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【摘要】 目的 体外实验探讨阿司匹林联合氟尿嘧啶对肝癌细胞增殖的影响。方法 实验分对照组、阿司匹林组、氟尿嘧啶组、联合用药组，各组分别以不同剂量药物处理肝癌细胞48小时，CCK-8法检测细胞抑制率，计算两药的联合效应。结果 与对照组相比，阿司匹林单独用药可抑制肝癌细胞的增殖，呈剂量依赖关系（P<0.01）。与氟尿嘧啶组相比，联合用药组可提高对肝癌细胞增殖的抑制作用（P<0.01），呈现相加效应（0.85≤Q≤1.15）。结论 阿司匹林联合氟尿嘧啶能提高对肝癌细胞增殖的抑制作用，具有相加效应。
【关键词】 阿司匹林；氟尿嘧啶；肝癌细胞；细胞增殖
doi：10.3969/j.issn.1004-7484（s）.2013.08.487 文章编号：1004-7484（2013）-08-4510-02
原发性肝癌是一种严重影响人类健康的恶性肿瘤，发病率和死亡率较高。我国是世界上肝癌高发区之一，发病率为20.37/10万，位于常见肿瘤第三位[1]。氟尿嘧啶（fluorouracil，FU）是治疗肿瘤、预防肿瘤复发以及肿瘤复发后化疗最常用的药物之一，以FU为基础制定的化疗方案在临床上得到广泛应用，但是，肝癌对FU具有一定的耐药性，而且FU可以对机体的正常细胞产生严重的毒副作用[2]，大剂量使用FU可以引起肾功能损害及严重的胃肠道反应，从而限制了FU的临床应用及疗效的提高[3]。阿司匹林（acetysalicylic acid，ASA），又名乙酰水杨酸，是常用的非甾体类解热、镇痛药和抗炎药，对胃肠道肿瘤有抑制作用和预防作用[4]。长期服用阿司匹林能有效降低结肠癌等多种恶性肿瘤的发病率，表明其在肿瘤的防治中有广泛的应用前景[5]。目前国内关于阿司匹林联合氟尿嘧啶对肝癌细胞增殖的抑制作用研究未见报道。本研究旨在探讨这两种药物联合应用提高对肝癌细胞增殖的抑制作用，为临床治疗肝癌提供证据。
1 资料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂 小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），DMEM（GIBCO，上海英骏生物有限公司），胰酶细胞消化液（Beyotime），CCK-8試剂盒（碧云天生物技术研究所），阿司匹林（南京都莱生物技术有限公司），氟尿嘧啶注射液（FU，25mg/mL，天津金耀氨基酸有限公司），用无血清培养液稀释至2.5mg/mL备用。
1.1.2 仪器 多功能酶标仪（Biotek），倒置显微镜（OLYMPUS），CO2培养箱（RSBiotech），超净工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）。
1.1.3 细胞株 人肝癌细胞株HepG2，由广东医学院衰老研究所提供。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 将人肝癌细胞置于含10%小牛血清的DMEM培养液中，37℃，饱和湿度，5%CO2培养箱中培养。
1.2.2 阿司匹林和氟尿嘧啶处理肝癌细胞 实验分为对照组、阿司匹林组、氟尿嘧啶组、联合用药组。阿司匹林组中4个剂量终浓度分别是0.5、1、2、4mmol/L。氟尿嘧啶组药物终浓度是0.1mg/mL。联合用药组中氟尿嘧啶药物终浓度均为0.1mg/mL，阿司匹林4个剂量终浓度分别是0.5、1、2、4mmol/L。取对数生长期细胞，每孔5000个细胞接种于96孔板，加入含10%小牛血清的DMEM培养液100μL培养，待细胞贴壁后加入药物。实验组每个剂量设5个复孔，每孔加入5μL相应浓度药液。对照组加相等体积的无血清培养基。培养48h后检测。
1.2.3 CCK-8法测定细胞抑制率 取1.2.2处理后的细胞，采用CCK-8法于450nm波长下测定光吸收值A450，计算细胞抑制率。细胞抑制率=（1-实验组A450/对照组A450）×100%。
1.2.4 阿司匹林和氟尿嘧啶两药相加作用判断 按金（正均）氏公式进行判断[6]。金氏公式为Q=EA+B/（EA+EB-EAEB）。式中EA为阿司匹林单独处理的细胞抑制率，EB为氟尿嘧啶单独处理的细胞抑制率，EA+B为两药联合处理的细胞抑制率：Q<0.85表示两药合用有拮抗作用；Q>1.15表示两药合用有协同作用；0.85≤Q≤1.15表示两药合用有相加作用。
1.2.5 数据处理 实验数据以（χ±s）表示，采用SPSS18.0统计软件进行统计分析，组间差异显著性比较采用t检验，p<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 阿司匹林联合氟尿嘧啶抑制肝癌细胞增殖 与对照组相比，不同浓度阿司匹林可抑制肝癌细胞的增殖，呈剂量依赖性，差异有统计学意义（P<0.01），见表1。与氟尿嘧啶组相比，阿司匹林联合氟尿嘧啶可提高对肝癌细胞增殖的抑制作用（P<0.01），0.85≤Q≤1.15，两药联用具有相加作用，见表2。
3 结 论
本研究表明，阿司匹林和氟尿嘧啶均可抑制体外肝癌细胞生长。不同浓度阿司匹林可抑制肝癌细胞的增殖，随着药物浓度的增加，抑制作用增强。阿司匹林与氟尿嘧啶联合用药可提高对肝癌细胞增殖的抑制作用，具有相加作用。阿司匹林和氟尿嘧啶均能抑制肝癌细胞生长，但两种药物的抗肿瘤机制不同。阿司匹林对肿瘤细胞的影响主要通过抑制环加氧酶-1（COX-1）及环加氧酶-2（COX-2）表达而起作用[7]。COX-l在许多组织均有表达，产生前列腺素从而保护胃黏膜及扩张肾血管。而COX-2过度表达可增加前列腺素E2的合成进而抑制机体的免疫功能，有利于肿瘤细胞的免疫逃逸，还能使自由基活性增加而引起突变，并能促进肿瘤血管生长等一系列促肿瘤作用[8]。氟尿嘧啶对肿瘤细胞的抑制主要是通过体内代谢产生的5-F-dUMP从而抑制DNA的合成[9]。阿司匹林联合氟尿嘧啶抑制肝癌细胞的增殖可能与上述机制有关。联合治疗可使多种药物获得相加作用，产生最大的抑瘤效应，减少用药量，降低不良反应。临床上可通过阿司匹林和氟尿嘧啶联合应用，提高抗癌疗效。
参考文献
[1] 王星刚，刘刚.原发性肝癌的综合治疗方法探讨[J].基层医学论坛，2007，11（15）：695-696.
[2] 陈忠南，徐克前.表观遗传学药物FK228联合氟尿嘧啶对肝癌细胞增殖、凋亡及Fas mRNA表达的影响[J].中南大学学报，2009，34（2）：124-129.
[3] 冯婷，刘霞，赵明耀等.牛膝多糖联合5-氟尿嘧啶对食管癌的作用及相关机制的探讨[J].重庆医科大学学报，2011，36（5）：531-534.
[4] 王美荣，戚之琳.阿司匹林对SMMC-7721人肝癌细胞增殖的影响[J].皖南医学院学报，2010，29（4）：243-245.
[5] Avivi D，Moshkowitz M，Detering E，et al.The role of lowdose aspirin in the prevention of colorectal cancerJ].Expert Opin Ther Targets，2012，16（Suppl 1）：51-62.
[6] 翟晓波，卢爱国.氟尿嘧啶和丝裂霉素联合用药体外药敏试验在大肠癌中的应用[J].中国现代应用药学，2006，23（5）.
[7] 李淑芳.阿司匹林药效学研究进展[J].中国民族民间医药，2012，（1）：31-33.
[8] 江平，刘志苏.阿司匹林对肝癌细胞生长的抑制作用及其机制[J].中华实验外科杂志，2008，25（11）：1391-1393.
[9] 韩玉霞.单吡啶基卟啉-5-氟尿嘧啶化合物的合成及抗癌活性的研究[D].河北省：河北师范大学，2009.
【关键词】 阿司匹林；氟尿嘧啶；肝癌细胞；细胞增殖
doi：10.3969/j.issn.1004-7484（s）.2013.08.487 文章编号：1004-7484（2013）-08-4510-02
原发性肝癌是一种严重影响人类健康的恶性肿瘤，发病率和死亡率较高。我国是世界上肝癌高发区之一，发病率为20.37/10万，位于常见肿瘤第三位[1]。氟尿嘧啶（fluorouracil，FU）是治疗肿瘤、预防肿瘤复发以及肿瘤复发后化疗最常用的药物之一，以FU为基础制定的化疗方案在临床上得到广泛应用，但是，肝癌对FU具有一定的耐药性，而且FU可以对机体的正常细胞产生严重的毒副作用[2]，大剂量使用FU可以引起肾功能损害及严重的胃肠道反应，从而限制了FU的临床应用及疗效的提高[3]。阿司匹林（acetysalicylic acid，ASA），又名乙酰水杨酸，是常用的非甾体类解热、镇痛药和抗炎药，对胃肠道肿瘤有抑制作用和预防作用[4]。长期服用阿司匹林能有效降低结肠癌等多种恶性肿瘤的发病率，表明其在肿瘤的防治中有广泛的应用前景[5]。目前国内关于阿司匹林联合氟尿嘧啶对肝癌细胞增殖的抑制作用研究未见报道。本研究旨在探讨这两种药物联合应用提高对肝癌细胞增殖的抑制作用，为临床治疗肝癌提供证据。
1 资料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂 小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），DMEM（GIBCO，上海英骏生物有限公司），胰酶细胞消化液（Beyotime），CCK-8試剂盒（碧云天生物技术研究所），阿司匹林（南京都莱生物技术有限公司），氟尿嘧啶注射液（FU，25mg/mL，天津金耀氨基酸有限公司），用无血清培养液稀释至2.5mg/mL备用。
1.1.2 仪器 多功能酶标仪（Biotek），倒置显微镜（OLYMPUS），CO2培养箱（RSBiotech），超净工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）。
1.1.3 细胞株 人肝癌细胞株HepG2，由广东医学院衰老研究所提供。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 将人肝癌细胞置于含10%小牛血清的DMEM培养液中，37℃，饱和湿度，5%CO2培养箱中培养。
1.2.2 阿司匹林和氟尿嘧啶处理肝癌细胞 实验分为对照组、阿司匹林组、氟尿嘧啶组、联合用药组。阿司匹林组中4个剂量终浓度分别是0.5、1、2、4mmol/L。氟尿嘧啶组药物终浓度是0.1mg/mL。联合用药组中氟尿嘧啶药物终浓度均为0.1mg/mL，阿司匹林4个剂量终浓度分别是0.5、1、2、4mmol/L。取对数生长期细胞，每孔5000个细胞接种于96孔板，加入含10%小牛血清的DMEM培养液100μL培养，待细胞贴壁后加入药物。实验组每个剂量设5个复孔，每孔加入5μL相应浓度药液。对照组加相等体积的无血清培养基。培养48h后检测。
1.2.3 CCK-8法测定细胞抑制率 取1.2.2处理后的细胞，采用CCK-8法于450nm波长下测定光吸收值A450，计算细胞抑制率。细胞抑制率=（1-实验组A450/对照组A450）×100%。
1.2.4 阿司匹林和氟尿嘧啶两药相加作用判断 按金（正均）氏公式进行判断[6]。金氏公式为Q=EA+B/（EA+EB-EAEB）。式中EA为阿司匹林单独处理的细胞抑制率，EB为氟尿嘧啶单独处理的细胞抑制率，EA+B为两药联合处理的细胞抑制率：Q<0.85表示两药合用有拮抗作用；Q>1.15表示两药合用有协同作用；0.85≤Q≤1.15表示两药合用有相加作用。
1.2.5 数据处理 实验数据以（χ±s）表示，采用SPSS18.0统计软件进行统计分析，组间差异显著性比较采用t检验，p<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 阿司匹林联合氟尿嘧啶抑制肝癌细胞增殖 与对照组相比，不同浓度阿司匹林可抑制肝癌细胞的增殖，呈剂量依赖性，差异有统计学意义（P<0.01），见表1。与氟尿嘧啶组相比，阿司匹林联合氟尿嘧啶可提高对肝癌细胞增殖的抑制作用（P<0.01），0.85≤Q≤1.15，两药联用具有相加作用，见表2。
3 结 论
本研究表明，阿司匹林和氟尿嘧啶均可抑制体外肝癌细胞生长。不同浓度阿司匹林可抑制肝癌细胞的增殖，随着药物浓度的增加，抑制作用增强。阿司匹林与氟尿嘧啶联合用药可提高对肝癌细胞增殖的抑制作用，具有相加作用。阿司匹林和氟尿嘧啶均能抑制肝癌细胞生长，但两种药物的抗肿瘤机制不同。阿司匹林对肿瘤细胞的影响主要通过抑制环加氧酶-1（COX-1）及环加氧酶-2（COX-2）表达而起作用[7]。COX-l在许多组织均有表达，产生前列腺素从而保护胃黏膜及扩张肾血管。而COX-2过度表达可增加前列腺素E2的合成进而抑制机体的免疫功能，有利于肿瘤细胞的免疫逃逸，还能使自由基活性增加而引起突变，并能促进肿瘤血管生长等一系列促肿瘤作用[8]。氟尿嘧啶对肿瘤细胞的抑制主要是通过体内代谢产生的5-F-dUMP从而抑制DNA的合成[9]。阿司匹林联合氟尿嘧啶抑制肝癌细胞的增殖可能与上述机制有关。联合治疗可使多种药物获得相加作用，产生最大的抑瘤效应，减少用药量，降低不良反应。临床上可通过阿司匹林和氟尿嘧啶联合应用，提高抗癌疗效。
参考文献
[1] 王星刚，刘刚.原发性肝癌的综合治疗方法探讨[J].基层医学论坛，2007，11（15）：695-696.
[2] 陈忠南，徐克前.表观遗传学药物FK228联合氟尿嘧啶对肝癌细胞增殖、凋亡及Fas mRNA表达的影响[J].中南大学学报，2009，34（2）：124-129.
[3] 冯婷，刘霞，赵明耀等.牛膝多糖联合5-氟尿嘧啶对食管癌的作用及相关机制的探讨[J].重庆医科大学学报，2011，36（5）：531-534.
[4] 王美荣，戚之琳.阿司匹林对SMMC-7721人肝癌细胞增殖的影响[J].皖南医学院学报，2010，29（4）：243-245.
[5] Avivi D，Moshkowitz M，Detering E，et al.The role of lowdose aspirin in the prevention of colorectal cancerJ].Expert Opin Ther Targets，2012，16（Suppl 1）：51-62.
[6] 翟晓波，卢爱国.氟尿嘧啶和丝裂霉素联合用药体外药敏试验在大肠癌中的应用[J].中国现代应用药学，2006，23（5）.
[7] 李淑芳.阿司匹林药效学研究进展[J].中国民族民间医药，2012，（1）：31-33.
[8] 江平，刘志苏.阿司匹林对肝癌细胞生长的抑制作用及其机制[J].中华实验外科杂志，2008，25（11）：1391-1393.
[9] 韩玉霞.单吡啶基卟啉-5-氟尿嘧啶化合物的合成及抗癌活性的研究[D].河北省：河北师范大学，2009.