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目的:本课题深入研究制首乌有效成分大黄素在抗动脉粥样硬化方面的作用机制，并以Apo E-/-小鼠为研究对象，观察大黄素对动脉粥样硬化模型中mTOR信号通路和炎症因子单核细胞趋化因子-1(MCP-1)以及干扰素γ(IFN-γ)的调控作用。
方法:将72只成年雄性Apo E-/-小鼠普食适应性喂养一周后随机分成6组:AS模型组、制首乌大黄素高、中、低剂量组、阳性对照组和大黄素中剂量+雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)组，每组12只。正常对照组为C57BL/6J小鼠12只。使用高脂饲料膳食法进行Apo E-/-小鼠动脉粥样硬化建模。除正常对照组外，其他6组用高脂饲料(21％猪油，0.15％胆固醇，78.85％基础饲料)饲养9周，并每隔1天腹部皮下注射脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)25g每只。成模后停止LPS注射,并每组随机处死一只小鼠，进行主动脉及肝脏HE染色，确定成模。从第10周起，基于高脂饮食，大黄素高、中、低剂量组分别按照40mg·kg-1、20mg·kg-1、10mg·kg-1灌服大黄素，阳性对照组按200mg·kg-1灌服血脂康，大黄素中剂量+雷帕霉素组(联合用药组)给予20mg·kg-1大黄素以及腹部皮下注射雷帕霉素1mg·kg-1,正常对照组小鼠给予正常饮食并灌服生理盐水。所有药物体积均为0.5mL，持续给药6周后取材。小鼠禁食不禁水12h后称重，处死。采取摘眼球取血法，每只小鼠取血1mL左右，静置，离心，分装血清，测量血清中血脂TC、TG、LDL-C和HDL-C的浓度。ELISA法测定血清中炎性因子MCP-1、IFN-γ水平含量。取小鼠主动脉近心端2cm进行切片HE染色，并在显微镜下进行病理观察。用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)法检测心肌组织中MCP-1、IFN-γ、mTOR mRNA的表达，并检测通路上游因子磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)mRNA的表达。用Western Blot法检测心肌组织中mTOR、p-mTOR、PI3K、AKT蛋白表达。
结果:1)小鼠取材称重，结果显示:正常对照组、制首乌大黄素各剂量组、阳性组、联合用药组与AS模型组比较,小鼠取材时,体重均小于模型组(P＜0.01)。2)比色法测吸光度并计算得到血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C水平含量，结果显示:正常对照组、制首乌大黄素各剂量组、阳性对照组、联合用药组与AS模型组比较，TC、TG、LDL-C的水平均有不同程度下降(P＜0.01),HDL-C的水平显著升高(P＜0.01)。3)ELISA法检测血清MCP-1、IFN-γ结果显示:与模型组比较，正常对照组、大黄素各剂量组、阳性对照组、联合用药组MCP-1水平明显降低(P＜0.01)，且差异显著;IFN-γ水平总体明显升高(P＜0.01)。4)HE染色切片镜下观察，大黄素高、中剂量组和联合用药组能有效的改善动脉粥样硬化的发生发展，延缓斑块的形成，而低剂量的效果并不明显。5)实时荧光定量PCR检测MCP-1、IFN-γ、mTOR、PI3K、AKT mRNA表达，结果显示:正常对照组、大黄素各剂量组、阳性对照组、联合用药组与模型组进行比较，心肌组织中MCP-1mRNA水平明显降低(P＜0.01)，IFN-y mRNA水平升高(P＜0.01);mTOR、PI3K、AKT mRNA水平降低(P＜0.05)，其中大黄素低剂量组中mTOR、AKT mRNA水平变化无统计学差异。6)Westermn Blot检测心肌组织中mTOR、p-mTOR、PI3K和AKT蛋白的表达。结果显示，与模型组进行比较，除大黄素低剂量组和阳性对照组外，mTOR蛋白表达水平明显降低(P＜0.01);除大黄素高剂量组、阳性对照组、联合用药组外，p-mTOR蛋白表达水平明显低于模型组(P＜0.01);PI3K蛋白除大黄素低剂量组、阳性对照组、联合用药组外，与模型组进行比较，表达水平明显降低(P＜0.01);与模型组相.比，只有大黄素高剂量组AKT蛋白的表达水平明显降低(P＜0.01)。
结论:一定剂量下制首乌大黄素对Apo E-/-小鼠动脉粥样硬化模型的病变有显著影响，其机制可能与抑制mTOR信号通路有关。还与其能调控此通路相关因子，并阻止炎症反应的蔓延有关。
方法:将72只成年雄性Apo E-/-小鼠普食适应性喂养一周后随机分成6组:AS模型组、制首乌大黄素高、中、低剂量组、阳性对照组和大黄素中剂量+雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)组，每组12只。正常对照组为C57BL/6J小鼠12只。使用高脂饲料膳食法进行Apo E-/-小鼠动脉粥样硬化建模。除正常对照组外，其他6组用高脂饲料(21％猪油，0.15％胆固醇，78.85％基础饲料)饲养9周，并每隔1天腹部皮下注射脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)25g每只。成模后停止LPS注射,并每组随机处死一只小鼠，进行主动脉及肝脏HE染色，确定成模。从第10周起，基于高脂饮食，大黄素高、中、低剂量组分别按照40mg·kg-1、20mg·kg-1、10mg·kg-1灌服大黄素，阳性对照组按200mg·kg-1灌服血脂康，大黄素中剂量+雷帕霉素组(联合用药组)给予20mg·kg-1大黄素以及腹部皮下注射雷帕霉素1mg·kg-1,正常对照组小鼠给予正常饮食并灌服生理盐水。所有药物体积均为0.5mL，持续给药6周后取材。小鼠禁食不禁水12h后称重，处死。采取摘眼球取血法，每只小鼠取血1mL左右，静置，离心，分装血清，测量血清中血脂TC、TG、LDL-C和HDL-C的浓度。ELISA法测定血清中炎性因子MCP-1、IFN-γ水平含量。取小鼠主动脉近心端2cm进行切片HE染色，并在显微镜下进行病理观察。用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)法检测心肌组织中MCP-1、IFN-γ、mTOR mRNA的表达，并检测通路上游因子磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)mRNA的表达。用Western Blot法检测心肌组织中mTOR、p-mTOR、PI3K、AKT蛋白表达。
结果:1)小鼠取材称重，结果显示:正常对照组、制首乌大黄素各剂量组、阳性组、联合用药组与AS模型组比较,小鼠取材时,体重均小于模型组(P＜0.01)。2)比色法测吸光度并计算得到血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C水平含量，结果显示:正常对照组、制首乌大黄素各剂量组、阳性对照组、联合用药组与AS模型组比较，TC、TG、LDL-C的水平均有不同程度下降(P＜0.01),HDL-C的水平显著升高(P＜0.01)。3)ELISA法检测血清MCP-1、IFN-γ结果显示:与模型组比较，正常对照组、大黄素各剂量组、阳性对照组、联合用药组MCP-1水平明显降低(P＜0.01)，且差异显著;IFN-γ水平总体明显升高(P＜0.01)。4)HE染色切片镜下观察，大黄素高、中剂量组和联合用药组能有效的改善动脉粥样硬化的发生发展，延缓斑块的形成，而低剂量的效果并不明显。5)实时荧光定量PCR检测MCP-1、IFN-γ、mTOR、PI3K、AKT mRNA表达，结果显示:正常对照组、大黄素各剂量组、阳性对照组、联合用药组与模型组进行比较，心肌组织中MCP-1mRNA水平明显降低(P＜0.01)，IFN-y mRNA水平升高(P＜0.01);mTOR、PI3K、AKT mRNA水平降低(P＜0.05)，其中大黄素低剂量组中mTOR、AKT mRNA水平变化无统计学差异。6)Westermn Blot检测心肌组织中mTOR、p-mTOR、PI3K和AKT蛋白的表达。结果显示，与模型组进行比较，除大黄素低剂量组和阳性对照组外，mTOR蛋白表达水平明显降低(P＜0.01);除大黄素高剂量组、阳性对照组、联合用药组外，p-mTOR蛋白表达水平明显低于模型组(P＜0.01);PI3K蛋白除大黄素低剂量组、阳性对照组、联合用药组外，与模型组进行比较，表达水平明显降低(P＜0.01);与模型组相.比，只有大黄素高剂量组AKT蛋白的表达水平明显降低(P＜0.01)。
结论:一定剂量下制首乌大黄素对Apo E-/-小鼠动脉粥样硬化模型的病变有显著影响，其机制可能与抑制mTOR信号通路有关。还与其能调控此通路相关因子，并阻止炎症反应的蔓延有关。