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金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)是一类应用广泛的昆虫病原真菌,在昆虫防治中起着重要作用。病原真菌主要以孢子侵染昆虫,菌株的产孢能力是菌株选育时的重要参数。迄今为止,对于杀虫真菌农药生产直接相关的产孢机制的研究只有很少的报道。包括绿僵菌在内的大多数的丝状真菌是在由菌丝分化出来的分生孢子梗上形成分生孢子即正常产孢。本研究发现金龟子绿僵菌(M. anisopliae)CQMa102在SYA固体培养基上可以进行微循环产孢——孢子萌发后不经过菌丝阶段直接产孢。这种微循环产孢的特点是接种后孢子在培养基上产生大量似酵母状粘性孢子。为了研究微循环产孢的分子机制,本研究以金龟子绿僵菌(M. anisopliae)菌株CQMa102为研究材料对微循环产孢进行了比较系统的研究。首先对绿僵菌CQMa102的微循环产孢培养基进行了筛选,确定了一种适合金龟子绿僵菌CQMa102微循环产孢的培养基。在此基础上构建了绿僵菌微循环产孢时期的均一化全长cDNA文库和富集微循环产孢相关基因的差减文库,并对差减文库进行了筛选。最后用生物信息学的方法对得到的ESTs(Expression Sequence Tag)进行了分析。主要研究结果如下:①利用数码生物显微镜观察CQMa102在不同培养基上的产孢过程。在SYA培养基上发现了微循环产孢现象。②对绿僵菌的这两种不同的产孢方式进行比较,发现无论是在产孢总量还是产孢速度方面微循环产孢都优于正常产孢。③采用DSN(duplex-specific nuclease)均一化技术与SMARTTM (switching mechanism at 5′end of RNA transcript)建库技术相结合的方法,成功构建了绿僵菌菌株CQMa102微循环产孢时期的均一化全长cDNA文库。④以微循环产孢时期的绿僵菌为实验方(tester)以正常产孢时期的绿僵菌菌丝为驱动方(driver),利用抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization, SSH)的方法构建了绿僵菌CQMa102微循环产孢时期的差减文库。⑤对差减文库中的1600个克隆进行了斑点杂交筛选和Reverse Northern dot blot筛选,得到400个阳性克隆,测序后得到340条质量较好的ESTs,代表285条非冗余ESTs。⑥在GenBank上用BLASTx对其进行序列同源性比对。结果表明109条ESTs编码产物与己知蛋自质序列同源性较低或找不到任何同源序列,231条ESTs与数据库中已知蛋白序列有明显的同源性,其中119条ESTs编码蛋白的功能未知。112条己知功能的同源ESTs涉及多种代谢和应答过程,如蛋白质合成加工、细胞代谢、RNA代谢、细胞周期相关蛋白、胁迫相关蛋白等。