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[摘要] 目的 探讨提取萝藦中总皂苷的方法并确定纯化树脂类型并做含量测定，研究其药用价值。 方法 使用乙醇提取萝藦中总皂苷，研究各变量对提取效果的影响，采用正交实验；比较所供四种树脂的吸附力，指标为总皂苷含量，选取最优；以薯蓣皂苷为标准，采用分光光度法，计算萝藦总皂苷的含量。 结果 最优提取方案为，乙醇浓度80%，料液比1∶8，温度70℃，时间1.5 h；D101大孔吸附树脂效果最好；萝藦总皂苷含量为15.9%。 结论 乙醇浓度，提取温度对萝藦皂苷的提取影响较大，优选出的最佳提取工艺条件及纯化总皂苷的方法对萝藦皂苷进一步开发有很好的参考价值。
[关键词] 萝藦；总皂苷；提取工艺；纯化
[中图分类号] R284 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2012）05-38-03
Extraction and purification and content determination of total saponins of japanese metaplexis
TIAN Ye1 GUO Bin2 ZHAI Tiehong3 LI Ying4
1.Liaoning Medical College,Jinzhou 121000,China;2.No.1 Affiliated Hospital of Liaoning Medical College, Jinzhou 121004,Cina;
3.Jinzhou Drug Inspection Offices,Jinzhou 121001,China
[Abstract] Objective To establish the extraction and purification methods for the； To do the preliminary research for pharmacological effects of the total saponins of Japanese Metaplexis. Methods The L9(34)Orthogonal design were used to determine the optimal extraction method.We Choosed the diosgenin saponins as the reference substance,adopt UV spectrophotometric method,410 nm showed color,calculated the content of the total saponins of Japanese Metaplexis.Choose hydrocortisone as the standard substance,using xylene to rat swelling hair method to measure the anti-inflammatory effect. Results The optimal extraction of the total saponins of Japanese Metaplexis was eight times in crude ethanol (concentration is 80%),70℃ref 1.5 hours,15.9% content. Conclusion The ethanol concentration and temperature has great effects on the total saponins of Japanese Metaplexis extraction.The best extraction and purification methods for the total saponins of Japanese Metaplexis further developmenst has a very good reference value.
[Key words] Japanese metaplexis;Total saponins;Extraction;Purification
萝藦科植物种类繁多，全球约有180属，我国境内有44属，分布区域主要是南方，萝藦的主要成分是C21甾体苷、生物碱以及强心苷等[1]。在临床上主治肿瘤、风湿性关节炎等疾病。目前国际上对萝藦科植物研究颇多，也肯定了大部分植物的药理作用，如香加皮主治风寒湿痹，其主要成分是C21甾体类、强心苷类以及醛类[2]，由单保恩等[3]研究的杠柳苷则对食管癌有一定的抑制作用；徐佳丽等[4]研究指出，白首乌提取物可使小鼠的肿瘤细胞凋亡；但关于萝藦有效成分的研究依旧比较空白，不过大量的预实验表明，萝藦内存在一定的皂苷类物质，本课题通过优化萝藦皂苷的提取方法，得到纯度较高的总皂苷，为更深入地研究萝藦的药用价值做基础工作。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
萝藦；大孔吸附树脂AB-8、D101、D3520、D2820四种类型；对照品为薯蓣皂苷；乙醇；低速离心机，水浴锅，干燥箱，电子天平，可见紫外分光光度计。
1.2 实验方法
1.2.1 提取萝藦总皂苷 以萝藦总皂苷含量为指标，考察提取条件对收率的影响。结合相关文献，做L9（34）正交设计，四种提取条件各取3个水平。见表1。
1.2.2 纯化树脂的选择 AB-8、D101、D282 0、D352 0四种树脂做预处理，各称取5 g放入锥形瓶中，各加入总皂苷提取液50 mL，于室温下放置4 h，期间每10 min振摇1次，过滤，测定滤液中萝藦总皂苷浓度，计算4种树脂的吸附率以及吸附量；同时计算相应的解析率。依据公式：树脂的吸附率=（C0-C1）/C0；树脂的吸附量=V0（C0-C1）/W；树脂的解析率=C2/（C0-C1）；其中，C0表示：原溶液总皂苷的浓度；C1表示：经过树脂后皂苷的浓度；C2表示：解析后皂苷的浓度；V0表示：加入原料药的体积；W表示：湿树脂的质量。计算这4种树脂的3项指数并进行评价，选取最优树脂。
1.2.3 萝藦总皂苷含量的测定方法
1.2.3.1 制备标准溶液 精密称取10.0 mg薯蓣皂苷对照品，放入10 mL容量瓶中，稀释液选择乙醇，之后定容至刻度，薯蓣皂苷浓度为1 mg/mL。
1.2.3.2 绘制标准曲线 精密量取对照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，放入编号不同的加热容器中，如试管，在70℃下，将乙醇挥发，加入0.2 mL的香草醛-冰乙酸溶液，浓度为10%，再加入0.5 mL的高氯酸；水浴加热，持续10 min；之后加入冰乙酸稀释。在410 nm处测定吸光度，以薯蓣皂苷标准品溶液浓度（C）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，得回归方程为A=0.012 6C-0.168，相关系数r=0.999 8。
1.2.3.3 样品溶液的测定 量取提取后的萝藦总皂苷溶液10 mL，按照上述方法测定吸光度。再代入回归方程，计算萝藦总皂苷的含量。按照以下公式进行计算含量：A%=m（样品总皂苷）×稀释倍数/m（生药质量）×100%。
2 结果
2.1 单因素试验
2.1.1 乙醇浓度对提取效果的影响 分别取5 g萝藦药品3份，将之分别放入回流设备中，容积500 mL，再加入浓度不同的乙醇100 mL，分别是70%、80%和90%，在80℃下回流提取2 h，将提取液进行离心，转速为每分钟4 000转，持续10 min，过滤定容后测定总皂苷的含量，计算得率。实验数据表明，当乙醇浓度为70%时，得率为2.2%；乙醇浓度为80%时，得率为2.6%；乙醇浓度为90%，得率为1.9%。由此可见，乙醇的浓度越高，萝藦中总皂苷的得率表现的趋势是先升高而后降低，但是在乙醇的浓度为80%的时候萝藦总皂苷的得率最高。
2.1.2 提取时间对提取效果的影响 分别取5 g萝藦药品3份，将之分别放入回流设备中，容积500 mL，分别加入浓度为80%的乙醇100 mL，在80℃下回流，3份样品持续的时间分别为1、1.5、2 h，将提取液进行离心，转速为每分钟4 000转，持续10 min，过滤定容后测定总皂苷的含量，计算得率。
本研究表明提取时间为1.5 h，得率为1.8%；2 h，得率为1.7%；2.5 h，得率为1.5%。可看出与溶剂浓度相反的趋势，即提取时间越长，萝藦中总皂苷的得率反而出现下降的趋势，故萝藦总皂苷的得率在提取时间为1.5 h的时候是最高的。
2.1.3 料液比对提取效果的影响 分别取5 g萝藦药品3份，将之分别放入回流设备中，容积500 mL，分别加入浓度为80%的乙醇，料液比为1∶6、1∶8以及1∶10，在80℃下回流提取1.5 h，分别提取，将提取液进行离心10 min，转速为每分钟4 000转，过滤定容后测定总皂苷的含量并计算得率。
实验数据表明当料液比为1：6时，总皂苷的得率为1.05%，1∶8时为1.6%；1∶10时为1.57%；由此可看出，原料与溶剂体积比越大，萝藦中总皂苷的得率表现的趋势是先升高而后降低，但是在两者之间的比例为1∶8的时候萝藦总皂苷的得率最高。
2.1.4 提取温度对提取效果的影响 分别取5 g萝藦药品3份，将之分别放入回流设备中，容积500 mL，分别加入100毫升浓度为80%的乙醇，分别在60℃、70℃以及80℃下回流提取1.5 h，分别将提取液进行离心10 min，转速为每分钟4 000转，过滤定容后测定总皂苷的含量并计算得率。实验数据表明，60℃时，提取率为1.37%；70℃时为1.41%，80℃时为1.43%。由此可看出，随着温度的不断上升，萝藦中总皂苷的提取效果也呈现出上升的趋势，故选定80℃为提取温度。
2.2 正交实验结果
在以上单因素实验的基础上，对影响萝藦总皂苷提取得率的四个因素进行L9（34）正交实验。由表2可知，在此次研究当中设定的影响因素，经试验结果证明，萝藦总皂苷最佳提取工艺为：A2B1C2D2，即乙醇浓度为80%，提取温度为70℃，料液比为1∶8以及提取时间为1.5 h。
2.3 大孔吸附树脂的评定结果
4种大孔吸附树脂中，D3520树脂的吸附率为65%，比D101树脂的64%要高，但解析率方面则是D101最高，高达97.72%；在这四种吸附树脂中，萝藦总皂苷的吸附量以及解析率在D101树脂中都比较高，所以选择D101为此次研究的吸附树脂。见表3。
2.4 萝藦总皂苷的含量测定结果
采用UV法测定，得到萝藦总皂苷的含量约为15.9%。
2.5 结论
本研究结果显示，本次研究中萝藦总皂苷的最佳提取工艺组是8倍于药材的乙醇，浓度为80%，在70℃的温度下回流1.5 h。此外，使用D101大孔吸附树脂对萝藦总皂苷进行纯化是可行的。此次研究对于萝藦的药用研究有一定的基础价值。
3 讨论
本实验以萝藦全草为提取原料，为了节省溶剂提高效率，萝藦全草须充分搅碎，其中萝藦果实中含絮状易散物质，应在密闭袋中进行粉碎。通过正交试验选取的最佳提取工艺为：乙醇浓度为80%，提取温度为70℃，料液比为1∶8以及提取时间为1.5 h。在提取过程中，要密切注意温度变化，温度不能超过85℃，以防止总皂苷分解为皂苷元，影响含量测定。
[参考文献]
[1] 吴振洁，丁林生，赵守训.鹅绒藤属植物的化学成分和药理作用[J].国外医药（植物药分册），1991，6（4）：147-154.
[2] 王利萍，刘建利.香加皮的化学成分和药理作用研究进展[J].中草药，2009，40（3）：493-496.
[3] 单保恩，赵连梅，何兰欣，等.杠柳苷对人食管癌细胞增殖的抑制作用及与Rb蛋白表达的关系[J].癌变·畸变·突变，2008，20（5）：342-345.
[4] 徐佳丽，厉国强，黄维洁，等.白首乌体外抑制肿瘤细胞成分研究[J].中华中医药学刊，2010，28（2）：416-418.
（收稿日期：2012-02-08）
[关键词] 萝藦；总皂苷；提取工艺；纯化
[中图分类号] R284 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2012）05-38-03
Extraction and purification and content determination of total saponins of japanese metaplexis
TIAN Ye1 GUO Bin2 ZHAI Tiehong3 LI Ying4
1.Liaoning Medical College,Jinzhou 121000,China;2.No.1 Affiliated Hospital of Liaoning Medical College, Jinzhou 121004,Cina;
3.Jinzhou Drug Inspection Offices,Jinzhou 121001,China
[Abstract] Objective To establish the extraction and purification methods for the； To do the preliminary research for pharmacological effects of the total saponins of Japanese Metaplexis. Methods The L9(34)Orthogonal design were used to determine the optimal extraction method.We Choosed the diosgenin saponins as the reference substance,adopt UV spectrophotometric method,410 nm showed color,calculated the content of the total saponins of Japanese Metaplexis.Choose hydrocortisone as the standard substance,using xylene to rat swelling hair method to measure the anti-inflammatory effect. Results The optimal extraction of the total saponins of Japanese Metaplexis was eight times in crude ethanol (concentration is 80%),70℃ref 1.5 hours,15.9% content. Conclusion The ethanol concentration and temperature has great effects on the total saponins of Japanese Metaplexis extraction.The best extraction and purification methods for the total saponins of Japanese Metaplexis further developmenst has a very good reference value.
[Key words] Japanese metaplexis;Total saponins;Extraction;Purification
萝藦科植物种类繁多，全球约有180属，我国境内有44属，分布区域主要是南方，萝藦的主要成分是C21甾体苷、生物碱以及强心苷等[1]。在临床上主治肿瘤、风湿性关节炎等疾病。目前国际上对萝藦科植物研究颇多，也肯定了大部分植物的药理作用，如香加皮主治风寒湿痹，其主要成分是C21甾体类、强心苷类以及醛类[2]，由单保恩等[3]研究的杠柳苷则对食管癌有一定的抑制作用；徐佳丽等[4]研究指出，白首乌提取物可使小鼠的肿瘤细胞凋亡；但关于萝藦有效成分的研究依旧比较空白，不过大量的预实验表明，萝藦内存在一定的皂苷类物质，本课题通过优化萝藦皂苷的提取方法，得到纯度较高的总皂苷，为更深入地研究萝藦的药用价值做基础工作。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
萝藦；大孔吸附树脂AB-8、D101、D3520、D2820四种类型；对照品为薯蓣皂苷；乙醇；低速离心机，水浴锅，干燥箱，电子天平，可见紫外分光光度计。
1.2 实验方法
1.2.1 提取萝藦总皂苷 以萝藦总皂苷含量为指标，考察提取条件对收率的影响。结合相关文献，做L9（34）正交设计，四种提取条件各取3个水平。见表1。
1.2.2 纯化树脂的选择 AB-8、D101、D282 0、D352 0四种树脂做预处理，各称取5 g放入锥形瓶中，各加入总皂苷提取液50 mL，于室温下放置4 h，期间每10 min振摇1次，过滤，测定滤液中萝藦总皂苷浓度，计算4种树脂的吸附率以及吸附量；同时计算相应的解析率。依据公式：树脂的吸附率=（C0-C1）/C0；树脂的吸附量=V0（C0-C1）/W；树脂的解析率=C2/（C0-C1）；其中，C0表示：原溶液总皂苷的浓度；C1表示：经过树脂后皂苷的浓度；C2表示：解析后皂苷的浓度；V0表示：加入原料药的体积；W表示：湿树脂的质量。计算这4种树脂的3项指数并进行评价，选取最优树脂。
1.2.3 萝藦总皂苷含量的测定方法
1.2.3.1 制备标准溶液 精密称取10.0 mg薯蓣皂苷对照品，放入10 mL容量瓶中，稀释液选择乙醇，之后定容至刻度，薯蓣皂苷浓度为1 mg/mL。
1.2.3.2 绘制标准曲线 精密量取对照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，放入编号不同的加热容器中，如试管，在70℃下，将乙醇挥发，加入0.2 mL的香草醛-冰乙酸溶液，浓度为10%，再加入0.5 mL的高氯酸；水浴加热，持续10 min；之后加入冰乙酸稀释。在410 nm处测定吸光度，以薯蓣皂苷标准品溶液浓度（C）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，得回归方程为A=0.012 6C-0.168，相关系数r=0.999 8。
1.2.3.3 样品溶液的测定 量取提取后的萝藦总皂苷溶液10 mL，按照上述方法测定吸光度。再代入回归方程，计算萝藦总皂苷的含量。按照以下公式进行计算含量：A%=m（样品总皂苷）×稀释倍数/m（生药质量）×100%。
2 结果
2.1 单因素试验
2.1.1 乙醇浓度对提取效果的影响 分别取5 g萝藦药品3份，将之分别放入回流设备中，容积500 mL，再加入浓度不同的乙醇100 mL，分别是70%、80%和90%，在80℃下回流提取2 h，将提取液进行离心，转速为每分钟4 000转，持续10 min，过滤定容后测定总皂苷的含量，计算得率。实验数据表明，当乙醇浓度为70%时，得率为2.2%；乙醇浓度为80%时，得率为2.6%；乙醇浓度为90%，得率为1.9%。由此可见，乙醇的浓度越高，萝藦中总皂苷的得率表现的趋势是先升高而后降低，但是在乙醇的浓度为80%的时候萝藦总皂苷的得率最高。
2.1.2 提取时间对提取效果的影响 分别取5 g萝藦药品3份，将之分别放入回流设备中，容积500 mL，分别加入浓度为80%的乙醇100 mL，在80℃下回流，3份样品持续的时间分别为1、1.5、2 h，将提取液进行离心，转速为每分钟4 000转，持续10 min，过滤定容后测定总皂苷的含量，计算得率。
本研究表明提取时间为1.5 h，得率为1.8%；2 h，得率为1.7%；2.5 h，得率为1.5%。可看出与溶剂浓度相反的趋势，即提取时间越长，萝藦中总皂苷的得率反而出现下降的趋势，故萝藦总皂苷的得率在提取时间为1.5 h的时候是最高的。
2.1.3 料液比对提取效果的影响 分别取5 g萝藦药品3份，将之分别放入回流设备中，容积500 mL，分别加入浓度为80%的乙醇，料液比为1∶6、1∶8以及1∶10，在80℃下回流提取1.5 h，分别提取，将提取液进行离心10 min，转速为每分钟4 000转，过滤定容后测定总皂苷的含量并计算得率。
实验数据表明当料液比为1：6时，总皂苷的得率为1.05%，1∶8时为1.6%；1∶10时为1.57%；由此可看出，原料与溶剂体积比越大，萝藦中总皂苷的得率表现的趋势是先升高而后降低，但是在两者之间的比例为1∶8的时候萝藦总皂苷的得率最高。
2.1.4 提取温度对提取效果的影响 分别取5 g萝藦药品3份，将之分别放入回流设备中，容积500 mL，分别加入100毫升浓度为80%的乙醇，分别在60℃、70℃以及80℃下回流提取1.5 h，分别将提取液进行离心10 min，转速为每分钟4 000转，过滤定容后测定总皂苷的含量并计算得率。实验数据表明，60℃时，提取率为1.37%；70℃时为1.41%，80℃时为1.43%。由此可看出，随着温度的不断上升，萝藦中总皂苷的提取效果也呈现出上升的趋势，故选定80℃为提取温度。
2.2 正交实验结果
在以上单因素实验的基础上，对影响萝藦总皂苷提取得率的四个因素进行L9（34）正交实验。由表2可知，在此次研究当中设定的影响因素，经试验结果证明，萝藦总皂苷最佳提取工艺为：A2B1C2D2，即乙醇浓度为80%，提取温度为70℃，料液比为1∶8以及提取时间为1.5 h。
2.3 大孔吸附树脂的评定结果
4种大孔吸附树脂中，D3520树脂的吸附率为65%，比D101树脂的64%要高，但解析率方面则是D101最高，高达97.72%；在这四种吸附树脂中，萝藦总皂苷的吸附量以及解析率在D101树脂中都比较高，所以选择D101为此次研究的吸附树脂。见表3。
2.4 萝藦总皂苷的含量测定结果
采用UV法测定，得到萝藦总皂苷的含量约为15.9%。
2.5 结论
本研究结果显示，本次研究中萝藦总皂苷的最佳提取工艺组是8倍于药材的乙醇，浓度为80%，在70℃的温度下回流1.5 h。此外，使用D101大孔吸附树脂对萝藦总皂苷进行纯化是可行的。此次研究对于萝藦的药用研究有一定的基础价值。
3 讨论
本实验以萝藦全草为提取原料，为了节省溶剂提高效率，萝藦全草须充分搅碎，其中萝藦果实中含絮状易散物质，应在密闭袋中进行粉碎。通过正交试验选取的最佳提取工艺为：乙醇浓度为80%，提取温度为70℃，料液比为1∶8以及提取时间为1.5 h。在提取过程中，要密切注意温度变化，温度不能超过85℃，以防止总皂苷分解为皂苷元，影响含量测定。
[参考文献]
[1] 吴振洁，丁林生，赵守训.鹅绒藤属植物的化学成分和药理作用[J].国外医药（植物药分册），1991，6（4）：147-154.
[2] 王利萍，刘建利.香加皮的化学成分和药理作用研究进展[J].中草药，2009，40（3）：493-496.
[3] 单保恩，赵连梅，何兰欣，等.杠柳苷对人食管癌细胞增殖的抑制作用及与Rb蛋白表达的关系[J].癌变·畸变·突变，2008，20（5）：342-345.
[4] 徐佳丽，厉国强，黄维洁，等.白首乌体外抑制肿瘤细胞成分研究[J].中华中医药学刊，2010，28（2）：416-418.
（收稿日期：2012-02-08）