【摘 要】
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酒精性肝损伤（Alcoholic liver disease,ALD）是由于长期大量的饮酒导致的一种进行性肝脏损伤疾病,严重危害着人类身体健康甚至生命,已成为世界性的疾病。已有研究表明,蜂花粉中丰富的酚类物质,能一定程度上干预和治疗肝损伤疾病。本课题以五味子、油菜和水飞蓟蜂花粉为材料,首先采用乙醇超声辅助提取、大孔树脂富集,分离得到各蜂花粉中的不同组成的酚类物质,通过多种体外抗氧化模型评估比较粗提
【基金项目】
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中央高校基本科研业务费专项资金资助项目（NO: 2662015QD033）; 武汉市蜂产品质量控制工程技术研究中心项目（NO: 2016020605111000）; 武汉市委组织部第五批“黄鹤英才计划”项目; 洪山区校企合作产学研基地建设项目
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酒精性肝损伤（Alcoholic liver disease,ALD）是由于长期大量的饮酒导致的一种进行性肝脏损伤疾病,严重危害着人类身体健康甚至生命,已成为世界性的疾病。已有研究表明,蜂花粉中丰富的酚类物质,能一定程度上干预和治疗肝损伤疾病。本课题以五味子、油菜和水飞蓟蜂花粉为材料,首先采用乙醇超声辅助提取、大孔树脂富集,分离得到各蜂花粉中的不同组成的酚类物质,通过多种体外抗氧化模型评估比较粗提物及其各组分的抗氧化活性,筛选出抗氧化活性较强的蜂花粉酚类物质组分,并建立酒精诱导Hep G2细胞氧化应激损伤模型,将抗氧化活性较强的蜂花粉酚类物质组分对酒精性损伤细胞进行预处理,初步评价蜂花粉酚类物质的抗氧化应激作用,研究其对酒精性肝细胞损伤的保护作用。本文主要研究内容和实验结果如下:1.三种蜂花粉酚类物质的提取富集及成分分析80%乙醇/水超声辅助提取五味子、油菜和水飞蓟蜂花粉中酚类物质得到粗提物,通过AB-8型大孔树脂吸附结合不同比例乙醇/水洗脱分离三种蜂花粉粗提物而分别得到5个洗脱组分,通过高效液相色谱法（HPLC）对其富集、分离效果进行初步评估,并采用比色法测定各粗提物及其各洗脱组分的总酚、总黄酮含量,结果显示,五味子、油菜和水飞蓟蜂花粉粗提物的总酚含量分别为2.54 g/100g、6.93 g/100g、0.41 g/100g,总黄酮含量分别为3.35 g/100g、2.74 g/100g、1.95 g/100g,AB-8型大孔树脂对蜂花粉酚类物质具有较好的富集效果,尤其是对五味子蜂花粉中酚类物质富集效果较好,总酚含量范围在1.23～46.04 g/100g,其中40%和60%乙醇/水洗脱组分的总酚含量较高,分别是46.04 g/100g和43.69 g/100g,是粗提物的13倍左右,总黄酮含量范围在0.44～6.39 g/100g,40%和60%乙醇/水洗脱组分总黄酮含量分别是6.39 g/100g和5.55 g/100g,是粗提物的2.5倍左右;油菜蜂花粉各组分中,总酚含量范围在2.93～38.07 g/100g,总黄酮含量范围在0.53～7.08 g/100g,其中40%和60%乙醇/水富集效果较好,总酚含量分别为粗提物的9倍和14倍;水飞蓟蜂花粉各组分中,总酚含量范围在1.84～11.19 g/100g,总黄酮含量范围在0.35～1.67 g/100g,其中40%乙醇/水富集效果较好,总酚含量分别为粗提物的11倍。2.三种蜂花粉酚类物质抗氧化活性评价通过1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）、2,2’-联氮-双-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐自由基（ABTS+）清除能力、还原力和抗脂质过氧化等体外抗氧化模型,研究五味子、油菜和水飞蓟蜂花粉粗提物及其各分离组分的抗氧化活性。发现五味子蜂花粉抗氧化活性整体上优于油菜和水飞蓟蜂花粉,其中五味子蜂花粉粗提物、40%和60%乙醇/水洗脱组分具有较强的体外抗氧化活性,半抑制浓度(IC50值)表明,粗提物清除DPPH·、ABTS+等自由基能力最强,IC50值分别为4.32μg/m L和10.71μg/m L;还原力结果表明,粗提物和40%乙醇/水洗脱组分高于其他组分,200μg/m L浓度下,还原能力是其他组分的2～3倍;40%和60%乙醇洗脱组分抗脂质过氧化能力较强,IC50值分别为2.09μg/m L和6.05μg/m L。油菜和水飞蓟蜂花粉粗提物和分离组分也具有不同程度的抗氧化活性,但整体上弱于五味子蜂花粉。根据体外抗氧化活性的评估比较,五味子蜂花粉具有较强的抗氧化活性,因此选择五味子蜂花粉粗提物、40%、60%和80%乙醇/水洗脱组分进一步研究五味子蜂花粉酚类物质对氧化应激诱导肝损伤的保护作用。3.五味子蜂花粉酚类物质对酒精诱导肝细胞损伤的保护效果建立酒精诱导Hep G2细胞损伤模型,筛选出合适的样品作用浓度,运用谷草转氨酶/谷丙转氨酶（AST/ALT）、还原性谷胱甘肽（GSH）、超氧化歧化酶（SOD）、活性氧簇（ROS）等不同活性指标的检测初步评价五味子蜂花粉粗提物、40%、60%和80%乙醇/水洗脱组分对酒精性肝细胞损伤的保护作用。实验结果表明,Hep G2细胞经500 m M酒精处理24 h后,模型组细胞抗氧化系统受到影响,GSH耗竭,SOD酶活性下降,自由基清除能力下降,导致细胞内ROS含量上升,细胞损伤。而经40%和80%乙醇洗脱组分（0.5～20μg/m L）以及粗提物和60%乙醇洗脱组分（25～100μg/m L）预处理后,均能够减轻酒精引起的Hep G2细胞损伤,且呈现一定的剂量效应,酒精引起的细胞活力下降的情况有所改善,能有效缓解酒精引起的细胞AST/ALT的释放和GSH的损耗,提高SOD的活性,降低酒精诱导的ROS的产生,减轻了肝细胞的脂质过氧化水平,增强细胞内抗氧化体系活力,降低氧化应激导致的肝细胞损伤,说明五味子蜂花粉酚类物质对酒精性肝细胞损伤有良好的保护作用。
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