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目的:以慢病毒为载体构建稳定表达乙型肝炎病毒X基因(HBV X)的HL7702细胞株,探讨HBV X稳定表达对HL7702细胞线粒体结构和功能的影响。方法:首先根据In-Fusion技术原理设计克隆引物,采用PCR技术从真核质粒pc DNA3.1-X中扩增出含HBV X基因DNA全长片段,用In-Fusion交换酶将PCR产物与线性化慢病毒载体质粒连接,经PCR、测序、质粒表达检测鉴定。将构建成功的重组慢病毒质粒PLOV.CMV.e GFP.2A.3×Flag&HBx.EF1a.Pura与包装质粒ps PAX2、包膜质粒p MD2.G三质粒瞬时共转染293T细胞以包装慢病毒颗粒,慢病毒颗粒的滴度采用荧光定量PCR的方法检测。包装好的重组慢病毒颗粒感染HL7702细胞,并经过嘌呤霉素筛选获得稳定表达HBV X的细胞株HL7702/HBx,并经过RT-PCR和Western-blot实验证实HL7702/HBx细胞内有HBV X稳定持续的表达。以半定量RT-PCR方法和Western-blot方法检测细胞色素C氧化酶III(COXIII)表达水平变化,酶动力学方法检测线粒体细胞色素C氧化酶活性,流式细胞术检测细胞内ROS水平和线粒体跨膜电位,利用激光扫描共聚焦显微镜采集荧光信号观察COXIII与HBV X蛋白(HBx)在肝细胞HL7702内的定位,扫描电镜下观察HL7702/HBx细胞线粒体超微结构的改变。结果:成功构建表达3×Flag&HBx融合基因的重组慢病毒表达载体,经293T细胞包装和浓缩后,重组慢病毒滴度为8.61×107IU/ml。慢病毒感染HL7702细胞后经嘌呤霉素药物筛选,得到稳定表达HBx的新细胞株HL7702/HBx,经RT-PCR和Western-blot分析结果显示HL7702/HBx细胞能够持续稳定表达HBx。HBx在细胞浆和细胞核中表达,而细胞浆中HBx可分布于线粒体,并与COXIII共定位表达。扫描电镜下发现稳定表达HBx的细胞线粒体较空白对照组和空载对照组线粒体脊稍肿胀,细胞形态及结构无明显改变。半定量RT-PCR实验结果发现COXIII m RNA表达水平无明显改变,Western-blot实验结果表明HL7702/HBx细胞内COXIII蛋白表达上调,线粒体细胞色素C氧化酶活性水平升高,同时也发现细胞内ROS水平上升,而线粒体跨膜电位没有发生明显改变。结论:成功构建稳定表达HBx的细胞株HL7702/HBx。细胞浆中HBx可定位于线粒体并与COXIII相互作用,通过转录后水平调节COXIII表达,从而提高线粒体细胞色素C氧化酶活性和细胞内ROS水平,导致线粒体脊稍肿胀,但不改变线粒体跨膜电位和细胞形态。