论文部分内容阅读
研究背景:胃癌是世界上最常见的消化系统肿瘤,全球居民身体健康受到严重威胁。据2020年最新全球癌症统计数据显示,胃癌的发病率和死亡率在消化系统肿瘤中均居于第五位[1]。当前,早期胃癌常用的治疗方法有内镜下切除、放化疗、免疫治疗和分子靶向治疗等。由于胃癌早期筛查效率普遍低下易导致手术治疗错过最佳时期;放化疗副作用大,易产生化疗耐药性;免疫治疗优势人群的筛选指标过多,应用范围有限;分子靶向治疗则存在脱靶效应、价格昂贵等弊端,因此寻找新的有效治疗靶点及生物学标志物对胃癌患者的早期诊断和预后情况评估至关重要[2-4]。近年研究表示,在多种肿瘤如胶质母细胞瘤、卵巢癌、宫颈癌等恶性进程中,葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基（Glucose-6-phsophatase,catalytic subunit,G6PC）发挥促癌基因的作用[5-8]。但G6PC在胃癌中的作用尚不明确。研究目的:研究G6PC基因对胃癌细胞体内外增殖和转移的作用,并探讨可能的分子机制。材料与方法:1.数据库分析:1)采用Ka Plan-Meier Plotter数据库检索G6PC表达与胃癌患者生存情况之间的关系;2)通过STRING数据库检索与G6PC相关的信号通路。2.体外实验:1)蛋白免疫印迹实验检测正常胃黏膜细胞和胃癌细胞系中G6PC蛋白的表达水平;通过慢病毒转染技术构建G6PC沉默稳转胃癌细胞系HGC-7901、BGC-823,蛋白免疫印迹实验验证沉默效果;2)噻唑蓝（3-（4,5-Dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT）、5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2’-deoxyuridine,EDU）实验检测G6PC基因沉默对胃癌细胞增殖能力的影响;应用平板克隆实验验证G6PC基因沉默对细胞集落形成能力的影响;3)划痕愈合实验和Transwell小室实验检测G6PC基因沉默对细胞迁移能力和侵袭能力的影响;4)通过蛋白免疫印迹实验检测G6PC基因沉默后,血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）蛋白的表达水平,并且通过微血管形成实验验证人脐静脉血管内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）的血管形成能力;5)免疫荧光检查上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transformation,EMT）相关蛋白E-cadherin、Vimentin的表达差异;6)通过蛋白免疫印迹实验检测G6PC基因沉默后对细胞EMT的相关标志物、蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Protein kinase B/Mammalian target of rapamycin,AKT/m TOR）信号通路相关蛋白的改变,并加入PI3K激动剂740Y-P进行功能回复实验。3.体内实验:将G6PC沉默和对照组胃癌细胞分别接种在Balb/c裸鼠皮下,构建胃癌移植瘤模型,并检测G6PC基因沉默对移植瘤形成和生长影响。结果:1.G6PC高表达与胃癌患者的不良预后相关:Ka Plan-Meier Plotter数据库检索表明,G6PC高表达的胃癌患者预后较差。2.G6PC基因沉默抑制胃癌细胞增殖:成功构建G6PC沉默胃癌稳转细胞株HGC-7901、BGC-823,通过细胞活性增殖实验、平板克隆实验和EDU细胞增殖实验证明,与Con-sh组相比,Sh-G6PC组胃癌细胞的增殖活力、克隆形成能力和DNA复制能力均受到抑制。3.G6PC基因沉默抑制胃癌细胞迁移及侵袭能力、血管形成和EMT进程:通过划痕愈合实验、Transwell小室及微血管形成实验证明,与Con-sh组相比,Sh-G6PC组胃癌细胞迁移能力及侵袭能力明显下降,血管形成能力也受到抑制;蛋白免疫印迹实验表明,上皮经典标志物E-cadherin和紧密连接蛋白ZO-1的表达明显上调,间质标志物Vimentin、转录因子Slug蛋白、基质金属蛋白酶（Matrix Metalloprotein,MMP）家族MMP-9和MMP-2蛋白的表达下调。4.G6PC介导PI3K/AKT/m TOR信号通路抑制胃癌细胞增殖和转移:蛋白免疫印迹实验结果显示,G6PC基因沉默后,AKT、m TOR、4EBP1蛋白的磷酸化受到明显抑制;当加入PI3K通路激动剂740Y-P后,G6PC沉默对胃癌细胞EMT进程及PI3K通路的抑制作用被明显逆转。5.G6PC基因沉默可显著抑制胃癌裸鼠皮下移植瘤的生长:胃癌异种移植瘤模型结果表明,G6PC沉默基因可抑制胃癌移植瘤的形成,并同时降低肿瘤形成的体积。结论:1.G6PC基因沉默能够抑制胃癌细胞体内外的恶性增殖。2.G6PC基因沉默通过逆转EMT进程和血管形成来调控胃癌细胞的侵袭及转移。3.G6PC基因沉默对胃癌细胞表型的抑制作用可能与PI3K/AKT/m TOR信号通路失活相关。