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乙型肝炎病毒(HBV)感染是慢性肝炎、肝硬化、甚至肝癌发病的主要危险因素。热休克蛋白90(Heat shock protein 90,Hsp90)是细胞内重要的分子伴侣,其主要协助新合成的蛋白正确折叠,成功装配,功能稳定以及异常蛋白的降解等过程。有研究表明,Hsp90抑制剂使底物蛋白不能被Hsp90正确折叠,进而促进Hsp90招募E3泛素连接酶泛素化降解Hsp90的底物蛋白。Hsp90抑制剂由于可阻断细胞的生长增殖以及信号传递等功能,已成为癌症药物开发的热点。已有研究表明,Hsp90抑制剂能通过抑制HBV聚合酶与前基因组RNA(pregenomic RNA,pgRNA)相互作用而减少核糖核蛋白(RNP)复合物的形成,进而抑制病毒RNA包装和DNA复制等过程。然而,此研究仅仅在体外水平证明了Hsp90抑制剂对HBV复制过程的影响,在体内水平的相关研究未见报道。另外,此前有研究表明,HBV核心蛋白HBc也是Hsp90的一种底物蛋白,HBc在病毒复制周期和致病中扮演着重要的作用。Hsp90抑制剂是否能通过HBc进而影响HBV的包装及复制尚不清楚。因此,本课题拟探究Hsp90抑制剂通过HBc影响HBV包装和复制的机制,并进一步在HBV转基因小鼠动物水平予以证明。首先,构建Huh7-HBc稳转细胞株,并通过Western Blot验证其表达;Hsp90抑制剂(17AAG)处理Huh7-HBc,Western Blot检测显示17AAG能下调HBc蛋白的表达量,而Real-time qPCR检测表明17AAG对HBc mRNA水平无影响;另外,转染HBx或HBpol突变的HBV全基因证明17AAG以不依赖HBx或HBpol的方式下调HBc蛋白;随后,以亚胺基环己酮(cycloheximide,CHX)处理Huh7-HBc细胞,Western Blot检测显示17AAG可缩短HBc蛋白的半衰期。其次,为了检测17AAG对HBV复制能力的影响,以17AAG处理HepG2.2.15细胞,分别通过Western Blot、1%的琼脂糖凝胶电泳和Real-time qPCR检测细胞中HBc、衣壳蛋白及HBV DNA水平,结果发现17AAG在细胞水平抑制HBV包装和复制。最后,以17AAG处理HBV转基因小鼠,HBV核酸定量检测(PCR-荧光探针法)及HBsAg定量检测表明17AAG能降低转基因小鼠血清中HBV DNA及HBsAg水平;凝胶电泳及免疫组化检测显示17AAG可下调转基因小鼠肝脏中HBc的水平并抑制核衣壳形成;H&E染色发现17AAG对转基因小鼠肝脏的组织形态学无明显影响;Southern Blot检测证明17AAG能抑制转基因小鼠肝脏中HBV复制中间体DNA的合成。通过上述方法本研究发现17AAG在体内可抑制HBV的包装和复制。综上所述,本课题的研究结果证明Hsp90抑制剂17AAG抑制HBc的包装而使平衡趋向于HBc的降解,进而抑制HBV衣壳的形成,从而进一步抑制了HBV的包装及复制等过程。需要提及的是,本研究首次证明了Hsp90抑制剂能抑制HBV转基因小鼠中HBV的包装及复制,为HBV感染的治疗提供了新思路。