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研究背景:工程抗体作为肿瘤防治的新型手段,为肝癌等恶性肿瘤的治疗带来了希望,为了克服目前鼠源性单克隆抗体和人源化单克隆抗体的局限性,全人源全长抗体是治疗性工程抗体的发展方向。目的:构建全人源抗肝癌哺乳动物细胞表面展示全长抗体库,从中筛选、克隆可溶性抗体,为进一步研究及应用奠定基础。方法:通过基因克隆的方法,在载体pc DNA-CH、pc DNA3-CL的基础上重新构建了哺乳动物细胞表面展示载体pc DNA3-CHm和pc DNA3-CLm。为了便于可变区基因的克隆,载体pc DNA3-CHm和pc DNA3-CLm分别引入了酶切位点Nhe I,Cla I。其中载体pc DNA3-CHm的恒定区基因3端同时引入了细胞锚定蛋白(GPI)。应用 RT-PCR的方法,将来源于肝癌患者PBMC的 RNA进行反转录及扩增人重、轻可变区基因,并通过连接将可变区基因插入载体中。通过共转染将重、轻链抗体库转入293T细胞中。利用基因重组技术构建p ET21a(+)-T RX-EGFL7原核表达载体,表达纯化重组蛋白EGFL7,以此作为筛选抗原。应用磁珠细胞分选和细胞ELISA技术,快速鉴定和证实所构建的哺乳动物细胞表面展示全长抗体库的有效性。通过 RT-PCR的方法,克隆抗EGFL7的可变区基因并连入可溶性表达载体,通过转染293T细胞得到可溶性抗体。结果:成功地将抗体库以全长lg G的形式展示在细胞表面,并且通过磁珠细胞分选和细胞ELISA技术,从抗体库中成功地筛选到抗EGFL7全人源全长展示抗体,并进行可溶性抗体的表达及初步研究。结论:全人源哺乳动物细胞表面展示全长抗体库对于快速鉴定和克隆抗肝癌相关基因的人源化单克隆抗体具有良好的应用潜力。