【摘 要】
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目的 乳腺癌细胞的特征之一是基因组不稳定性,维持基因组稳定性的机制是DNA 损伤应答反应(DDR).在信号传导网络调控下,DDR 通过激活细胞周期检测点(cell cycle checkpoints)以协调DNA 损伤修复并在必要时启动程序性细胞死亡机制来应对DNA 损伤.ATM 是DDR 中的一个关键激酶,激活后的ATM 通过磷酸化一系列下游蛋白启动正常的DDR.Bub3 蛋白在乳腺癌中高表达,
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目的 乳腺癌细胞的特征之一是基因组不稳定性,维持基因组稳定性的机制是DNA 损伤应答反应(DDR).在信号传导网络调控下,DDR 通过激活细胞周期检测点(cell cycle checkpoints)以协调DNA 损伤修复并在必要时启动程序性细胞死亡机制来应对DNA 损伤.ATM 是DDR 中的一个关键激酶,激活后的ATM 通过磷酸化一系列下游蛋白启动正常的DDR.Bub3 蛋白在乳腺癌中高表达,它是形成有丝分裂纺锤体检查点的关键蛋白,其与BUB1、Mad1、Mad2、Mad3 和MPS1 等其他蛋白形成复合物后,附着到每个染色体的动粒上,保证细胞的正确分离,从而维持了基因组的稳定性.鉴于乳腺癌细胞常出现基因组不稳定性,研究ATM-Bub3 信号通路在乳腺癌发生的作用有助于阐述乳腺癌的发病机制,对乳腺癌的研究有重要意义.方法 在乳腺癌MDA-MB-231 细胞系中,通过SILAC 技术研究ATM 的作用底物Bub3,并寻找其磷酸化位点.利用免疫共沉淀技术确认Bub3 与ATM 的相互作用.构建Bub3 磷酸化位点突变体,利用免疫荧光观察突变后Bub3 的定位变化,利用流式细胞仪检测突变后有丝分裂细胞的数目,利用免疫共沉淀检测突变后的Bub3 与Bub1 的结合能力,并通过western 检测H3 的磷酸化,检测Bub1 的活性.结果 ATM 可以在有丝分裂期磷酸化有丝分裂纺锤体检查点蛋白Bub3,并找到其磷酸化位点位于丝氨酸的第135 位,当表达Bub3 磷酸化突变体S135A 后,乳腺癌MDA-MB-231 细胞的纺锤体检测点出现异常,M 期细胞减少并且Bub3 在着丝粒的定位减少,与Bub1 的结合力降低,导致Bub1 活性降低.结论 ATM 可以磷酸化有丝分裂纺锤体检查点蛋白Bub3 的Ser139 位点,以保证Bub1 的在着丝粒上的正常功能,维持了细胞有丝分裂纺锤体检测点,进而维持了细胞的基因组稳定性.
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