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新生儿呼吸窘迫综合症(respiratory distress syndrome,RDS)是新生儿期常见危重症之一,有较高的发病率和病死率,严重影响早产新生儿的生存质量及预后,其发生发展的关键环节是由于肺表面活性物(pulmonary surfactant,PS)的相对或绝对不足。PS由Ⅱ型肺泡上皮细胞(AECⅡ)合成与分泌的,其作用为降低肺表面张力、增加肺的顺应性,从而维持肺泡完整性。本论文主要目的是研究新生儿呼吸窘迫综合症的发生机制,探索PS的合成过程,并期望为该疾病的防治及药物研发提供重要干预靶点。文献表明,PS的合成及分泌受到多种因素的影响与调节,其中,MicroRNAs(miRNAs)的作用越来越受到关注。miRNA-26a(miR-26a)是本课题组在前期研究中选用孕晚期胎鼠肺组织,利用芯片技术筛选出的差异表达miRNA。随后对miR-26a进行系统的生物信息学分析,发现其潜在靶基因SMAD1与肺发育密切相关。SMAD1是骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic protein,BMP)通路下游的一个重要信号分子,文献表明,胚胎肺发育的关键步骤几乎都受到BMP调控。我们课题组前期研究中将miR-26a过表达后,发现SMAD1基因的表达下调,大鼠胎肺AECⅡ合成PS也明显减少。因此,我们推测miR-26a在肺发育、RDS中发挥重要作用。miR-26a在PS合成的功能和机制方面的研究报道甚少。为探索miR-26a合成PS的信号通路,我们首先通过pmirGLO-SMAD1 3’端非翻译区(UTR)双荧光素酶报告基因(DLR)表达系统,验证SMAD1是miR-26a的靶基因;其次,构建过表达及沉默SMAD1的慢病毒载体,感染A549细胞,利用Real-time PCR分析SMAD1、PS mRNA的表达量,结果发现过表达SMAD1后SP-A、SP-B mRNA的表达量显著增加,而沉默SMAD1后SP-A、SP-B mRNA的表达量则显著减少。以上结果提示miR-26a通过靶向SMAD1参与调节PS的合成过程。另外,为了研究miR-26a体内的生物学功能,我们使用聚类规则间隔短回文重复/相关蛋白 9(CRISPR/Cas9)系统成功获得了基因双敲除小鼠(miR-26a-1-/-/miR-36a-2-/-)纯合子后代,然后通过与野生型小鼠对比,利用实时定量PCR检测各组织器官中miR-26a的表达水平,以及肺组织中PS的mRNA水平。此外,利用苏木精-伊红和免疫组织化学染色分析肺组织中的AECⅡ数量和PS的合成情况,结果发现体内miR-26a敲除后,肺组织AECⅡ细胞增多,且合成PS增多。以上结果提示miR-26a在体内AECⅡ合成PS的过程中起着重要作用。第一部分 miRNA-26a靶向SMAD1调节A549细胞合成PS的研究目的:1.验证SMAD1为miRNA-26a的靶基因2.探索miRNA-26a通过SMAD1影响PS合成的信号通路机制方法:1.体外获得hsa-miR-26a与SMAD1 3’UTR结合序列,与pmirGLO载体质粒重组,获得pmirGLO-SMAD1 3’UTR双荧光素酶报告基因(DLR)表达系统,将不同的表达质粒分别与Hsa-miR-26a-5p mimics共转染HEK293T细胞,然后检测各处理组的萤火虫荧光素酶活性值(Firefly luciferase)与海肾荧光素酶活性值(Renilla luciferase),计算并分析相对荧光素酶活性比值(Ff/Rn)。2.将构建的过表达、沉默SMAD1慢病毒及病毒空载体分别感染A549细胞,于72小时后,通过提取总RNA并利用Real-time PCR检测SMAD1、PS的mRNA表达水平。结果:1.pmirGLO-SMAD1 wt与Hsa-miR-26a-5p mimics共转染组的相对荧光值较其他两组明显降低,这表明miR-26a与SMAD1 3’UTR区结合,可以有效减少相对荧光值Ff/Rn荧光素酶活性。2.①感染72小时后,高达95%的细胞有绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的阳性表达。②通过real-time PCR 检测 SMAD1、SP-A、SP-B mRNA 的表达情况,结果证明成功获得过表达/沉默SMAD1的A549细胞株;过表达SMAD1组的A549细胞相较于对照组SP-A、SP-B mRNA的表达量均增加;沉默SMAD1组的A549细胞与对照组相比,SP-A、SP-B mRNA的表达量均减少。结论:1.SMAD1为miR-26a的靶基因。2.miR-26a通过靶基因SMAD1影响PS的合成。第二部分 miRNA-26a敲除小鼠体内PS合成的研究目的:研究miR-26a敲除小鼠肺内PS的合成情况,为进行体内miRNA-26a对肺发育影响的研究提供一些依据。方法:使用CRISPR/Cas9系统基因组编辑技术,成功获得miR-26a-1-/-/miR-26a-2-/-双敲除小鼠模型。通过与野生型小鼠对比,利用real-time PCR检测基因敲除小鼠各组织器官中miR-26a的表达水平,以及肺表面活性物质相关蛋白的mRNA表达水平。另外,通过苏木精-伊红(hematoxylin-euphorbia,HE)染色和免疫组织化学(immunochemistry,IHC)分析肺组织中的AECⅡ细胞和肺表面活性物质相关蛋白的表达情况。结果:①成功获得miR-26a-1/miR-26a-2双敲除小鼠的纯合子品系;测序结果示:敲除片段大于3bp,并且miR-26a-1和miR-26a-2同时被敲除;②Real-time PCR检测发现,与野生型小鼠相比,miR-26a敲除小鼠各组织中miR-26a表达水平均明显下降,以肺组织下降最显著,然而,miR-26a敲除小鼠肺组织的SP-A、SP-B mRNA的表达增加;③与野生型小鼠相比,HE染色和IHC分析都表明:miR-26a敲除小鼠肺组织内的AECⅡ细胞数目明显增多,而IHC分析还发现敲除小鼠肺表面活性物质相关蛋白的表达也明显增多。结论:敲除miRNA-26a后AECⅡ细胞增多,且合成PS增多,这表明体内miRNA-26a在AECⅡ细胞合成PS过程中发挥着重要的作用。