脂肪肉瘤是成人较常见的一类软组织肿瘤,其发病率居软组织肉瘤的第二位。最常发生于下肢和腹膜后等部位,也可发生在肝脏。手术切除是治疗脂肪肉瘤的主要方式,近三十年来在改善复发性或转移性脂肪肉瘤的存活率上未取得重大进展。可见,迫切需要制订新的治疗方案来改善患者的预后,寻找新的靶向疗法将成为提高脂肪肉瘤患者生存率的关键,分子生物学上的新发现可能为脂肪肉瘤的治疗打开崭新的大门。致癌蛋白激酶和其特异性的小分子抑制剂的发现彻底革新了癌症治疗的理念。对蛋白激酶在肿瘤细胞中的功能和作为药物靶点的研究已经取得了显著的进展,在过去的十年中,已证明蛋白激酶靶向疗法可有效地治疗多种癌症。已有研究发现在脂肪肉瘤中几种蛋白激酶过表达或者表达上调,然而,大多数蛋白激酶在脂肪肉瘤细胞生长中的作用仍然是未知的,脂肪肉瘤中其它高表达和活化的蛋白激酶能否以类似的方式作为药物靶向治疗的靶点需要进一步的实验来研究。作为一组丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)是细胞周期调控中的重要因子,和周期蛋白(cyclin)协同作用,在细胞生长、增殖和凋亡中起重要调控作用,因此CDKs抑制剂能否作为一种新的抗癌药物已受到广大学者的关注。目前,尽管CDKs抑制剂未被批准作为一种抗癌药物,但是据报道已有几种CDKs抑制剂进入治疗各种癌症的临床试验。这些正在进行的临床试验将促进更多有潜力的以CDKs为基础的抗癌药物的出现。CDK11(又名PITSLRE或CDC2L1)是p34cdc2相关激酶家族的一个成员。真核细胞中至少有10种CDK11亚型,有报道指出CDK11的功能与转录和RNA剪切有关。CDK11在各种肿瘤细胞系广泛表达并贯穿细胞周期各个阶段。在本课题组的前期研究中,我们通过人类多种蛋白激酶的shRNA慢病毒载体在骨肉瘤细胞株中对靶向激酶基因进行筛选,发现CDK11基因表达水平的下调有抑制细胞生长的效应。前期研究结果还显示在体内和体外实验中CDK11基因下调均可导致骨肉瘤细胞生长受到抑制,并且可诱导细胞凋亡,但其在脂肪肉瘤细胞中的作用仍然未知。为了探讨CDK11对脂肪肉瘤细胞的生长有无调控作用,本课题分为三部分进行研究,首先通过组织芯片与免疫组化技术相结合来比较CDK1l在脂肪肉瘤和良性脂肪瘤中的表达情况有无差异,并评估CDK11的表达水平和脂肪肉瘤患者预后之间有无联系,初步评价脂肪肉瘤组织中CDK11异常表达的临床意义。此外,采用RNA干扰技术对CDK11在脂肪肉瘤细胞生长和增殖中的调控作用进行评估,探讨其异常表达与脂肪肉瘤细胞生物学行为的关系,并对其可能的作用机制进行初步研究。最后进一步分析研究脂肪肉瘤细胞中CDK11蛋白表达水平的下调对化疗药物毒性作用的影响,分析CDK11 siRNA与多柔比星两者联合对细胞增殖能力的影响。第一部分 CDK11在脂肪肉瘤和良性脂肪瘤中的表达差异及意义背景及目的蛋白激酶在调节肿瘤细胞功能方面扮演了重要的角色,其在多种癌症中往往又是高表达或者处于活化状态,因此它们成为可以引起癌症发生的致癌基因,已证明蛋白激酶靶向疗法可有效地治疗多种癌症。为了研究CDK11对脂肪肉瘤细胞的生长有无类似其它蛋白激酶的那种调控作用,首先需要验证CDK11在脂肪肉瘤组织中的表达水平是否高表达,在本课题中,以脂肪瘤作为对照组,比较CDK11在脂肪肉瘤和良性脂肪瘤中表达水平的差异,并评估CDK11的表达水平与脂肪肉瘤患者的预后之间的关系,初步探讨脂肪肉瘤组织中CDK11异常表达的临床意义。研究方法1.为了比较CDK11在良性脂肪瘤和脂肪肉瘤组织中的表达差异,通过免疫组织化学方法分析脂肪瘤和脂肪肉瘤组织芯片中CDK11的表达含量及其定位。2.对组织芯片中高表达和低表达CDK11患者的生存时间进行Kaplan-Meier生存分析,并对脂肪肉瘤组织中死亡组和存活组CDK11的表达水平进行比较,以评估CDK11的表达水平与脂肪肉瘤患者预后之间的关系。结果1.脂肪肉瘤组织中的CDK11蛋白表达水平(2.6±0.20)明显高于脂肪瘤组织(0.56±0.18)。高表达的CDK11(CDK11评分≥3)可见于58.5%的脂肪肉瘤,而脂肪瘤组织未见高表达的CDK11,这提示CDK11在脂肪肉瘤的生长中可能发挥着重要作用。此外,在41个脂肪肉瘤样本中,38(92.7%)个样本表现为CDK11阳性,然而在脂肪瘤中,这一比例为55.6%。结果还表明,CDK11蛋白质主要定位在脂肪肉瘤细胞核。2.通过Kaplan-Meier生存分析,脂肪瘤和脂肪肉瘤组之间的生存时间有明显差异,但是CDK11的表达水平与脂肪肉瘤患者的生存时间无明显关系,脂肪肉瘤组织中CDK11高表达组(≥3)和低表达组(≤2)两组生存时间的差异没有统计学意义。将41例脂肪肉瘤组织分为死亡组和存活组,t检验比较两组之间的CDK11的表达水平,结果发现CDK11的表达水平在两组之间的差异没有统计学差异(P>0.05)。这些结果均表明CDK11的表达水平与脂肪肉瘤患者的预后无明显关系。结论1.脂肪肉瘤组织中的CDK11蛋白表达水平明显高于脂肪瘤组织,本研究证实CDK11在脂肪肉瘤组织中高表达,这提示CDK11在脂肪肉瘤的生长增殖中发挥重要作用,并参与脂肪肉瘤的发生发展过程。2.在CDK11高表达与预后相关性研究中并未得到与其它蛋白激酶相一致的结果,CDK11的高表达与脂肪肉瘤患者的预后无明显关系,这可能与组织芯片中脂肪肉瘤患者的样本量较少有关,需增加实验的样本数进一步进行研究和分析。第二部分CDK11在脂肪肉瘤细胞生长中的调控作用及其机制背景及目的作为一组丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)是细胞周期调控中的重要因子,和周期蛋白(cyclin)协同作用,在细胞生长、增殖和凋亡中起重要调控作用。本部分中,采用RNA干扰技术对CDK11在脂肪肉瘤细胞生长和增殖中的调控作用进行评估,探讨其异常表达与脂肪肉瘤细胞生物学行为的关系,并对其可能的作用机制进行初步研究。研究方法1.为了评估CDK11在脂肪肉瘤细胞生长中的功能,体外培养两种脂肪肉瘤细胞系SW872和SW982,人工合成的CDK11 siRNA转染脂肪肉瘤细胞并观察细胞的生长和增殖能力,非特异siRNA作为阴性对照。最终细胞的存活能力用MTT的方法来检测,Western blotting来验证CDK11 siRNA的干扰效率。2.为进一步分析CDK11基因下调对脂肪肉瘤细胞生长的长期影响,五个不同序列的CDK11 shRNA慢病毒载体转染脂肪肉瘤细胞SW982并观察细胞的生长和增殖能力。CDK11 shRNA慢病毒载体稳定转染脂肪肉瘤细胞株建成后,收集所有细胞并计数以此来分析细胞的增殖能力。3.通过细胞免疫荧光试验,进一步评估CDK11对脂肪肉瘤细胞生长的影响和CDK11的细胞定位。4.为研究CDK11抑制肿瘤细胞生长的分子机制,CDK11 siRNA转染脂肪肉瘤细胞后用Western blotting来分析多种凋亡相关蛋白(MCL-1、Bcl-XL、Bax, Survivin、Cytochrome C和Cyclin D1),并通过软件Odyssey 3.0来进行蛋白相对表达定量分析。结果1.40nmol/L的CDK11 siRNA以时间依赖性的方式明显抑制脂肪肉瘤细胞的生长和增殖,伴随着CDK11蛋白表达水平明显下调。另外,CDK11 siRNA转染脂肪肉瘤细胞后,还以剂量依赖性的方式抑制细胞的生长和增殖。Western blotting证实CDK11 siRNA对细胞呈剂量依赖性的生长抑制伴随着CDK11蛋白表达水平的逐渐降低。2.与正常对照组、非特异shRNA慢病毒载体和空载转染组相比,CDK11shRNA慢病毒载体转染可显著降低脂肪肉瘤的细胞生长和增殖能力。结果表明,CDK11shRNA(TRCN0000006208)对脂肪肉瘤细胞生长的抑制率为66.7%,而其它四种CDK11shRNA的抑制率高达90-100%。3.与脂肪肉瘤组织芯片的结果一致,细胞免疫荧光结果同样显示,CDK11蛋白主要定位于脂肪肉瘤细胞的细胞核。与正常对照组和非特异siRNA转染组相比,CDK11 siRNA转染组中的脂肪肉瘤细胞CDK11(绿色荧光)的表达水平下降,而且细胞的生长和增殖受到抑制(CDK11 siRNA转染组中红色荧光内参蛋白和蓝色荧光细胞核明显减弱)。4.脂肪肉瘤细胞转染CDK11 siRNA后CDK11蛋白表达水平下降,同时伴有两个抗凋亡相关蛋白(Cyclin D1和Survivin)表达水平明显降低。此外,另外一种抗凋亡相关蛋白Cytochrome C在CDK11 siRNA转染SW872细胞后表达水平也下降。以上结果表明,CDK11基因下调对脂肪肉瘤细胞生长的抑制作用是通过下调抗凋亡相关蛋白Cyclin D1和Survivin来实现的。结论1.为了评估CDK11在脂肪肉瘤细胞生长中的调控作用,人工合成的CDK11 siRNA和CDK11 shRNA慢病毒载体转染两种脂肪肉瘤细胞系SW872和SW982中,结果发现CDK11基因下调可明显抑制脂肪肉瘤细胞的生长和增殖,这些结果均证实CDK11在恶性脂肪肉瘤的生长增殖过程中发挥重要调控作用。2.在CDK11抑制肿瘤细胞生长的分子机制研究中发现,CDK11基因下调对脂肪肉瘤细胞生长的抑制作用是通过下调抗凋亡相关蛋白Cyclin D1和Survivin表达水平来实现的。换言之,CDK11基因通过促进抗凋亡相关蛋白Cyclin Dl和Survivin表达来抑制凋亡,从而参与了脂肪肉瘤细胞的发生发展以及生长增殖过程。3.CDK11对脂肪肉瘤来说是一个很有前途的治疗靶点,有望成为脂肪肉瘤基因治疗的候选靶点,CDK11抑制剂可能是一种有潜力的新型抗癌药物。第三部分 CDK11表达水平下调增强多柔比星的细胞毒性作用背景及目的多柔比星是一种抗肿瘤抗生素,对多种肿瘤均有作用,其作用机理主要是嵌入DNA而抑制核酸的合成,多柔比星单独或联合异环磷酰胺是治疗高复发或转移性脂肪肉瘤的一线用药。CDKs抑制剂作为抗癌药物的潜力已受到广泛关注,目前已有几种CDKs抑制剂进入临床试验,CDKs抑制剂和化疗药物联合用药的效果已有很多学者进行探讨。CDKs的广谱抑制剂flavopiridol和多柔比星或其它化疗药物联合用药在治疗多种癌症的临床实验中均得到较好的临床效果。CDK11抑制剂具有作为一种新的抗癌药物的潜力,但目前尚无CDK11的特异性抑制剂,故选择CDK11 siRNA与多柔比星两者联合作为研究对象,本部分探讨CDK11 siRNA与多柔比星两者联合对细胞增殖能力的影响,进一步研究脂肪肉瘤细胞中CDK11蛋白表达水平下调对化疗药物多柔比星细胞毒性作用的影响。研究方法为确定脂肪肉瘤细胞中CDK11蛋白表达水平的下调对化疗药物细胞毒性作用的影响,脂肪肉瘤细胞SW872和SW982转染CDK11 siRNA后加入化疗药物多柔比星,MTT法分析CDK11 siRNA与多柔比星两者联合对细胞增殖能力的影响。结果SW872和SW982分别选择浓度为5 nM和10 nM的CDK11 siRNA,这个浓度下的siRNA对脂肪肉瘤细胞的生长抑制率约为30%。Western blotting结果证实此浓度下的siRNA明显下调CDK11的表达水平。与单一治疗相比,CDK11siRNA和多柔比星的联合应用可显著抑制脂肪肉瘤细胞的生长和增殖。可见CDK11基因下调增强了多柔比星对脂肪肉瘤细胞的毒性作用。结论为评估脂肪肉瘤细胞中CDKl 1基因下调对化疗药物细胞毒性作用的影响,脂肪肉瘤细胞SW872和SW982转染CDK11 siRNA后加入化疗药物多柔比星,结果发现CDK11基因下调能增强化疗药物多柔比星的细胞毒性作用,这提示CDK11抑制剂能够增强肿瘤化疗药物的疗效,故其可用于化疗药物的辅助或联合用药,CDK11抑制剂和化疗药物联合用药有可能成为一种治疗癌症的新策略。全文结论1.CDK11高表达与恶性脂肪肉瘤的发生发展以及生长增殖密切相关,CDK11基因下调可明显抑制脂肪肉瘤细胞的生长和增殖,CDK11在恶性脂肪肉瘤的生长增殖过程中发挥着重要调控作用。2.CDK11基因下调能够通过下调抗凋亡相关蛋白Cyclin D1和Survivin表达水平,从而抑制脂肪肉瘤细胞的生长和增殖；换言之,CDK11基因通过促进抗凋亡相关蛋白表达来抑制凋亡,从而参与了脂肪肉瘤细胞的发生发展以及生长增殖过程。3.CDK11基因下调能增强化疗药物多柔比星的细胞毒性作用,这提示CDK11抑制剂能够增强肿瘤化疗药物的疗效,故其可作为化疗药物的辅助或联合用药,CDK11抑制剂和化疗药物联合用药有可能成为一种治疗癌症的新策略。4.CDK11对脂肪肉瘤来说是一个很有前途的治疗靶点,有望成为脂肪肉瘤基因治疗的候选靶点,CDK11抑制剂可能是一种有潜力的新型抗癌药物。