[研究背景]胰腺癌是胰腺恶性肿瘤中最常见的一种,具有高度侵袭性,早期诊断是改善胰腺癌预后的根本途径。目前的胰腺癌诊断技术包括肿瘤标志物检测、常规影像学检查、内镜技术等,在诊断早期胰腺癌方面的作用有限。若要实现真正意义上的早期诊断,必须从细胞和分子水平上发现并诊断胰腺癌,因此分子影像学技术是解决胰腺癌早期诊断问题的根本方法。为实现胰腺癌的分子影像诊断,本课题根据胰腺癌细胞膜及细胞内均有网格蛋白-1(plectin-1)的表达,而且在细胞膜上为特异性表达的特征,提出新型胰腺癌PET显像方法,即以可与plectin-1特异性结合的多肽KTLLPTP(PTP)为靶向性配体,以放射性核素18F为标记信号,制备分子探针18F-PTP,并以寡肽(-GGEEE-)为间臂连接多聚阳离子载体聚乙烯亚胺(PEI),合成复合物探针18F-PTP/PEI,用于PET显像诊断胰腺癌。该分子影像显像方法的理论基础为通过多肽PTP的靶向作用,实现18F-PTP/PEI和胰腺癌细胞膜plectin-1的特异性结合；借助PEI的细胞转导作用进入细胞与细胞内plectin-1结合,使大量的18F-PTP滞留于细胞内；实现细胞膜与细胞内分子靶向的叠加,并且避免探针的解离和洗脱,通过分子靶向与细胞转导双重作用提高靶／非靶比值,有利于PET显像检出早期胰腺癌。该分子影像显像方法是分子靶向与细胞转导的联合设计,是分子影像的创新模式。本课题拟通过活体外的细胞学、病理学实验,活体内的荧光成像实验、小动物PET/CT显像实验,验证该显像方法的可行性。如果这种新型胰腺癌PET显像方法得以实现,不仅能解决胰腺癌的早期诊断问题,并有助于胰腺癌的靶向治疗,同时可为其它实体瘤的靶向诊断和治疗提供可借鉴的方法。[实验目的]1.固相合成法制备靶向胰腺癌多肽PTP,对其进行纯化和鉴定,为分子探针的制备及未来临床应用奠定基础；合成荧光分子探针FAM-PTP,对其进行纯化和鉴定,并通过体外细胞学、病理学实验及动物断层荧光成像验证PTP的胰腺癌靶向性,探讨PTP作为探针配体的可行性；合成复合物探针FAM-PTP/PEI,为制备放射性核素标记复合物探针18F-PTP/PEI确定最佳合成条件,并通过体内外细胞学、病理学实验及动物断层荧光成像实验验证,借助载体PEI的细胞转导功能是否有助于提高肿瘤显像的灵敏度。2.手工合成放射性核素标记中间体N-琥珀酰亚胺-4-18F-氟苯甲酸酯(18F-SFB),按照手工合成的最佳反应条件编辑模块合成程序,实现自动化合成18F-SFB;合成放射性核素分子探针18F-PTP及复合物探针18F-PTP/PEI,通过体外稳定性、体内药代动力学测定以及荷胰腺癌裸鼠的Micro-PET/CT显像研究,探讨分子探针18F-PTP及复合物探针18F-PTP/PEI用于胰腺癌诊断的可行性,评价载体PEI是否有助于提高PET显像的灵敏度。[实验方法]1.分子探针FAM-PTP及FAM-PTP/PEI的合成、鉴定(1)多肽PTP的合成、纯化和鉴定为方便复合物探针FAM-PTP/PEI和18F-PTP/PEI的合成,直接将连接间臂寡肽(-GGEEE-)接于PTP的羧基端,全序列为：氨基端(N端)-KTLLPTPGGEEE-羧基端(C端)。以Rink树脂为载体,配合Fmoc氨基保护策略,固相合成多肽PTP。首先将C端第一个氨基酸即谷氨酸(Glu, E)的主链羧基以共价键的形式与树脂相连,然后以谷氨酸的氨基为合成起点,使其与第二位谷氨酸的主链羧基发生酰化反应,形成肽键；同样的方法从羧基端(C端)至氨基端(N端)依次添加氨基酸,完成多肽连接反应后,用三氟乙酸将目的多肽从树脂上裂解下来。合成产物经高效液相色谱(HPLC)分离、纯化、分析,并进行质谱分析鉴定。(2)荧光分子探针FAM-PTP的合成、纯化及鉴定在合成多肽PTP的终末,即最后一位氨基酸赖氨酸缩合反应完成后,氨基端赖氨酸的ε-NH2脱保护、活化,并与荧光素FAM共价连接,完成连接反应后,以三氟乙酸为主切割试剂将目的肽段从树脂上裂解下来。合成产物经高效液相色谱(HPLC)分离、纯化、分析,并进行质谱分析鉴定。(3)复合物探针FAM-PTP/PEI合成、鉴定以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)为交联剂,连接FAM-PTP和PEI (25kDa),二者比例为20：1,所得复合物探针FAM-PTP/PEI溶液4℃冰箱保存。茚三酮显色反应验证FAM-PTP和PEI是否连接成功。2.分子探针FAM-PTP及FAM-PTP/PEI体内外生物学功能的评价(1)免疫组化实验检测Plectin-1蛋白在人胰腺癌组织的表达；体外实验验证FAM-PTP可与人胰腺癌组织结合自病理科获得人胰腺癌组织石蜡切片,经常规脱蜡、微波修复、BSA封闭后,每张切片加入鼠抗人Plectin-1抗体50微升,37℃孵育2小时；甩去PBS,加入生物素标记山羊抗鼠IGg,50微升,37℃孵育40分钟,加入辣根酶标记的亲和素工作液,37℃孵育40分钟,PBS冲洗三次,DAB显色,苏木素复染10分钟,脱水封片,显微镜观察,照片；取与免疫组化实验所用石蜡切片的相邻层面切片,经常规脱蜡、微波修复、BSA封闭后,每张加入FAM-PTP PBS溶液(2x10-4mg/mL)50微升,避光孵育30分钟,PBS冲洗三次,倒置荧光显微镜观察,照片；相邻层面的免疫组化照片与荧光显微镜照片融合,验证FAM-PTP的靶点是否为Plectin-1蛋白。(2)荧光探针FAM-PTP、FAM-PTP/PEI与胰腺癌PANC-1细胞的体外结合实验复苏常规培养胰腺癌PANC-1细胞,至细胞处于对数生长期时,用新鲜制备含荧光分子探针FAM-PTP和FAM-PTP/PEI的细胞培养基溶液,荧光分子浓度均为60μM,常规细胞培养条件下孵育PANC-1细胞,置于倒置荧光显微镜下观察活细胞内荧光素的分布,流式细胞仪分析相对细胞荧光强度,并考察荧光探针浓度及细胞孵育时间对细胞摄取的影响。(2)分子探针FAM-PTP、FAM-PTP/PEI靶向胰腺癌的动物显像实验常规方法建立胰腺癌PANC-1皮下移植瘤裸鼠模型15只,当肿瘤直径超过0.5cm时,随机取出12只作为实验动物,再随机分为两组,每组6只。经裸鼠尾静脉分别注射FAM-PTP、FAM-PTP/PEI (1mM,150μl),1h后脱颈处死裸鼠,置于-80℃冰箱迅速冷冻30min,用切片机进行冠状断层切片,将动物切片平放于干净的玻璃平皿上,用荧光显像仪进行显像,观察肿瘤及各脏器的荧光摄取情况,测量比较两组肿瘤的荧光摄取量。显像后分离各组织脏器,置于-80℃冰箱迅速冷冻30min,制作冰冻切片,经DAPI复染后,倒置荧光显微镜下观察绿色荧光分布。3.分子探针18F-PTP及18F-PTP/PEI的合成、鉴定(1)放射性核素标记中间体18F-SFB的合成、纯化及鉴定按文献方法手工合成放射性核素标记中间体18F-SFB,探索合成反应的最佳条件。采用GE模块TRACERlab FXFN亲核氟化反应合成系统进行自动合成18F-SFB,按照手工合成的最佳反应条件编辑模块合成程序,在模块中加入各种反应试剂后开启程序,自动合成生产18F-SFB,得到产品后采用TLC, HPLC测放射化学纯度,活度计测放射性活度,计算放化产率。(2)放射性核素分子探针18F-PTP、18F-PTP/PEI的合成、体外稳定性及体内药代动力学的测定中间体18F-SFB溶解在50μL乙腈中,加入100μgPTP(溶于200μL pH值为8.5的0.1M硼砂—硼酸缓冲液),室温下反应30min。反应液过滤后通过HPLC分离,收集tR=18～19.5min的峰,所得产物溶液,旋转蒸干,重新用0.9%的NaCl注射液溶解,得到目标产物化合物18F-PTP,经Radio-TLC, Radio-HPLC表征,并考察pH值、温度、反应时间对标记率的影响,确定最佳反应条件。按荧光复合物探针FAM-PTP/PEI的制备方法偶联18F-PTP和PEI。测定两个探针37℃时在PBS及小牛血清中的稳定性；测定两个探针在昆明种小白鼠活体内的生物分布及药代动力学参数。4.荷胰腺癌裸鼠的Micro-PET/CT显像研究常规方法建立胰腺癌PANC-1皮下移植瘤裸鼠模型15只,当肿瘤直径超过0.5cm时,随机取出12只作为实验动物,再随机分为两组,每组6只。经裸鼠尾静脉分别注射200μCi18F-PTP和18F-PTP/PEI,1h后用异氟醚麻醉,进行Micro-PET/CT静态显像,利用Inveon Research workplace (IRW2.2)工作站进行数据处理,PET数据经CT衰减校正后利用滤波反投影法,重建冠状面、横断面、矢状面断层图像进行分析,并与CT图像进行融合,手动勾画肿瘤感兴趣区,工作站自动计算SUVave。[实验结果]1.分子探针FAM-PTP及FAM-PTP/PEI的合成、鉴定(1)多肽PTP的合成、纯化和鉴定固相合成的PTP为白色粉末,经HPLC分析纯度为98.3%,经质谱分析鉴定主峰分子量为1270.6,与理论分子量1270.5相符,提示合成正确,可以标记荧光素及放射性核素制备分子探针。(2)荧光分子探针FAM-PTP的合成、纯化及鉴定固相合成的]FAM-PTP为淡黄色粉末,经HPLC分析纯度为98.1%,经质谱分析鉴定主峰分子量为1628.7,与理论分子量1629.7相符,提示合成正确,荧光分子探针FAM-PTP可用于体内外的验证实验。(3)复合物探针FAM-PTP/PEI合成、鉴定及细胞毒性测定茚三酮显色反应证实PEI的自由氨基由于FAM-PTP的结合而明显减少,证明FAM-PTP已成功接枝到PEI链上；细胞毒性试验(MTT法)结果表明FAM-PTP可有效降低PEI的细胞毒性。2.分子探针FAM-PTP及FAM-PTP/PEI体内外生物功能的评价(1)免疫组化实验检测Plectin-1蛋白在人胰腺癌组织的表达；体外实验验证PTP可与人胰腺癌组织结合免疫组化实验：低倍镜下免疫组化染色阳性细胞在组织中呈弥漫性分布,高倍镜下细胞膜与细胞质均见棕黄色颗粒,证实人胰腺癌组织高表达Plectin-1。荧光分子探针FAM-PTP与人胰腺癌组织的结合实验：低倍镜下绿色荧光在组织中呈弥漫性分布,高倍镜下细胞膜与细胞质均见明显绿色荧光,证实靶向肽PTP可与人胰腺癌组织特异性结合,并且其分布与Plectin-1一致。(2)荧光探针FAM-PTP、FAM-PTP/PEI与胰腺癌PANC-1细胞的体外结合实验荧光显微镜观察：FAM-PTP组PANC-1细胞膜上出现绿色荧光,细胞质中仅见少量绿色荧光；FAM-PTP/PEI组PANC-1细胞膜和细胞质中均出现绿色荧光,提示该探针不但可与细胞膜结合,而且可以在PEI的细胞转导作用下,进入细胞内。流式细胞仪分析：随着探针浓度的增加及孵育时间的延长,FAM-PTP组细胞荧光强度先逐渐增强,达到一定强度后,出现饱和现象；而FAM-PTP/PEI组细胞荧光强度持续增强,本实验设置的探针浓度内未出现饱和现象。说明载体PEI的细胞转导功能可以提高胰腺癌细胞对分子探针的摄取。(3)荧光分子探针FAM-PTP、FAM-PTP/PEI靶向胰腺癌的动物显像实验荷胰腺癌裸鼠冠状断层切片荧光成像显示：FAM-PTP、FAM-PTP/PEI两组肿瘤组织均见明显绿色荧光分布,FAM-PTP/PEI组肿瘤荧光亮度高于FAM-PTP组；两组肌肉、皮肤及肠道中可见中等绿色荧光,其他组织仅见少量绿色荧光。定量比较两组肿瘤的荧光摄取值：FAM-PTP组肿瘤荧光摄取值为(3273.50±901.68), FAM-PTP/PEI组肿瘤荧光摄取值为(6634.83±662.08),两组肿瘤荧光摄取值有显著性差异(t=-7.360；P<0.001)。冰冻切片的荧光显微镜观察结果与冠状断层切片显像结果相似。3.分子探针18F-PTP及18F-PTP/PEI的合成、鉴定(1)放射性核素标记中间体18F-SFB的合成、纯化及鉴定实现了模块Tracerlab FXFN自动合成生产18F-SFB,整个过程约为50min,产物18F-SFB经TLC扫描,测得产品Rf=0.79,与冷合成参比物SFB的Rf值0.80一致；HPLC分析结果也与冷合成产物SFB一致,并且未出现其他放射性杂质峰；经分析18F-SFB的放射化学纯度大于99%。(2)放射性核素分子探针18F-PTP、18F-PTP/PEI的合成,体外稳定性及体内药代动力学的测定多肽与18F-SFB的偶联反应依赖于pH、温度、反应时间的设定,最佳参数为：温度42℃,18F-SFB溶于50μL乙腈,100μg多肽溶于150μL pH8.5的硼酸缓冲液,反应30min。经Radio-TLC, Radio-HPLC表征,证实多肽PTP与18F-SFB的偶联成功,18F-PTP产物的放化纯度高于98%。按荧光复合物探针FAM-PTP/PEI的制备方法合成复合物探针18F-PTP/PEI。根据最终产物的活度,加入适量体积的医用0.9%NaCl注射溶液,配成2μCi/μL的18F-PTP和18F-PTP/PEI溶液,pH值为7.0-7.4,外观无色、透明、澄清。经Radio-TLC测定两个探针在PBS及小牛血清中稳定性都较好,240min后其放射化学纯度仍保持在80%以上。18F-PTP和18F-PTP/PEI在小鼠体内的药代动力学符合简单的二室模型,应用评价药物动力学软件计算得出药物动力学参数：分布相半衰期分别为1.98min、2.75min,清除相半衰期分别为15.48min、23.62min,说明这两个探针在血液中的清除速度较快,可降低血液本底,有利于提高显像效果。4.荷胰腺癌裸鼠的Micro-PET/CT显像研究荷胰腺癌裸鼠的18F-PTP和18F-PTP/PEI Micro-PET/CT显像结果与动物断层荧光成像实验相似。两组肿瘤组织均见明显放射性浓聚影,并且后者明显高于前者；肠道及肾脏的摄取值较高,表明18F-PTP和18F-PTP/PEI主要经肝胆及泌尿系统代谢；心脏、肺的摄取值很低,表明18F-PTP和18F-PTP/PEI血液中清除快；脑未见放射性分布,表明18F-PTP和18F-PTP/PEI可能无法通过血脑屏障。定量比较两组肿瘤的SUVave:18F-PTP组肿瘤SUVave为(4.37±0.93),18F-PTP/PEI组肿瘤SUVave为(6.88±1.10),两组肿瘤SUVave有显著性差异(t=-4.274；P<0.01)。[结论]1.本研究采用固相合成法制备了高纯度的靶向多肽PTP,经高效液相色谱(HPLC)分离、纯化后,其纯度为98.3%；用荧光素FAM标记多肽PTP,合成了荧光分子探针FAM-PTP,经高效液相色谱(HPLC)分离、纯化后,其纯度为98.3%；并构建了复合物分子探针FAM-PTP/PEI,茚三酮显色反应证实FAM-PTP/PEI构建成功。2.体外细胞学实验证实荧光探针FAM-PTP可与胰腺癌PANC-1细胞结合,但仅少量进入肿瘤细胞内,而FAM-PTP/PEI在PEI的细胞转导作用下,可以进入肿瘤细胞内。荷胰腺癌裸鼠的荧光生物分布实验证实分子探针FAM-PTP在活体内可与胰腺癌组织特异性结合,具有胰腺癌靶向性；PEI的细胞转导作用可在活体内进一步提高胰腺癌组织对FAM-PTP的摄取。3.根据手工探索的最佳反应条件,采用模块Tracerlab FXFN自动合成生产18F-SFB,放射化学纯度大于99%,整个过程约为50min,该方法可得到居里当量的中间体,并且对操作人员的照射剂量低,为进一步的临床应用奠定了基础。制备了放射性核素标记分子探针18F-PTP及复合物探针18F-PTP/PEI,并确定了最佳反应条件,体外稳定性、体内药代动力学测定表明这两个探针均可用于活体的显像实验。4.荷胰腺癌裸鼠的Micro-PET/CT显像研究实验表明分子探针18F-PTP在活体内特异性靶向胰腺癌组织,可用于PET显像诊断胰腺癌；并且复合物探针18F-PTP/PEI通过PEI的细胞转导作用可进一步提高PET显像的灵敏度。