目的:建立多组分生化药转移因子注射剂的反相HPLC和LC-TOF/MS特征图谱测定法,并对来自不同生产企业的57批样品进行测定,确定特征峰的归属,根据所得色谱和质谱特征图谱对企业间原料、工艺差别、企业内工艺稳定性,进行科学合理的评价. 方法:采用Waters XBridge BEH300 C18柱(5um,4.6×250mm);以0.1％ TFA作为流动相A,以0.085％乙腈作为流动相B,梯度洗脱,柱温25℃,流速0.6ml/min,检测波长214nm.采用BrukerESI-microTOF-QⅡ液质联用高分辨质谱质谱仪器, 用前述HPLC特征图谱检测方法,以分流进样(0.6ml/min→0.2ml/min)注入质谱仪;以电喷雾电离(ESI),正离子化模式,进行全扫描一级质谱(full scan)和选择离子全扫描二级质谱(full scan MS/MS)两种方式测定.将获得的高分辨质谱信息(精确到分子量小数点后4位),配合Compass DataAnalysis工作站,SmartFormula软件,对特征图谱中27个典型成分峰进行归属,并与与现有对照品进行比对. 结果:在本文色质谱条件下,3家生产企业,57批次转移因子注射剂的特征图谱中,特征峰数量为15-25个,峰数量及峰面积差异明显(见图1).通过多元统计分析手段,将特征图谱中的特征峰信息以PLS-DA 法建模分析,可显著区分三个企业的转移因子产品(见图2).企业间转移因子注射剂的成分之间存在差异,这可能是由企业间原料、工艺的差异导致;同时,企业内部不同批次的散点分布也较为离散,提示厂家内原料、工艺的稳定性还有待进一步提高.特征图谱中,差异组分对于药效差异的影响,还有待于进一步深入研究,有待作为产品质量控制更为准确的指标.特征图谱结合多元统计分析,对厂家间原料、工艺差别、厂家内工艺稳定性,能够进行科学合理的表征和评价.以HPLC-QTOF/MS的液质联用技术对转移因子注射剂特征图谱中的化合物进行定性推测,结果显示,转移因子注射剂中含有苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸等游离氨基酸类;Glu-Ala,Thr-Ala-Leu-Ala,Glycyl- Threonyl-Glutaminyl-Glutamyl-等多肽结构物质;次黄嘌呤,鸟嘌呤,胞苷,脱氧胞苷,尿苷,腺苷,鸟苷,脱氧胸苷,肌酐,脱氧肌酐等核苷酸类降解产物.苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、胞苷、尿苷、腺苷、鸟苷等7种物质已通过对照品进行确证,其他成分还将进一步进行确证. 结论:本研究通过比较多种液相色谱、质谱参数,建立了反相液相色谱-高精密度时间分辨质谱(HPLC-ESI-microQTOF)转移因子特征图谱色谱测定方法,确证了部分特征峰的结构并把 它们作为转移因子重要的定性定量指标.由研究结果可知,转移因子注射剂由几十种成分组成,成分比较复杂,目前还很难确定或尚待进一步确定哪一组成分具有生物活性或是多组分综合作用的结果.因此用特征图谱分析方法作为本品内在质量的控制方法,能够更好控制转移因子注射剂产品质量.色谱-质谱特征图谱,结合多元统计定性定量分析,为多组分生化药内在质量控制方法提供了新的思路和尝试.