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背景:早在20世纪90年代初,已发现在未成熟的肾脏组织区域,威廉姆斯肿瘤会导致肾脏异常分化。在研究中发现,在Wilms肿瘤中有一个基因的表达发生异常,即Wilms Tumor 1（WT1）。WT1首先被确认为Wilms肿瘤的抑癌基因,对于胎儿发育是必不可少,还与包括急性髓细胞性白血病在内的多种肿瘤发生发展有关。在WT1的前体m RNA上会发生2个可变剪接事件,进而产生四个主要的WT1亚型。第一个发生在第五个外显子上,决定了蛋白质中有无17个氨基酸;第二个发生在第九个外显子上,使得蛋白质的第三个与第四个锌指结构之间有无赖氨酸-苏氨酸-丝氨酸（KTS）。由于蛋白质结构上的差异导致了WT1+KTS及WT1-KTS两个亚型对于DNA和RNA有着不同的亲和性,WT1+KTS亚型对于RNA有着较高亲和性,而WT1-KTS亚型对于DNA有着更高的亲和性。在实验室前期工作中发现WT1基因中第九个内含子内有一段嘧啶富集区（命名为Tn序列）,是由32个碱基所组成的。这段序列可以调控WT1+KTS及WT1-KTS两个亚型的表达,即当人为删除这段序列后,由原有的主要表达WT1+KTS转变为WT1-KTS表达为主。因此为了之后的研究,首先在内源水平上,使用CRISPR/Cas9技术在293T的基因组DNA上精确删除了Tn序列,并成功构建了以WT1-KTS亚型表达为主的稳转细胞系,这就为我们接下来的研究提供了基础。现已有报道证明了WT1在调控Ca2+动态平衡中的作用,但其具体发生机制尚不明确。因此延伸扩展到本课题,我们旨在初步探究WT1亚型调控钙离子信号通路以及其行使功能的分子机制。方法:（1）构建包含Tn序列的过表达WT1+KTS质粒,通过慢病毒包装系统感染细胞,在293T-d Tn细胞系（通过CRISPR/Cas9技术精确删除Tn序列导致以WT1-KTS亚型表达为主）中恢复WT1+KTS亚型的表达,构建稳转细胞系;（2）将293T细胞、293T-d Tn细胞、在293T-d Tn细胞内回转WT1+KTS亚型的稳转细胞株送RNA样品进行RNA测序,分析RNA-Seq数据结果,对差异表达基因进行GO分析;（3）结合转录因子预测网站,筛选启动子区域与WT1-KTS亚型有预测结合位点的基因,缩小筛选范围;（4）检测差异表达基因在RNA水平和蛋白质水平的表达量,筛选表达变化明显且符合RNA测序数据分析中的变化趋势的基因;（5）对筛选出的潜在下游靶基因所翻译形成的蛋白质通过免疫荧光技术检测在细胞水平上的定位;（6）利用Calcium Imaging技术,通过孵育钙离子探针,钙离子内流后,这种金属螯合物可以和细胞内钙离子结合,在494/516 nm下激发荧光,在加入TRPV4的特异激活剂后使TRPV4通道蛋白打开,细胞外钙离子流入细胞内,因此显微镜下可观察到不同强弱的荧光强度。结果:（1）过表达WT1+KTS亚型的质粒后,原本以WT1-KTS亚型表达为主的293T-d Tn细胞表达发生改变,变成以WT1+KTS亚型表达为主;（2）在RNA-Seq数据和GO数据分析中,发现大量的差异表达基因;（3）通过转录因子预测网站,检测到共有63个基因的启动子区与WT1-KTS亚型有结合位点,其中23个基因有1个预测结合位点,21个基因有2个预测结合位点,10个基因有3个结合位点,而超过3个结合位点的基因有9个基因;（4）因此针对这9个差异表达基因进行下一步检测,通过PCR及Western Blot检测基因表达水平,发现TRPV4基因的表达有变化并符合RNA-Seq数据的趋势,接下来的研究将针对TRPV4展开;（5）免疫荧光实验结果显示TRPV4的蛋白定位于细胞膜上;（6）经过基因编辑技术改造的293T细胞,即293T-d Tn细胞中荧光显示的流入细胞内的钙离子浓度明显弱于正常293T细胞及回转WT1+KTS亚型的细胞。结论:WT1-KTS亚型调控钙离子通道蛋白TRPV4的表达抑制胞外钙离子内流,进而起到抑制钙离子参与的信号通路的作用。