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急性髓系细胞性白血病是造血干细胞异常的恶性疾病。与正常造血干细胞平衡的增殖分化过程相比,急性髓系白血病造血干细胞因持续增殖而失去进一步分化成各类血细胞的能力。近年来在急性髓系白血病的发病机理研究中,越来越多的证据表明除了控制造血干细胞增殖分化凋亡通路的基因(主要包括信号传递分子和转录因子)的突变,微环境对造血干细胞的增殖分化以及迁移也有重要影响。越来越多的研究者认为造血干细胞需要特定的微环境来维持其干细胞状态,一旦离开该特定微环境或者特定微环境发生改变,造血干细胞则会转向增殖分化的状态。造血干细胞的特定微环境主要由基质细胞(可分为间充质干细胞,成骨细胞,成脂肪细胞,血管内皮细胞和成纤维细胞)和细胞外基质组成。微环境中许多组分都被发现可以调控造血干细胞的功能,例如成骨细胞被报道可以控制龛的大小,被认为是造血干细胞微环境的关键组成部分。最近骨髓间充质干细胞也被发现是构成造血干细胞微环境的重要成分,该类间充质干细胞缺失的小鼠骨髓中造血干细胞数量减少而且归巢能力也有损伤。骨髓间充质干细胞更可进一步分化为成骨和成脂肪细胞,因此骨髓间充质干细胞的分化能力也是影响造血干细胞微环境的因素。除了增殖分化外,造血干细胞的归巢能力会影响临床上干细胞移植的效果,而造血干细胞微环境中组成细胞的粘附分子被认为与归巢能力有关,其中当然也包括间充质干细胞和其分化而成的各种细胞。因此间充质干细胞与急性髓系白血病可能有相关性。然而关于临床上急性髓系白血病患者的骨髓间充质干细胞的特征/分化能力/粘附分子表达情况的报道很少。因此我们分析了急性髓系白血病患者来源的骨髓间充质干细胞的特征和成脂肪成骨能力,并用Real-time PCR的方法检查了相关基因与粘附蛋白的表达,与非骨髓病变的非霍奇金淋巴瘤患者和正常对照进行比较,为进一步研究间充质干细胞在造血干细胞微环境维持上的功能和急性髓系白血病病理研究提供临床上的数据结果。第一部分急性髓系白血病和非霍奇金淋巴瘤患者骨髓间充质干细胞特征及成脂肪成骨分化能力比较目的比较急性髓系白血病患者与非骨髓病变的非霍奇金淋巴瘤患者和正常骨髓来源的骨髓间充质干细胞特征和的成脂肪、成骨分化能力,以及相关分化基因的表达分析,以探索其在骨髓造血干细胞微环境和急性髓系白血病病理中的功能。方法急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)患者共10例,男性6例,女性4例,19-60岁,中位年龄44岁。其中M2四例,M3一例,M4两例,M5一例,M6一例,未分类一例,均经骨髓像、流式细胞术免疫分型及染色体、融合基因等检查明确诊断。非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma, NHL)患者共10例,男性7例,女性3例,34-77岁,中位年龄50岁。其中8例B细胞性淋巴瘤,2例T细胞性淋巴瘤,均经病理检查诊断明确。骨髓正常对照3例,均为男性,19-33岁,中位年龄26岁。选择每例患者髂后上嵴处抽出骨髓2.5ML注入EDTA抗凝管中,5ML DPBS稀释骨髓液,加入3.5ML Ficoll分离液中,2000rpm离心20min,吸取中间交界面单个核细胞层,贴壁培养得到梭形骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, MSCs)。流式细胞仪鉴定MSCs阳性表面标记CD105、CD73、CD90,阴性表面标记CD45。培养液诱导法诱导MSCs成脂肪成骨分化,并于第14天染色。AML, NHL患者和对照组取诱导成骨、成脂肪之前和第3、7天为时间点,提取mRNA,进行Real-timePCR检测成脂肪基因脂蛋白酯酶基因(Lipoprotein lipase, LPL),成骨基因骨桥蛋白基因(Osteopontin, OPN)。结果来源于AML患者/NHL患者/正常对照的MSCs培养在相同培液中,原代培养时MSCs呈现纺锤形形态且有部分圆形悬浮细胞,AML患者细胞形态与其它两组相比更呈现不规则形态,分支增加,有不少扁圆形细胞。培养四代后的三组细胞都呈现相似的长梭形形态。流式细胞分选显示细胞表面MSCs标记CD105、CD73、CD90呈阳性,而细胞表面非MSCs标记CD45呈阴性。三组细胞脂肪诱导后,第3天只有AML组看到有脂滴出现。第7天AML组脂滴数高于其他两组。14天油红O染色显示三组没有区别。脂蛋白酯酶LPL是常用的脂肪细胞标志基因。RT-PCR结果显示,AML组和NHL组诱导之后第三天和第七天都显著上升。未诱导前,AML患者比NHL患者成脂肪基因LPL表达显著增加(p<0.05),而与正常对照之间则没有显著差别；成脂肪诱导后后的第3天,第7天三组间的LPL的表达没有区别。另一方面,AML患者与正常对照各个时间点都没有显著区别。成骨诱导后,14天的成骨的染色AML患者弱于其他两组,但成骨基因OPN的表达在三组之前和各个时期都没有区别。结论AML患者的MSCs原代培养时形态更不规则。成脂肪诱导之前LPL表达显著增加,诱导之后AML组更早出现脂滴,早期脂滴数量更多。成骨诱导14天成骨染色AML组弱于其他两组。第二部分急性髓系白血病和非霍奇金淋巴瘤患者骨髓间充质干细胞粘附分子表达水平比较及临床意义目的分析急性髓系白血病患者与非白血病的非霍奇金淋巴瘤患者和正常对照来源的骨髓间粘附分子的表达水平和诱导分化后的变化,以探索其在骨髓造血干细胞微环境和急性髓系白血病病理中的功能。方法急性髓系白血病患者共10例,男性6例,女性4例,19-60岁,中位年龄44岁。其中M2四例,M3一例,M4两例,M5一例,M6一例,未分类一例,均经骨髓像、流式细胞术免疫分型及染色体、融合基因等检查明确诊断。非霍奇金淋巴瘤患者共10例,男性7例,女性3例,34-77岁,中位年龄50岁。其中8例B细胞性淋巴瘤,2例T细胞性淋巴瘤,均经病理检查诊断明确。骨髓正常对照3例,均为男性,19-33岁,中位年龄26岁。选择每例患者髂后上嵴处抽出骨髓2.5ML注入EDTA抗凝管中,5ML DPBS稀释骨髓液,加入3.5ML Ficoll分离液中,2000rpm离心20min,吸取中间交界面单个核细胞层,贴壁培养得到梭形MSCs。流式细胞仪鉴定MSCs阳性表面标记CD105、CD73、CD90,阴性表面标记CD45。培养液诱导法诱导MSCs成脂肪成骨分化,AML, NHL患者和正常对照取诱导成骨、成脂肪之前和第3、7天为时间点,提取mRNA,进行Real-time PCR检测粘附分子E-Cadherin/N-Cadherin。结果未诱导前,AML患者、NHL患者粘附分子和对照组E-cadherin表达无显著差别。成脂肪诱导后,AML患者第3天,第7天E-cadherin的表达显著降低(p<0.05)；第3天AML患者E-cadherin的表达显著小于对照组。成骨诱导后第7天NHL患者和对照组的E-cadherin的表达显著增高(p<0.05)。第7天AML患者E-cadherin的表达显著高于对照组。与此相对的是N-Cadherin的表达在各个时期各组之间都没有区别。结论AML患者在成脂肪诱导后E-cadherin表达显著降低,在第3天AML患者E-cadherin的表达显著小于对照组；成骨诱导后第7天NHL患者和对照组的E-cadherin的表达显著降低。而第7天AML患者E-cadherin的表达显著高于对照组。综上所述,本研究发现：AML患者的MSCs原代培养时形态更不规则。成脂肪诱导之前LPL表达显著增加,诱导之后AML组更早出现脂滴,早期脂滴数量更多。成骨诱导14天成骨染色AML组弱于其他两组。AML患者在成脂肪诱导后E-cadherin表达显著降低,在第三天AML患者E-cadherin的表达显著小于对照组；成骨诱导后第7天NHL患者和对照组的E-cadherin的表达显著降低。第7天AML患者E-cadherin的表达显著高于对照组。