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[摘要] 目的 探讨血府逐瘀汤联合神经生长因子对多发性脑梗死的影响。 方法 选用Wistar大鼠，应用微栓子栓塞阻断方法，将大鼠造成多发性脑梗死模型，通过大鼠神经行为学改变和海马组织病理改变来探讨血府逐瘀汤联合神经生长因子对大鼠多发性脑梗死模型的影响。结果 术后7天，治疗组与模型组比较NKB阳性神经元百分率明显增高（t=21.3411，P<0.01）。治疗组术后7天与术后1天比较NKB阳性神经元百分率明显增高（t=3.4943，P<0.01）。结论 血府逐瘀汤联合神经生长因子能有效改善多发性脑梗死大鼠神经行为学及海马组织病理学的改变，是治疗多发性脑梗死的有效方法。
[关键词] 血府逐瘀汤；神经生长因子；多发性脑梗死；大鼠
[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2014）05-32-05
我国的脑血管疾病发病率较高，且发病率呈上升的趋势。其中多发性脑梗死（multiple cerebral infarction，MCI）占有相当大的比重，其临床表现主要为运动和记忆等功能的障碍，使患者生存和生活质量下降。研究其发病机制和治疗方法，对提高人类的生活质量具有重要意义。通过近几年的研究发现，中国传统医学中的活血化瘀法能促进血液循环，使脑部微循环得以改善，还有阻滞神經细胞凋亡和坏死的作用[1]。本实验通过研究血府逐瘀汤和神经生长因子（nerve growth factor，NGF）联合应用对MCI的影响，了解其对中长期神经功能康复的作用，并为MCI的临床治疗提供可靠的理论依据。
1 材料与方法
1.1 动物
选用成年Wistar大鼠50只，清洁级，雄性，体重250～300g。
1.2 药品
血府逐瘀汤（当归9g，生地9g，桃仁12g，红花9g、枳壳6g，赤芍6g、柴胡3g，甘草3g，桔梗6g，川芎5g，牛膝9g），由辽宁中医药大学附属第一医院药剂科提供，每剂约200mL。注射用神经活素（Nerve growth factor for injection，NGF），批号：960401，1000BU/支。
1.3 试剂及器材
所采用的DAB及ABC试剂盒、兔抗NKB、羊兔抗血清均购于Sigma公司；LUZEX-F显微图像分析仪购于松下公司。
1.4 实验方法
1.4.1 实验分组 适应性饲养5d后，随机分为3组：正常对照组10只、模型组20只（术后1d取材10只，术后7dd取材10只）、治疗组20只（术后1d取材10只，术后7d取材10只）。
1.4.2 多发性脑梗死模型制备 腹腔麻醉（按40mL/公斤体重注射1%戊巴比妥钠）后，在甲状软骨的高度做垂直切口（偏左侧），充分暴露左侧颈内动脉与颈外动脉并剥离出颈外动脉；用无损伤显微外科动脉夹在颈总动脉及颈内动脉的远心端进行夹闭；在颈外动脉上，用显微外科直剪做一切口，从远心端向近心端插入静脉留置针并结扎固定，拔出针芯后松开显微外科动脉夹，推入肝素盐水0.2mL（含10肝素单位）及同种属大鼠全血悬浊液0.5mL（25g/L）；注射后，即刻将颈外动脉剪口处的近心端结扎，松开显微外科动脉夹，观察，缝合[2-4]。
1.4.3 术后处理 模型组术后予生理盐水1mL/（100g·d）进行灌胃。治疗组术后予血府逐瘀汤1mL/（100g·d）进行灌胃（按成人体重50kg计算，根据比例Wistar大鼠每100克予1mL，相当于成人一天一剂）；每天一次肌肉注射NGF（NGF1000BU溶于2mL生理盐水）。
1.4.4 取材切片 用4%多聚甲醛固定液对大鼠进行内固定灌注，内固定结束后，端头取出脑组织放入同种固定液中进行后固定4h，然后将切成薄块的脑组织放入20%蔗糖溶液中脱水，在4℃冰箱内保存，直至脑组织薄块沉底，取出用恒冷切片机作冠状位连续冰冻切片[5]。
1.4.5 尼氏染色 用PBS漂洗吹干的冰冻切片3次（5min/次），将切片放入37℃的甲苯胺蓝溶液（10g/L）中，90min后，取出，用蒸馏水冲洗，再用PBS对切片进行漂洗3次（5min/次），梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，并置于光镜下观察。
1.4.6 ABC免疫组织化学染色 用PBS漂洗吹干的冰冻切片3次（5min/次）；室温下，在正常羊血清（1∶50）中孵育10min；倾去血清，加入兔抗NKB抗体（1∶2000），并在4℃冰箱内过夜；用PBS漂洗3次（5min/次）；滴加按1∶40稀释的生物素化抗兔抗体，并在室温孵育60min；再用PBS漂洗3次（5min/次）；滴加HRP标记的卵白素1∶40稀释，在室温孵育60min；用PBS漂洗3次（5min/次）；用DAB成色5min；用PBS终止反应，并漂洗切片3次（5min/次）；梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，并置于光镜下观察。
1.5 图像分析
用显微图像分析仪对大鼠海马CA1区单位面积内存活神经元数及NKB阳性神经元的百分率进行测定。
1.6 统计学分析
所有相关实验数据均用SPSS17.0软件进行统计分析，进行多组间比较，数据以（）表示，采用t检验方法，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 不同时间点各组大鼠海马CA1区单位面积内神经元数量
术后第1天，模型组存活神经元数量较正常对照组明显减少（t=28.9584，P<0.01）；治疗组存活神经元数量较正常对照组也有减少（t=27.5848，P<0.01）；模型组与治疗组之间无显著差异。术后第7天，治疗组与模型组比较存活神经元数量明显增多（t=6.1230，P<0.01）。治疗组术后7d与术后1d比较神经元有明显增多（t=4.1036，P<0.01）。表1。 2.2 不同时间点各组大鼠海马CA1区NKB阳性神经元百分率
术后1d，模型组NKB阳性神经元百分率较正常对照组明显减少（t=26.4986，P<0.01）；治疗组NKB阳性神经元百分率较正常对照组有所减少（t=8.8806，P<0.01）。术后7d，治疗组与模型组比较NKB阳性神经元百分率明显增高（t=21.3411，P<0.01）。治疗组术后7d与术后1d比较NKB阳性神经元百分率明显增高（t=3.4943，P<0.01）。表2
2.3 尼氏染色结果
在尼氏染色切片上，正常对照组大鼠海马CA1区可见到数量较多、排列紧密、形态完整的神经元，泡浆内尼氏体丰富。模型组（1d取材）大鼠海马CA1区切片上，神经元数量减少，模型组（7d取材）大鼠海马CA1区切片上，有少量神经元存活，治疗组（7d取材）与模型组（7d取材）相比，存活神经元数量较多。见图1。
正常对照组可见分布于神经元胞体及其突起的棕褐色NKB阳性反应物，细胞核不着色，细胞形态完整。模型组（7天取材）可见NKB阳性反应物锐减。治疗组（1d取材）大鼠海马CA1区切片上，阳性神经元数量与模型组（1d取材）比较稍多，细胞体呈圆形，突起不明显；治疗组（7d取材）大鼠海马CA1区切片上，神经元胞体呈圆形或者是椭圆形，突起可见。见图2。
3 讨论
中医认为，多发性脑梗死的发病机制是本虚标实，根据“气为血之帅”“血为气之母”，中医药确立了益气补血、活血化瘀、芳香开窍等有效的治疗方法。活血化瘀疗法中的常用方剂是血府逐瘀湯，是由清代医家王清任创制的五大活血化瘀名方之一[6-7]。由当归、生地、桃仁、红花、赤芍、枳壳、柴胡、川芎、桔梗、牛膝、甘草十一味药组成[8]。方药中的桃仁、红花、当归、川芎、赤芍有活血祛瘀的作用；当归、生地有养血化瘀的作用；柴胡、枳壳有疏肝理气的作用；牛膝有破瘀通经、引瘀血下行的作用；桔梗有开肺气的作用，并能引药上行；甘草可以缓急，方中诸药共奏活血调气之功[9]。血府逐瘀汤是由桃红四物汤合四逆散而成，其不仅可以行血分之瘀滞，又可化解气分之郁结，活血而不耗血，袪瘀又可生新，使“血府”之瘀逐去而气机畅通，从而诸证悉除[10]。现代研究发现，血府逐瘀汤还可改善人体微循环、组织器官血氧的含量，增加脑血流量及改善脑代谢，促进肢体功能的恢复，并能降低血液黏稠度，具有抗凝及溶栓等重要作用[11]。
NGF是最早被发现、研究也最为详细的神经营养因子，其具有营养神经元和促进突起生长的双重生物学功能，是神经元生长调节剂，它可以调控中枢及其周围神经元的发育、生长、分化、再生和功能特性的表达[12]。
神经激肽B（neurokinin B，NKB）又称神经介素K，是一种神经肽，与P物质（substance P，SP）和神经激肽A（neurokinin A，NKA）同属于速激肽家族，它们在分子结构与作用上有许多相似之处[13]。 NKB阳性神经元在大鼠中枢神经的分布广泛，如大脑皮层、杏仁核群、嗅球、海马、隔区、间脑、中脑、后脑、脑干和脊髓后角及脊神经节[14]。Jansen等研究发现，NKB能使处于收缩状态的大脑动脉松弛，具有较强的舒张脑内微血管的作用[15]。
实验结果显示MCI时大鼠海马CA1区存活神经元数量明显减少。通过血府逐瘀汤和NGF联合用药进行治疗后，MCI大鼠神经元的损伤缓解，其存活能力增强，NKB免疫阳性神经元得到恢复，对病理损伤的修复效果显著。中西医联合用药治疗MCI可以增加药效并降低治疗成本，而且，中药给药途径简单，副作用极低，长期服用不会造成病理性改变。在实际应用中，血府逐瘀汤还可根据中医辨证进行药物的加减，更切合患者的实际病情。血府逐瘀汤联合NGF具有重要的临床应用价值和经济效益。
[参考文献]
[1] 吕中，王宁，王东坡.益气活血法对缺氧缺血性脑损伤保护作用的实验研究[J].中华中医药学刊，2011，29（7）：1552-1555.
[2] 周郦楠，张晔，张晖.CGRP对多梗死大鼠海马CA4区NPY细胞影响的研究[J].中国实用医药，2010，5（18）：13-14.
[3] 周郦楠，李祈伟，史洪亮，等.多发性脑梗死大鼠海马一氧化氮合酶改变[J].中国临床康复，2005，9（9）：76-77.
[4] 张晔，张艳，周郦楠.多发性脑梗死大鼠乳头体一氧化氮合酶改变[J].中国实用医药，2012，7（6）：37-38.
[5] 包新民，舒思云.大鼠脑立体定位图谱.北京：人民卫生出版社，1991：38-57.
[6] 王玉香，秦荣，李丹，等.血府逐瘀汤的现代应用和实验研究进展[J].辽宁中医药大学学报，2007，9（6）：49-51.
[7] 李君梅，燕明宗.血府逐瘀汤对缺血性脑卒中患者颈动脉粥样硬化的影响[J].中国中医药信息杂志，2009，16（5）：65-66.
[8] 李云龙.血府逐瘀汤信用[J].现代中医药，2006，26（1）：45.
[9] 王倬，王宁，王东坡.血府逐瘀汤对缺血缺氧性脑损伤大鼠的保护作用[J].浙江中医杂志，2009，44（11）：793-795.
[10] 邵淑娟.血府逐瘀汤的临床应用及研究进展[J].北京中医药，2008，27（9）：724-727.
[11] 何洪静，成诗黔，徐贵丽，等.血府逐瘀汤对大鼠血液流变学的影响[J].中国临床医药研究杂志，2003，102：10529-10521.
[12] 张晔，李屹，刘永林，等.血府逐瘀汤联合NGF对大鼠多发性脑梗塞模型海马CA1区神经元影响[J].辽宁中医药大学学报，2013，15（10）：27-29.
[13] 方秀斌，张德林.神经激肽B[J].解剖科学进展，1995，1（1）：49-55.
[14] Warden MK，Young WS.Distribution of cells containing mRNA encoding substance P and neurokinin B in the rat central nervous system[J].J Comp Neurol，1988，272：90.
[15] Jansen I，Alafaci C，Mc-Culloch J，et al.Tachykinins substance P， neurokinin A， neuropeptide K， and neurokinin B in the cerebral circulation I；vasomotor responses in vitro and in situ[J]. J-Cereb-Blood-Flow-Metab，1991，11（4）：567.
（收稿日期：2013-12-03）
[关键词] 血府逐瘀汤；神经生长因子；多发性脑梗死；大鼠
[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2014）05-32-05
我国的脑血管疾病发病率较高，且发病率呈上升的趋势。其中多发性脑梗死（multiple cerebral infarction，MCI）占有相当大的比重，其临床表现主要为运动和记忆等功能的障碍，使患者生存和生活质量下降。研究其发病机制和治疗方法，对提高人类的生活质量具有重要意义。通过近几年的研究发现，中国传统医学中的活血化瘀法能促进血液循环，使脑部微循环得以改善，还有阻滞神經细胞凋亡和坏死的作用[1]。本实验通过研究血府逐瘀汤和神经生长因子（nerve growth factor，NGF）联合应用对MCI的影响，了解其对中长期神经功能康复的作用，并为MCI的临床治疗提供可靠的理论依据。
1 材料与方法
1.1 动物
选用成年Wistar大鼠50只，清洁级，雄性，体重250～300g。
1.2 药品
血府逐瘀汤（当归9g，生地9g，桃仁12g，红花9g、枳壳6g，赤芍6g、柴胡3g，甘草3g，桔梗6g，川芎5g，牛膝9g），由辽宁中医药大学附属第一医院药剂科提供，每剂约200mL。注射用神经活素（Nerve growth factor for injection，NGF），批号：960401，1000BU/支。
1.3 试剂及器材
所采用的DAB及ABC试剂盒、兔抗NKB、羊兔抗血清均购于Sigma公司；LUZEX-F显微图像分析仪购于松下公司。
1.4 实验方法
1.4.1 实验分组 适应性饲养5d后，随机分为3组：正常对照组10只、模型组20只（术后1d取材10只，术后7dd取材10只）、治疗组20只（术后1d取材10只，术后7d取材10只）。
1.4.2 多发性脑梗死模型制备 腹腔麻醉（按40mL/公斤体重注射1%戊巴比妥钠）后，在甲状软骨的高度做垂直切口（偏左侧），充分暴露左侧颈内动脉与颈外动脉并剥离出颈外动脉；用无损伤显微外科动脉夹在颈总动脉及颈内动脉的远心端进行夹闭；在颈外动脉上，用显微外科直剪做一切口，从远心端向近心端插入静脉留置针并结扎固定，拔出针芯后松开显微外科动脉夹，推入肝素盐水0.2mL（含10肝素单位）及同种属大鼠全血悬浊液0.5mL（25g/L）；注射后，即刻将颈外动脉剪口处的近心端结扎，松开显微外科动脉夹，观察，缝合[2-4]。
1.4.3 术后处理 模型组术后予生理盐水1mL/（100g·d）进行灌胃。治疗组术后予血府逐瘀汤1mL/（100g·d）进行灌胃（按成人体重50kg计算，根据比例Wistar大鼠每100克予1mL，相当于成人一天一剂）；每天一次肌肉注射NGF（NGF1000BU溶于2mL生理盐水）。
1.4.4 取材切片 用4%多聚甲醛固定液对大鼠进行内固定灌注，内固定结束后，端头取出脑组织放入同种固定液中进行后固定4h，然后将切成薄块的脑组织放入20%蔗糖溶液中脱水，在4℃冰箱内保存，直至脑组织薄块沉底，取出用恒冷切片机作冠状位连续冰冻切片[5]。
1.4.5 尼氏染色 用PBS漂洗吹干的冰冻切片3次（5min/次），将切片放入37℃的甲苯胺蓝溶液（10g/L）中，90min后，取出，用蒸馏水冲洗，再用PBS对切片进行漂洗3次（5min/次），梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，并置于光镜下观察。
1.4.6 ABC免疫组织化学染色 用PBS漂洗吹干的冰冻切片3次（5min/次）；室温下，在正常羊血清（1∶50）中孵育10min；倾去血清，加入兔抗NKB抗体（1∶2000），并在4℃冰箱内过夜；用PBS漂洗3次（5min/次）；滴加按1∶40稀释的生物素化抗兔抗体，并在室温孵育60min；再用PBS漂洗3次（5min/次）；滴加HRP标记的卵白素1∶40稀释，在室温孵育60min；用PBS漂洗3次（5min/次）；用DAB成色5min；用PBS终止反应，并漂洗切片3次（5min/次）；梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，并置于光镜下观察。
1.5 图像分析
用显微图像分析仪对大鼠海马CA1区单位面积内存活神经元数及NKB阳性神经元的百分率进行测定。
1.6 统计学分析
所有相关实验数据均用SPSS17.0软件进行统计分析，进行多组间比较，数据以（）表示，采用t检验方法，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 不同时间点各组大鼠海马CA1区单位面积内神经元数量
术后第1天，模型组存活神经元数量较正常对照组明显减少（t=28.9584，P<0.01）；治疗组存活神经元数量较正常对照组也有减少（t=27.5848，P<0.01）；模型组与治疗组之间无显著差异。术后第7天，治疗组与模型组比较存活神经元数量明显增多（t=6.1230，P<0.01）。治疗组术后7d与术后1d比较神经元有明显增多（t=4.1036，P<0.01）。表1。 2.2 不同时间点各组大鼠海马CA1区NKB阳性神经元百分率
术后1d，模型组NKB阳性神经元百分率较正常对照组明显减少（t=26.4986，P<0.01）；治疗组NKB阳性神经元百分率较正常对照组有所减少（t=8.8806，P<0.01）。术后7d，治疗组与模型组比较NKB阳性神经元百分率明显增高（t=21.3411，P<0.01）。治疗组术后7d与术后1d比较NKB阳性神经元百分率明显增高（t=3.4943，P<0.01）。表2
2.3 尼氏染色结果
在尼氏染色切片上，正常对照组大鼠海马CA1区可见到数量较多、排列紧密、形态完整的神经元，泡浆内尼氏体丰富。模型组（1d取材）大鼠海马CA1区切片上，神经元数量减少，模型组（7d取材）大鼠海马CA1区切片上，有少量神经元存活，治疗组（7d取材）与模型组（7d取材）相比，存活神经元数量较多。见图1。
正常对照组可见分布于神经元胞体及其突起的棕褐色NKB阳性反应物，细胞核不着色，细胞形态完整。模型组（7天取材）可见NKB阳性反应物锐减。治疗组（1d取材）大鼠海马CA1区切片上，阳性神经元数量与模型组（1d取材）比较稍多，细胞体呈圆形，突起不明显；治疗组（7d取材）大鼠海马CA1区切片上，神经元胞体呈圆形或者是椭圆形，突起可见。见图2。
3 讨论
中医认为，多发性脑梗死的发病机制是本虚标实，根据“气为血之帅”“血为气之母”，中医药确立了益气补血、活血化瘀、芳香开窍等有效的治疗方法。活血化瘀疗法中的常用方剂是血府逐瘀湯，是由清代医家王清任创制的五大活血化瘀名方之一[6-7]。由当归、生地、桃仁、红花、赤芍、枳壳、柴胡、川芎、桔梗、牛膝、甘草十一味药组成[8]。方药中的桃仁、红花、当归、川芎、赤芍有活血祛瘀的作用；当归、生地有养血化瘀的作用；柴胡、枳壳有疏肝理气的作用；牛膝有破瘀通经、引瘀血下行的作用；桔梗有开肺气的作用，并能引药上行；甘草可以缓急，方中诸药共奏活血调气之功[9]。血府逐瘀汤是由桃红四物汤合四逆散而成，其不仅可以行血分之瘀滞，又可化解气分之郁结，活血而不耗血，袪瘀又可生新，使“血府”之瘀逐去而气机畅通，从而诸证悉除[10]。现代研究发现，血府逐瘀汤还可改善人体微循环、组织器官血氧的含量，增加脑血流量及改善脑代谢，促进肢体功能的恢复，并能降低血液黏稠度，具有抗凝及溶栓等重要作用[11]。
NGF是最早被发现、研究也最为详细的神经营养因子，其具有营养神经元和促进突起生长的双重生物学功能，是神经元生长调节剂，它可以调控中枢及其周围神经元的发育、生长、分化、再生和功能特性的表达[12]。
神经激肽B（neurokinin B，NKB）又称神经介素K，是一种神经肽，与P物质（substance P，SP）和神经激肽A（neurokinin A，NKA）同属于速激肽家族，它们在分子结构与作用上有许多相似之处[13]。 NKB阳性神经元在大鼠中枢神经的分布广泛，如大脑皮层、杏仁核群、嗅球、海马、隔区、间脑、中脑、后脑、脑干和脊髓后角及脊神经节[14]。Jansen等研究发现，NKB能使处于收缩状态的大脑动脉松弛，具有较强的舒张脑内微血管的作用[15]。
实验结果显示MCI时大鼠海马CA1区存活神经元数量明显减少。通过血府逐瘀汤和NGF联合用药进行治疗后，MCI大鼠神经元的损伤缓解，其存活能力增强，NKB免疫阳性神经元得到恢复，对病理损伤的修复效果显著。中西医联合用药治疗MCI可以增加药效并降低治疗成本，而且，中药给药途径简单，副作用极低，长期服用不会造成病理性改变。在实际应用中，血府逐瘀汤还可根据中医辨证进行药物的加减，更切合患者的实际病情。血府逐瘀汤联合NGF具有重要的临床应用价值和经济效益。
[参考文献]
[1] 吕中，王宁，王东坡.益气活血法对缺氧缺血性脑损伤保护作用的实验研究[J].中华中医药学刊，2011，29（7）：1552-1555.
[2] 周郦楠，张晔，张晖.CGRP对多梗死大鼠海马CA4区NPY细胞影响的研究[J].中国实用医药，2010，5（18）：13-14.
[3] 周郦楠，李祈伟，史洪亮，等.多发性脑梗死大鼠海马一氧化氮合酶改变[J].中国临床康复，2005，9（9）：76-77.
[4] 张晔，张艳，周郦楠.多发性脑梗死大鼠乳头体一氧化氮合酶改变[J].中国实用医药，2012，7（6）：37-38.
[5] 包新民，舒思云.大鼠脑立体定位图谱.北京：人民卫生出版社，1991：38-57.
[6] 王玉香，秦荣，李丹，等.血府逐瘀汤的现代应用和实验研究进展[J].辽宁中医药大学学报，2007，9（6）：49-51.
[7] 李君梅，燕明宗.血府逐瘀汤对缺血性脑卒中患者颈动脉粥样硬化的影响[J].中国中医药信息杂志，2009，16（5）：65-66.
[8] 李云龙.血府逐瘀汤信用[J].现代中医药，2006，26（1）：45.
[9] 王倬，王宁，王东坡.血府逐瘀汤对缺血缺氧性脑损伤大鼠的保护作用[J].浙江中医杂志，2009，44（11）：793-795.
[10] 邵淑娟.血府逐瘀汤的临床应用及研究进展[J].北京中医药，2008，27（9）：724-727.
[11] 何洪静，成诗黔，徐贵丽，等.血府逐瘀汤对大鼠血液流变学的影响[J].中国临床医药研究杂志，2003，102：10529-10521.
[12] 张晔，李屹，刘永林，等.血府逐瘀汤联合NGF对大鼠多发性脑梗塞模型海马CA1区神经元影响[J].辽宁中医药大学学报，2013，15（10）：27-29.
[13] 方秀斌，张德林.神经激肽B[J].解剖科学进展，1995，1（1）：49-55.
[14] Warden MK，Young WS.Distribution of cells containing mRNA encoding substance P and neurokinin B in the rat central nervous system[J].J Comp Neurol，1988，272：90.
[15] Jansen I，Alafaci C，Mc-Culloch J，et al.Tachykinins substance P， neurokinin A， neuropeptide K， and neurokinin B in the cerebral circulation I；vasomotor responses in vitro and in situ[J]. J-Cereb-Blood-Flow-Metab，1991，11（4）：567.
（收稿日期：2013-12-03）