintain主页面提供了调节Pinhole位置，设置物镜的工具，可以进行简单的系统维护。
二、荧光样品的制备
激光共聚焦显微镜需要对没有自发荧光的生物样品进行前处理，使其具有荧光标记，再进行检测。获得一份好的荧光标记的样品是拍摄到一张好照片的先决条件，没有好的样品，即使有再高端的设备，再有经验的技术员，也难以顺利地观察到样品的荧光图像。
（一）染料的選择
传统用于荧光标记的染料GFP、EGFP、YFP、DAPI、FM4-64、ECFP、ALexa-488、ALexa-546、ALexa-633等。DAPI和Alexa-405等染料可用405nm激光器观察；GFP、EGFP、YFP、Alexa-488等荧光蛋白可用氩离子激光器观察；RFP、Alexa-546和Cy3等染料可用543nm激光器观察；Alexa-647和Cy5等染料可用633nm激光器观察。
（二）荧光表达载体的构建与导入
通过分子生物学技术可进行荧光蛋白的构建，即通过PCR扩增目的蛋白的cDNA，接入荧光蛋白表达载体的多克隆位点。构建好的荧光表达载体进行大量扩增、纯化、转染并导入培养细胞。
（三）荧光样品制备
荧光样品制备是生物学研究的基本技术和方法，其制备需要一定的过程，制备的顺序分为观察、固定、脱水包埋、切片粘片、通透、封闭、一抗、二抗、复染和封片。固定在样品制备中很重要，固定液的选择应能最好地保持细胞和组织的形态结构，能最大限度地保存抗原的免疫活性，常用的固定液是4%的中性甲醛。对组织样品来说，需脱水包埋，即用石蜡包埋，梯度脱水，如是冷冻切片可直接用OTC包埋。组织样品的切片厚度应根据自己的材料特性决定，粘片时须平整。通透时可用乙醇和丙酮等试剂提高免疫染色效率，增强通透性。封闭可有效降低背景荧光信息，更好地观察所需信号。一抗是整个免疫染色流程的核心，可通过做阳性对照，检测一抗的特异性及摸索出合适的稀释浓度。复染能够确定细胞的位置和结构。最后的封片建议购买商品化的封片剂，盖玻片的厚度和折光率需达标。 三、普通拍摄相关参数设置
（一）光路（channel）设置
对样品的染料组合进行配置是激光共聚焦扫描显微镜成像的第一步。通过打开软件选择Start system，在目镜下找到合适的视野和焦平面后，在Acquisition的smart setup中分别选择染料类型和伪色完成染料的配置。扫描的方法有三种，即最快速扫描（Fastest）、最佳信号扫描（Best signal）和兼顾速度与信号的折中式扫描（Smartest）。如果激光波长不同，可以选择Smartest（Line）模式，可将不同的染料放在不同通道里，减少或避免串色，同时可收集两个通道的信号。
（二）荧光检测通道的调节
光路设置的参数很多，每一个参数都关系到图片成像的质量，因此需要对荧光检测通道进行精细调节。
1.针孔（Pinhole）。针孔阻断聚焦平面以外的信号进入，针孔直径大小的设置很关键。针孔直径越大，被收集到的荧光信号就越多，但收集到样品的非焦面的杂射光也越多，同时样品的成像厚度也随之增厚，得到的信噪比反而不好。因此，在保证图像质量的前提下，针孔一般设置为1AU，在最大程度上屏蔽非焦平面的信号。
2.激光强度。激光强度需设置在合理的范围值，例如，激光488nm、514nm等，参考值在10～20范围内。
3.激光管电压（Gain Master）。激光管电压用于调节图像的亮度和对比度，数值越大，检测PMT上所负荷的电压越高，图像信号越明亮。同时，随着激光管电压的增高，标本容易被漂白或淬灭。而且随着激光管使用寿命的增加，激光的亮度会有所下降。因此，在保证图像质量的前提下，电压值越低越好，一般设置在600～800范围内，最高不要超过850。
4.光电倍增管增益（Digital Gain）。对所有信号进行数码放大，包括来自样品的真实信号和环境背景噪音。电压增大，信号和噪音会增强，电压减小则信号和噪音均减小。原则上，在保证图像质量的前提下，Gain值越小越好，一般设置为数值1.0～1.2。
5.数码降噪和数码增益（Digital Offset）。用以调节图像背景，数值越小，背景越暗。原则上，Digital Offset值越接近0越好。
（三）图像采集参数设置
在图像获取（Acquisition Mode）的参数设置中，图像的分辨率（Frame Size）可设置为512×512或1024×1024；在扫描速度（speed）中，如是单张扫描可将速度设置为数字6或7；层扫或大图拼接可设置为8；Averaging Number可设置为数字2或4。
在图像预览时，可使用Range Indicator检查图像是否过曝，如果出现红色点表示过曝，一般一张图片不允许红色点的出现超过1%；出现蓝色点表示曝光不足；白色点则表示正常。
四、激光共聚焦扫描显微镜的维护与管理
（一）保持室内整洁
激光共聚焦显微镜是极为精细的仪器，为保证良好的成像质量，对室内洁净度要求较高。为保持室内的整洁，应定期对实验室进行净化和除尘，保持室内空气洁净；进入显微镜房的人员应穿着整洁的实验服，更换专用的鞋套或拖鞋。同时应定期打扫实验室，保证工作环境的洁净。每次操作使用完后，应使用防尘罩遮盖显微镜和扫描头。
（二）室内温湿度适宜
显微镜房温湿度需控制在合适的范围，通过安装冷暖空调，保证室内温度常年维持在22℃左右，如果需要做时间序列的实验，在实验期间温度的变化不能超过0.5度/小时。湿度一般控制在40%～60%，当室内温度在摄氏30℃时，相对湿度应低于65%。在南方地区，天气比较潮湿，为了保护光学镜头避免霉变，建议用户配置除湿机。北方用户视要求需要加裝加湿器。
（三）操作使用规范
日常操作严格按照操作规程进行，遵守仪器的开关机流程。激光共聚焦扫描显微镜硬件的开机顺序依次为打开稳压电源、主开关（Main Switch）、荧光显微镜和电脑电源（Systems/PC）、扫描头和激光柜电源（Components）、荧光灯、激光器和电脑电源。在确保激光器充分散热后关机应按着颠倒开机的顺序依次关闭电脑、激光器等。
实验前应准备好刻录光盘，使用刻录光驱刻录图像数据资料，严禁使用U盘拷贝资料。每次操作使用后需对物镜、目镜、聚光镜以及载物台面进行彻底清洁。
参考文献：
[1]李鹏云，曾晓荣.激光扫描共聚焦显微镜技术简介[J].泸州医学院学报，2006，29（5）：469-470.
[2]郗昕，姜泗长，方耀云.激光扫描共聚焦显微镜的原理与生物学应用[J].中国体视学与图像分析，1996，1（Z1）：74-79.
[3]韩卓，陈晓燕，马道荣，等.激光扫描共聚焦显微镜实验技术与应用[J].科教前言，2009（19）：27-28.
[4]边玮.激光共聚焦显微镜样品制备方法[J].电子显微学报，2010，29（4）：399-402.
[5]余礼厚.激光共聚焦显微镜样品制备方法：细胞培养样品[J].电子显微学报，2010，29（2）：185-188.
[关 键 词] Zeiss LSM710；激光共聚焦显微镜；操作使用；管理
[中图分类号] TH742 [文献标志码] A [文章编号] 2096-0603（2018）07-0234-02
激光共聚焦扫描显微镜是一种现代化的光学显微镜，它在生物、医学及工业等领域已有广泛的应用。与普通光学显微镜不同的是，它以极细的激光束（点光源）替代传统的汞灯或长效金属卤素灯（场光源）作为激发光，具有良好的汇聚性，且激光束激发的样品区域大大缩小，减少了同一视野内相邻样品之间的发射信号干扰，其分辨力提高了30%～40%。此外，激光共聚焦扫描显微镜在检测器前，焦平面的共轭位置加装Pinhole。由于只有来自焦平面的发射光信号可以在共轭位置汇聚，穿过Pinhole，而来自非焦平面的发射光信号在共轭位置是发散的，绝大部分被Pinhole阻挡，所以检测器只能接收来自焦平面的发射光信号。这样，激光共聚焦扫描显微镜在很大程度上限制了来自非焦平面的信号干扰，大大增强了图像的信噪比。
湖南农业大学园艺园林学院配置的是Zeiss LSM710倒置激光共聚焦显镜。文章以倒置共聚焦显微为例，介绍了其硬软件的构成，荧光样品的制备要求、样品拍摄的参数设置及仪器的维护与管理。
一、激光共聚焦扫描显微镜系统的组成
激光共聚焦扫描显微镜系统由硬件和软件部分组成，其中硬件部分为电动荧光显微镜、扫描检测单元、激光器、电脑工作站，软件部分为ZEN操作分析软件。
（一）显微镜硬件部分
1.激光器。激光器覆盖范围较广，能够满足多种荧光样品成像需求，一般有四种，即近紫外Diode固体激光器405nm、蓝激光Argon多线激光器458/488/514nm、绿激光He-Ne激光器543nm、红激光He-Ne激光器633nm。
2.电动荧光显微镜。电动荧光显微镜分为正置显微镜和倒置显微镜，物镜有低倍和高倍，低倍物镜为5倍、10倍和20倍；高倍物镜为40倍、63倍油镜和100倍油镜。
3.荧光扫描检测器。检测器检测范围为400～800nm，DIC通道1个，而光谱型荧光检测器能在可见光范围一次性全光谱扫描，其通道有34个。
4.电脑工作站。电脑工作站有Real Time PC 和User PC，Real Time PC是硬件与软件间的连接器。
（二）显微镜软件部分
激光共聚焦扫描显微镜软件有ZEN2011软件，ZEN软件分为Zen2011 Black和Zen2011 Blue。电脑开机进入操作系统界面后，双击桌面共聚焦软件ZEN图标，进入ZEN界面，弹出对话框可选择“Start System”和“Image Processing”。“Start System”为初始化整个系统，用于激光扫描取图、分析等。“Image Processing”为不启动共聚焦扫描硬件，用于已存图像数据的处理、分析。
软件的工具栏有不同的主页面，分别为Locate、Acquisition、FCS、Processing和Maintain。Locate主页面用于目镜下观察样品，可以控制显微镜部分的电动元件，方便用户完成样品观察。Acquisition主页面用于图像扫描，包含了扫描图像所需的各种参数设置。FCS主页面只在LSM 780和Confocor中出现，用于荧光相关光谱的检测和分析。Processing主页面包含了软件提供的图像处理工具。
Maintain主页面提供了调节Pinhole位置，设置物镜的工具，可以进行简单的系统维护。
二、荧光样品的制备
激光共聚焦显微镜需要对没有自发荧光的生物样品进行前处理，使其具有荧光标记，再进行检测。获得一份好的荧光标记的样品是拍摄到一张好照片的先决条件，没有好的样品，即使有再高端的设备，再有经验的技术员，也难以顺利地观察到样品的荧光图像。
（一）染料的選择
传统用于荧光标记的染料GFP、EGFP、YFP、DAPI、FM4-64、ECFP、ALexa-488、ALexa-546、ALexa-633等。DAPI和Alexa-405等染料可用405nm激光器观察；GFP、EGFP、YFP、Alexa-488等荧光蛋白可用氩离子激光器观察；RFP、Alexa-546和Cy3等染料可用543nm激光器观察；Alexa-647和Cy5等染料可用633nm激光器观察。
（二）荧光表达载体的构建与导入
通过分子生物学技术可进行荧光蛋白的构建，即通过PCR扩增目的蛋白的cDNA，接入荧光蛋白表达载体的多克隆位点。构建好的荧光表达载体进行大量扩增、纯化、转染并导入培养细胞。
（三）荧光样品制备
荧光样品制备是生物学研究的基本技术和方法，其制备需要一定的过程，制备的顺序分为观察、固定、脱水包埋、切片粘片、通透、封闭、一抗、二抗、复染和封片。固定在样品制备中很重要，固定液的选择应能最好地保持细胞和组织的形态结构，能最大限度地保存抗原的免疫活性，常用的固定液是4%的中性甲醛。对组织样品来说，需脱水包埋，即用石蜡包埋，梯度脱水，如是冷冻切片可直接用OTC包埋。组织样品的切片厚度应根据自己的材料特性决定，粘片时须平整。通透时可用乙醇和丙酮等试剂提高免疫染色效率，增强通透性。封闭可有效降低背景荧光信息，更好地观察所需信号。一抗是整个免疫染色流程的核心，可通过做阳性对照，检测一抗的特异性及摸索出合适的稀释浓度。复染能够确定细胞的位置和结构。最后的封片建议购买商品化的封片剂，盖玻片的厚度和折光率需达标。 三、普通拍摄相关参数设置
（一）光路（channel）设置
对样品的染料组合进行配置是激光共聚焦扫描显微镜成像的第一步。通过打开软件选择Start system，在目镜下找到合适的视野和焦平面后，在Acquisition的smart setup中分别选择染料类型和伪色完成染料的配置。扫描的方法有三种，即最快速扫描（Fastest）、最佳信号扫描（Best signal）和兼顾速度与信号的折中式扫描（Smartest）。如果激光波长不同，可以选择Smartest（Line）模式，可将不同的染料放在不同通道里，减少或避免串色，同时可收集两个通道的信号。
（二）荧光检测通道的调节
光路设置的参数很多，每一个参数都关系到图片成像的质量，因此需要对荧光检测通道进行精细调节。
1.针孔（Pinhole）。针孔阻断聚焦平面以外的信号进入，针孔直径大小的设置很关键。针孔直径越大，被收集到的荧光信号就越多，但收集到样品的非焦面的杂射光也越多，同时样品的成像厚度也随之增厚，得到的信噪比反而不好。因此，在保证图像质量的前提下，针孔一般设置为1AU，在最大程度上屏蔽非焦平面的信号。
2.激光强度。激光强度需设置在合理的范围值，例如，激光488nm、514nm等，参考值在10～20范围内。
3.激光管电压（Gain Master）。激光管电压用于调节图像的亮度和对比度，数值越大，检测PMT上所负荷的电压越高，图像信号越明亮。同时，随着激光管电压的增高，标本容易被漂白或淬灭。而且随着激光管使用寿命的增加，激光的亮度会有所下降。因此，在保证图像质量的前提下，电压值越低越好，一般设置在600～800范围内，最高不要超过850。
4.光电倍增管增益（Digital Gain）。对所有信号进行数码放大，包括来自样品的真实信号和环境背景噪音。电压增大，信号和噪音会增强，电压减小则信号和噪音均减小。原则上，在保证图像质量的前提下，Gain值越小越好，一般设置为数值1.0～1.2。
5.数码降噪和数码增益（Digital Offset）。用以调节图像背景，数值越小，背景越暗。原则上，Digital Offset值越接近0越好。
（三）图像采集参数设置
在图像获取（Acquisition Mode）的参数设置中，图像的分辨率（Frame Size）可设置为512×512或1024×1024；在扫描速度（speed）中，如是单张扫描可将速度设置为数字6或7；层扫或大图拼接可设置为8；Averaging Number可设置为数字2或4。
在图像预览时，可使用Range Indicator检查图像是否过曝，如果出现红色点表示过曝，一般一张图片不允许红色点的出现超过1%；出现蓝色点表示曝光不足；白色点则表示正常。
四、激光共聚焦扫描显微镜的维护与管理
（一）保持室内整洁
激光共聚焦显微镜是极为精细的仪器，为保证良好的成像质量，对室内洁净度要求较高。为保持室内的整洁，应定期对实验室进行净化和除尘，保持室内空气洁净；进入显微镜房的人员应穿着整洁的实验服，更换专用的鞋套或拖鞋。同时应定期打扫实验室，保证工作环境的洁净。每次操作使用完后，应使用防尘罩遮盖显微镜和扫描头。
（二）室内温湿度适宜
显微镜房温湿度需控制在合适的范围，通过安装冷暖空调，保证室内温度常年维持在22℃左右，如果需要做时间序列的实验，在实验期间温度的变化不能超过0.5度/小时。湿度一般控制在40%～60%，当室内温度在摄氏30℃时，相对湿度应低于65%。在南方地区，天气比较潮湿，为了保护光学镜头避免霉变，建议用户配置除湿机。北方用户视要求需要加裝加湿器。
（三）操作使用规范
日常操作严格按照操作规程进行，遵守仪器的开关机流程。激光共聚焦扫描显微镜硬件的开机顺序依次为打开稳压电源、主开关（Main Switch）、荧光显微镜和电脑电源（Systems/PC）、扫描头和激光柜电源（Components）、荧光灯、激光器和电脑电源。在确保激光器充分散热后关机应按着颠倒开机的顺序依次关闭电脑、激光器等。
实验前应准备好刻录光盘，使用刻录光驱刻录图像数据资料，严禁使用U盘拷贝资料。每次操作使用后需对物镜、目镜、聚光镜以及载物台面进行彻底清洁。
参考文献：
[1]李鹏云，曾晓荣.激光扫描共聚焦显微镜技术简介[J].泸州医学院学报，2006，29（5）：469-470.
[2]郗昕，姜泗长，方耀云.激光扫描共聚焦显微镜的原理与生物学应用[J].中国体视学与图像分析，1996，1（Z1）：74-79.
[3]韩卓，陈晓燕，马道荣，等.激光扫描共聚焦显微镜实验技术与应用[J].科教前言，2009（19）：27-28.
[4]边玮.激光共聚焦显微镜样品制备方法[J].电子显微学报，2010，29（4）：399-402.
[5]余礼厚.激光共聚焦显微镜样品制备方法：细胞培养样品[J].电子显微学报，2010，29（2）：185-188.